שילוב הסעות-Box הדרכה עם אלקטרו Cortex הקלטה וגירוי ככלי לחקר תפיסה ולמידה

למידת הימנעות הסעות-תיבה-מבוססת היטב במדעי המוח התנהגותיים. פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן לשלב הסעות תיבה לומדת במכרסמים עם microstimulation אתר ספציפי החשמלי intracortical (ICMS) ובו זמנית בchronical הקלטות vivo ככלי ללמוד היבטים רבים של למידה ותפיסה.

למידת הימנעות הסעות תיבה היא שיטה מבוססת היטב בהגדרות מדעי מוח והתנהגות ניסיוניות היתה באופן מסורתי מותאמת אישית; הציוד הדרוש זמין כעת על ידי כמה חברות מסחריות. פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט של הפרדיגמה למידת הימנעות תיבת הסעות דו-כיוונית במכרסמים (גרבילים כאן מונגולי; מריון unguiculatus) בשילוב עם microstimulation אתר ספציפי החשמלי intracortical (ICMS) ואלקטרו בvivo הקלטות chronical בו זמנית. הפרוטוקול מפורט ישים ללמוד היבטים רבים של למידת התנהגות ותפיסה במינים שונים של מכרסמים.

ICMS אתר ספציפי של מעגלים בקליפת המוח שמיעתיים כגירויים מותנים כאן משמש ככלי כדי לבדוק את הרלוונטיות של תפיסתי מביא ספציפי, efferent וקשרי intracortical. ניתן עוררו דפוסי הפעלה נפרדים על ידי שימוש באלקטרודה לגירוי עיבוד שונהays לICMS המקומי, שכבה תלויה או אתרי ICMS רחוקים. ניצול ניתוח זיהוי אותות התנהגותיים ניתן לקבוע אותו שאסטרטגית גירוי היא יעילה ביותר לגילוי אות התנהגותית לזיהוי ובולט. יתר על כן, רבות ערוצים-הקלטות מקבילות באמצעות עיצובים שונים אלקטרודה (אלקטרודות משטח, אלקטרודות עומק, וכו ') לאפשר לחקירת observables העצבי במהלך תהליכי למידה כגון הזמן. זה יידון כיצד שינויים של עיצוב ההתנהגות יכולים להגדיל את המורכבות קוגניטיבית (למשל זיהוי, אפליה, למידת היפוך).

מטרה בסיסית של מדעי מוח התנהגות היא להקים קישורים ספציפיים בין מאפיינים עצביים מבניים ותפקודיים, למידה, ותפיסה. פעילות עצבית הקשורים בתפיסה ולמידה ניתן ללמוד על ידי הקלטת אלקטרו של פוטנציאל פעולה ופוטנציאלים שדה מקומיים במבני מוח שונים באתרים מרובים. בעוד קלטות אלקטרו לספק עמותות מתאם בין פעילות והתנהגות עצביות, microstimulation הישיר החשמלי intracortical (ICMS) במשך יותר ממאה הייתה השיטה הישירה ביותר לקשרים סיבתיים בדיקה של אוכלוסיות נרגשות של נוירונים והשפעות ההתנהגות והתפיסה שלהם ^{1 - 3.} מחקרים רבים הראו כי בעלי החיים יכולים לעשות שימוש במאפייני מרחב ובזמן שונים של גירויים חשמליים במשימות תפיסתיות תלוי באתר הגירוי בתוך לretinotopic למשל ^4, Tonotopic ^5, או ⁶ somatotopic אזורים בקליפת המוח. התפשטות של פעילות חשמלית עוררה בקליפת המוח נקבעה בעיקר על ידי הפריסה של סיבי axonal והקישוריות שלהם מופצת הסינפטי ² ש, בקליפת המוח, היא באופן ברור שכבה תלויה ^7. הפעלת polysynaptic התוצאה שעוררה ICMS היא מעתה הרבה יותר נרחבת מאשר השפעות ישירות של ^2,8,9 שדה החשמלי. זה מסביר מדוע ספים של השפעות תפיסתי שהושרו על ידי microstimulation intracortical יכולים להיות מאוד שכבה תלויה ^8,10,11 ואתר-תלוי ^9. מחקר שנערך לאחרונה הראה בפירוט שהגירוי של שכבות העליונות הניב יותר הפעלה נרחבת של מעגלי corticocortical בשכבות בעיקר supragranular, תוך גירוי של שכבות עמוקות יותר של קליפת המוח בתוצאת corticoefferent מוקדי, חוזר ונשנה intracolumnar הפעלה. ניסויים התנהגותיים מקבילים גילו כי יש לו את זה האחרון thr זיהוי תפיסתי הרבה יותר נמוךesholds ^8. לכן, היתרון של גירויים מותנים כICMS אתר ספציפי נוצל בשילוב עם קלטות אלקטרו להתייחס סיבתי הפעלות מעגל קליפת המוח ספציפיות ⁸ למדדי התנהגותיים של למידה ותפיסה בתיבת ההסעות.

הפרדיגמה-תיבת הסעות דו-כיוונית היא מנגנון מעבדה מבוסס היטב ללמוד למידת הימנעות ^12. תיבת הסעות מורכבת של 2 תאים מופרדים במשוכה או פתח. גירוי מותנה (CS) שמיוצג על ידי אות מתאימה כמו אור או צליל, ואחריו מותנה בגירוי מרתיע הבלתי מותנה (ארה"ב), כמו למשל הלם רגל על רצפת רשת מתכת. נושאים יכולים ללמוד להימנע ארה"ב על ידי הלוך מתא-תיבת הסעות אחת לשנייה בתגובה למדעי המחשב. למידת הסעות תיבה כרוכה רצף של שלבי למידה להבחין ^13,14: ראשית,נושאים ללמוד לחזות את ארה"ב מCS על ידי התניה קלסית ולברוח מארה"ב על ידי אוויר אינסטרומנטלי, כמו ארה"ב נפסקת הלוך. בשלב הבא, נושאים ללמוד להימנע ארה"ב לגמרי על ידי הלוך בתגובה לCS לפני תחילת אמריקנית (תגובת הימנעות). בדרך כלל, למידת תיבת הסעות כרוכה התניה קלסית, אוויר אינסטרומנטלי, כמו גם מכוונת למטרת התנהגות בהתאם למידה שלב ^14.

הליך תיבת הסעות ניתן להגדיר בקלות ובאופן כללי מייצר התנהגות חזקה אחרי כמה אימונים יומיים ^15-17. בנוסף לאוויר פשוט הימנעות (זיהוי), תיבת ההסעות יכולה לשמש עוד ללמוד אפליית גירוי על ידי העסקת פרדיגמות ללכת / nogo. כאן, חיות מאומנות כדי למנוע את ארה"ב על ידי תגובה מותנית (CR) (ללכת התנהגות; הסעות לתא הפוך) בתגובה ל<ללכת גירוי חזק> (CS +) ועל ידי התנהגות nogo (להישאר בתא הנוכחי; אין CR) בתגובה לnogo-גירוי (CS-) microstimulation מקביל והקלטה של פעילות עצבית עם מערכי multielectrode צפיפות גבוהה מאפשר ללמוד. המנגנונים הפיסיולוגיים הבסיסיים למידה מוצלחת. פרטים טכניים כמה שהם יסוד לשילובים המוצלחים של הכשרה-תיבת הסעות, ICMS ואלקטרופיזיולוגיה המקבילה, יידונו.

כל הניסויים שהוצגו בעבודה זו בוצעו בהסכם עם הסטנדרטים האתיים שהוגדרו על ידי החוק הגרמני להגנה על חיות ניסוי. ניסויים אושרו על ידי ועדת האתיקה של המדינה סקסוניה-אנהלט.

1. מערכי אלקטרודה רב-ערוצי לMicrostimulation והקלטה מחוייט

1. מערך microstimulation מחוייט
   1. לאספקת ICMS, להכין אלקטרודות גירוי בעיצוב הרצוי מרחבית (כאן מערך רוחבי של 2 ערוצים) באמצעות חוטי נירוסטה 3 סנטימטר ארוך בידוד טפלון (O עם בידוד = 50 מיקרומטר). ראה איור 2.
   2. לחיצה קצה אחד של החוטים למערכת פין זכר (1.25 המגרש מ"מ).
   3. למערך 2 ערוצים עם ~ 0.5 מ"מ או ~ חוטים לעבור מרחק אלקטרודה 0.7 מ"מ בניצב באמצעות שתי רשתות מיושרות אנכי מיקרוסקופ אלקטרונים אובייקט בעל (מרחק של רשתות ~ 5 מ"מ) המנחים את החוטים (.1654 המגרש מ"מ).
   4. חוטים יחד עם דבק טיפה קטנה של אקריליק שיניים על 4 מ"מ מעל קצוות של החוטים שסופו של דבר לשמש טיפים אלקטרודה.
   5. שים סיכות זכר לדיור התקע.
   6. שים את האלקטרודה בצלחת עם פתרון אלקטרוליטי (למשל, נתרן כלורי 0.9%) ולמדוד את העכבה של כל ערוץ עם מכשיר מדידת עכבה המתאים (למשל., FHC עכבת אוויר מודול). מטרה בעכבות בטווח 100 עד 500 הק"ג-אוהם.
      1. אם העכבה היא גבוהה מדי, לספק נוכחית קצרה חשמלית (1 שניות, mA 1) דרך הערוצים להוריד אותו. בדוק עכבה שוב.
2. מערכי הקלטה רבות ערוצים ברזולוציה גבוהה מותאמים אישית
   הערה: פרוטוקול זה מתאר ייצור של מערכי משטח להקלטת electrocorticogram נתונים (ECOG). עם זאת, יכולים להיות מותאמים עיצובים כדי לענות על הדרישות של שאלת מחקר בהתאמה (הקלטות עומק, וכו '). מערכים רבי ערוצים ברזולוציה גבוהה הם builלא על ידי חוטי בידוד טפלון נירוסטה (O עם בידוד = 50 מיקרומטר) crimped למערכת פין זכר (1.25 המגרש מ"מ).
   1. למערכי אלקטרודה משטח, להדריך 18 חוטים דרך מטריצת 3 x 6 של שתי רשתות אובייקט בעל מיקרוסקופ אלקטרונים מוכנות.
   2. להטביע 6 x 3 ההסדר של החוטים בין הרשתות עם אקריליק שיניים ולשים סיכות בדיור התקע.
   3. טוחנים את אקריליק השיניים לגוש מלבני באמצעות מטחנה מחוברת לתרגיל שנערך ביד.
   4. בדוק עכבה של כל הערוצים (ראה 1.1.6) הוא בטווח שבין 100-500 ק"ג-אוהם.
   5. לפני ההשתלה (ראה 2 צעד) משטח לטחון של המערכים כדי להתאים את הקמירות של פני השטח של קליפת המוח.

2. השתלה כירורגית של מערכים לשמיעה Cortex בHerbils המונגולי מורדם לשימוש כרוני

1. החזק את האישור הרשמי לביצוע כל הצעדים הדרושים הניסיוניים שמתוכננים. ללבוש approבגדי priate מגן (מעיל, כפפות סטריליות, מסכת מנתחים, מכסה המנוע).
2. השתמש גרבילים בוגרים זכר מונגולי (מריון unguiculatus) או כל מיני מכרסמים אחרים. ללבוש כפפות ומעיל מגן ותמיד להשתמש בכלים כירורגיים מעוקרים וגם מזוהים.
3. במקרה של גרבילים, לטשטש חיות עם זריקת ip של תערובת של קטמין (100 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (5 מ"ג / קילוגרם) בדילול מלא 0.9% נתרן כלורי פתרון סטרילי. לשמור על ידי עירוי של 0.6 מיליליטר / שעה / קילוגרם של הלחנה תערובת של קטמין: xylazine: נתרן כלורי (0.9%) בשיעור של 9: 1: 10.
4. הנח חיה על צלחת חימום לשמירה על טמפרטורת גוף על 37 מעלות צלזיוס ידי מערכת משוב בדיקה רקטלית (למשל, עולם Precision מכשירים).
5. לגלח interoccipital פרווה מכסה, הקודקודית, ועצמות זמניות. הסביבה נקיה מחיידקים להכין את אתר החתך עם חומר חיטוי יעיל (לדוגמא., לסירוגין פולידין או Nolvasan ו -70% אלכוהול סקראבס 3 פעמים). Prעיני otect נגד ייבוש על ידי משחת עיניים.
6. חותך את עור הגולגולת מכסה את interoccipital, הקודקודית, ופרונטליים עצמות באמצעות אזמל ולהסיר בעדינות על ידי קרום עצם נע תרגיל על פני העצם.
7. לקדוח חורים קטנים בהקודקודית הנגדי ועצם קדמי רוחב ככל האפשר לא לעכב את הראש לאחר מכן הר. עכשיו לדפוק שני ברגי עצם בקוטר של כ 1 מ"מ בחוזקה לתוך החורים. ודא שיש לו את הבורג הקודקודית קשר טוב לדורה, כפי שהוא ישמש כנקודת התייחסות משותפת וקרקע, כמו גם אלקטרודה תמורה לגירוי חשמלי בהמשך.
8. דבק בר אלומיניום קטן מדיאלית על העצמות חזיתיות ולהשתמש בו כקיבעון ראש במהלך ההשתלה על ידי headholder.
9. להסיר עור מכסה את temporalis musculus במספריים באמצעות צד אחד.
10. חותך את החלק הגבי של השרירים זמניים כדי להשיג הודאה לעצם הטמפורלית.
11. לחשוף שמיעתית קליפה על ידי פתיחת גולגולת (~ 3 מ"מ x 4 מ"מ) שלהעצם הטמפורלית באמצעות מקדח שיניים. לזהות את מיקום של קליפת המוח השמיעתית המבוססת על חתימת דם-מוח-הכלי הטיפוסי ^18,19.
12. להפוך בזהירות חתך של הדורה עם אזמל מיקרו במיקום שבו האלקטרודה הגירוי היא מושתל במוח. בעדינות לנוע לאורך פני השטח עד דמעות הדורה לאסור נזק לneuropil הבסיסית.
13. הכנס מערך גירוי בשליטת micromanipulator. בחר זווית החדרה משיקה כדי לאפשר מערך אפידורל כדי להיות ממוקם מעל האזור של עניין. בהתאם לזווית החדרה ומיקום והאתר שהמטרה של גירוי, לשקול בזהירות את עומק ההחדרה.
14. הנח את מערך הקלטת משטח אפידורל עם קשר טוב למשטח המוח מכסה את האזור של עניין (כאן שמיעתית קליפה) על ידי micromanipulator שני. לדאוג שהמערך תואם את העקמומיות של קליפת המוח לא להכנסת הדורה.
15. לקבע שני מערכי אלקטרודה והתקע שלהםמעטה עם אקריליק שיניים לגולגולת.
16. כיסוי נחשף משטח קליפת המוח עם חומר סיכה חיטוי (למשל, KY-ג'לי) וקרובה פתיחת גולגולת עם אקריליק שיניים (לדוגמא, Paladur, Heraeus Ulzer). זכור כי פילמור יכול לייצר חום. השתמש בחומר סיכה מספיק בין neuropil ואקריליק שיניים כדי למנוע כל מגע של אקריליק השיניים ומשטח קליפת המוח, שכן הדבר עלול לגרום נזק לרקמות.
17. עכשיו לאפשר לבעלי החיים להתאושש לפני תחילת כל הליך נוסף. זמני התאוששות עשויים להיות שונים בין מינים (למשל, גרבילים: ≥3 ימים, עכברים: ≥7 ימים). לעקוב בקפידה את מצבו של בעל החיים ולתת טיפול במשככי כאבים בימים שלאחר אם רלוונטי (למשל, Meloxicam; 1 מ"ג / קילוגרם לאחר ניתוח ולאחר 24 שעות הניתוח).

3. עיצובי הסעות תיבה דו כיוונית באמצעות Stimulus אוויר כICMS

1. אימון הסעות תיבה
   1. מניחים קופסת הסעות (גustom-לבנות או כל מוצר מסחרי, למשל, E10-E15, Coulbourn מכשירים) בחדר מוגן אקוסטית וחשמלי. התיבה מכילה שני תאים מופרדים במשוכה. קחו למשל את גובה המכשול כפי שמשפיע על הנטייה התנהגותית של Go-תגובות. השתמש בגבהים מתאימים למינים ספציפיים (למשל, ~ 2 סנטימטר לעכברים, ~ 3 סנטימטר לגרבילים).
   2. כדי להחיל את הרגל-ההלם (ארה"ב), להשתמש ברצפת רשת עם מרחק בין הסורגים המתאימים למינים תחת חקירת ^12,15. תמיד דואג ששום דבר חשמלי קיצורי הברים הבודדים (צואה, שערות, אלקטרודה שמנת).
   3. לאחר זמן התאוששות ניכר של בעלי החיים (ראה 2.17), לחבר את הנושא לכבל ההקלטה וגירוי רצוי ללא שימוש בכל הרדמה לטווח קצר. נסה לכסות את בעלי החיים במגבת ובעדינות לקחת את החיה בידיים. לחשוף את הראש ומחברים של בעלי החיים ביד השנייה ולחבר את הכבלים.
   4. לאפשר חיות להרגיל לתא אימון 3 דקות לפני תחילת כל מפגש.
   5. לאימון (1 - 2 ביום) יחול בין 30-90 ניסויים. משך משפט שימוש של עד 15 שניות, ומרווחים בין משפט המשתנים באופן אקראי בין 25 - 30 שניות.
   6. לאספקת ICMS לגירוי מותנה לגירוי אלקטרודות להשתמש ממריץ רב-ערוצי (לדוגמא, MCS STG2000). כדי להשיג אפקטי התנהגות מבלי לפגוע ברקמת המוח, תחול רכבות דופק (למשל, אורך 300 אלפיות, 100 PPS) של קטניות biphasic, פריצה-מאוזנת (קתודית הראשון) עם משך שלב 200 מייקרו-שני. חזור על רכבות עם הפסקה של 700 אלפיות עבור משך 4 שניות (חלון תצפית).
   7. להצגת CS השמיעתי להשתמש לוח יציאה אנלוגית PCI (למשל, PCI-6733 NI). לתכנת מכשירים אלה עם Matlab לשלוט בגמישות וחומרה-יפעיל את מערכת תיבת הסעות באמצעות קווי יציאה הדיגיטליים.
   8. כביש אות הפלט האנלוגית הרמקולי תיבת דואר הסעות באמצעות מגבר אודיו.
   9. תנאים לספק למרגלות-לזעזע אותנו דרך רצפת רשת. לקבלת איכות הקלטת אלקטרו אופטימלית, ליצור ההלם על ידי ממריץ רב ערוצי high-end שני (MCS STG2000).
   10. כדי להחיל אימון זיהוי נוכחי רק גירויים + CS. כאן, ניסויים ריקים הווה מבלי CS וארה"ב וביניהם בין ניסויי מבחן (~ 10%) כדי לתקן את התנהגות מוטה הסעות (ראה 3.2). למשימה תובענית יותר, לאמן את החיות להפלות בין CS + והגירויים CS- מוצגים באותו המושב על מנת אקראי.
   11. לסווג שינוי תא לאחר תחילת CS + בתוך חלון זמן קריטי של 4 שניות (CR) כתגובה ללהיט. בניסויים + CS ללא CR בחלון הקריטי הזמן (מיס), לספק מייד הלם רגל מתון במשך 6 עד 10 שניות כגירוי מותנה (ארה"ב).
       הערה: גירוי CS + חוזר על עצמו, שחופף עם ארה"ב תפחית את המאמץ למידה לבעלי החייםnd לשפר את מהירות למידה וביצועים ("עיכוב" לעומת אוויר "עקבות", ראה דיון).
   12. לניסויי CS-, לסווג שינוי תא בתוך חלון הזמן הקריטי תגובת אזעקת שווא, ולהחיל את ארה"ב לתקופה של עד 10 שניות מייד לאחר CR בלתי הולם זו. אין ליישם בארה"ב לאחר CS- כאשר החיה נשארת בתא (לא CR) במהלך חלון הזמן הקריטי, ולסווג משפט זה דחייה נכונה.
       הערה: חשוב לציין, למרגלות לזעזע אותנו תמיד כבויה, כאשר בעלי החיים משנים את התא בתגובה לזה (בריחה). להשתמש ב- Windows זמן קריטי יותר לניסויי CS-, למשל, אם גירוי מותנה חוזר משמש, אם כי זה יהיה להטיל קריטריון למידה שמרני יותר כפי שהוא מקנה מאמץ גבוה יותר על ידי בעלי החיים כדי לעכב את CR.
   13. לעמותה אפקטיבית של CS וארה"ב להתאים את כוח הלם בטווח בינוני כדי להיות מרתיע, אך לא כואב. initia האופטימליכוח הנוכחי l שונה בין מינים (למשל, 50 מיקרו-אמפר לעכברים, 200 מיקרו-אמפר לגרבילים). לכן, אנא ראה את שני הכדורים הבאים לפרטים טכניים נוספים:
       1. בנפרד להתאים את כוח ההלם באימון הראשון מתחילה עם אמפליטודות קלות (~ 200 מיקרו-אמפר לגרבילים). אם כוח הלם רגלו נמוכה מדי, לברוח להתעצבן ועמותת שיהוי בין CS וארה"ב הוא לא אופטימלי.
       2. תמיד לשים לב אם בעלי החיים מתחילים להשמיע ולהקפיא בתגובה למדעי המחשב. בכוח footshock מקרה זה הוא גבוה מדי. תגובת פחד מותנה זה מפריעה ללמידת הימנעות.
   14. לקבוע בזהירות את שיהוי הבריחה. להגדיל את כוח הלם רגל צעד-אחר-צעד, אם שיהוי בריחה הוא יותר מ 2 שניות לאחר 20 הניסויים הראשונים. בדקו אחרי כל אימון אם בעל החיים נמצאים בשליטת הלם, כלומר, זה מראה לברוח שיהוי ניכר מתחת ל -2 שניות.
       הערה: עם זאת, להימנע מלהגדיל את הרגללזעזע כוח מהר מדי, כאסטרטגיה ההתנהגות של חיה מאוד הדגישה יכולה ליפול בחזרה לתגובות בריחה טהורות. לכן להתבונן מקרוב את ההתנהגות ובמיוחד שיהוי התגובה תוך התאמה משרעת של ארה"ב. לדוגמא לראות 3E איור.
   15. אם בעלי החיים מראה את CR, להפסיק הצגת CS מייד. זה חיוני לחיזוק תגובת ההימנעות.
   16. אם בעלי החיים שרכשו אסטרטגית הימנעות, כלומר, תציג CR המתאים לכל CS, להשתנות פרמטרים (משרעת ICMS, משך שלב, שיעור החזרה וכו ') לבצע ניתוחים פסיכומטריים. החל הווריאציה CS פרמטרית באופנת blockwise עם זיווג ארה"ב, אשר עם זאת יגרום ללמידה והסתגלות.
       1. כדי להימנע מכך, להתחיל עם 15 עד 30 ניסויים של האימונים המקוריים, ולאחר מכן באופן אקראי לפזר וריאציות CS בלי ארה"ב כניסויי מבחן בין ניסויי אימונים הרגילים עם CS של מקורי. מקסימאלי use 25% מניסויי מבחן.
   17. לאחר האימון להסיר את החיה מחדר האימונים ולנקות את התיבה המלאה בזהירות לפני אימון של החיה הבאה. נסה להימנע מאימון מינים שונים בכל פעם באותה התיבה, כריח הטבעי שלהם עלול להפריע לביצועי אימון.
2. ניתוח של נתוני אימונים
   1. להקליט את כל שינויי התא בשלב ההתרגלות.
   2. להקליט את כל תא השינויים במהלך האימון ומתחלקים ללהיטים ואזעקות שווא, לברוח תגובות (החטאות והסעות חזרה אחרי אזעקת שווא) והסעות intertrial ספונטניות (ITS).
   3. חישוב שיעורי CR עבור CS + וCS- כדלקמן: שיעורי להיט = פוגע / מספר CS + הניסויים; שיעורי אזעקת שווא = אזעקות שווא / מספר ניסויי CS-.
   4. להשיג שיעורי CR-ישיבה חכמה. עם זאת, על מנת להעריך את דינמיקת הלמידה ברזולוציה זמנית גבוהה יותר, לחשב שיעורי CR מלוקים קצרים יותר מאותו המספר של CS + וניסויים CS- ( למשל, n = 10), בהתאמה.
   5. עלילת שיעורי CR כפונקציה של פגישה או לחסום משפט להערכת דינמיקת התקדמות אימון ולמידה.
   6. לכימות של רגישות ההתנהגות העצמאית של תנאי ניסוי הטיית התגובה של בעלי החיים, נובעים ערכי ד 'מבוססים על תיאורית גילוי אותות ^8,9,17.
   7. ל'Z-ציוני שימוש ניתוח ד שיעורי להיט ושקר אזעקה המתאימים (למידה אפליה) או פגעו שיעורים ו( למידת הגילוי) שלה נגזרים ממנוגדים פונקצית התפלגות נורמלית סטנדרטית ולחסר Z-הציונים הללו. להגדיר קריטריון סף לזיהוי גירוי של ד '= 1.0, אשר תואם את עוצמת אות של סטיית תקן אחת מעל הרעש. ראה איור 3 כדוגמא.
   8. בנוסף לקבוע CR- אי-ולברוח זמני תגובה בתגובה לCS שונה על ידי מדידת פרק הזמן בין תחילת CS ותגובה התנהגותית (תא מלאכסף קטן).
   9. השג ניתוח התנהגות מפורט יותר מצילום וידאו-תיבת הסעות ההתנהגות. להשיג סנכרון זמנים בין מערכות וידאו והקלטה על ידי הקלטת פעימות הדק ממערכת גירוי-תיבת הסעות או על עקבות שמע של הווידאו. ניתוח וידאו מאפשר לתגובות תשומת לב חמורים ומכוונות של בעלי החיים שקדמו לCR.

4. בטכניקות Vivo אלקטרו בבעלי חיים למידה

1. הקלטת אלקטרו במהלך אימון
   1. במהלך אימון, להקליט אותות אלקטרו (למשל, עם ECOG-המערכים תיארו) מאלקטרודות מרובות monopolarly נגד האלקטרודה התייחסות המשותפת / הקרקע.
   2. אותות הזנה מכל האלקטרודות לתוך מגבר headstage או מחוברים ישירות או באמצעות מתאם קצר למחברי הראש.
   3. חבר את headstage למגבר העיקרי באמצעות רתמת של כבלים דקים, גמישים עטוףעל ידי מתכת רשת כדי להגן עליו מפני נזק על ידי נשיכת בעלי חיים.
      הערה: לחץ מכאני ברתם הכבל ניתן להקל על ידי אביב מאפשר תנועה וסיבוב חופשיות של בעלי החיים בתיבה נוסף. האידיאלי הוא השימוש במסתובב turnable והממונע. עם זאת, לניסויים שמיעתיים למקם מסתובבים מחוץ לחדר אטום לרעש או נשמעים להגן עליו עם קצף כדי להפחית את רעש השמיעה בתדר הגבוה המיוצר על ידי המנוע שלה.
   4. השתמש במגבר קדם בתיבה מוגנות להגדיל את יחס ולהקה עוברת אות לרעש לסנן את האות בטווח התדרים הרצוי.
   5. נתוני מדגם בתדירות יותר מ 1 kHz דגימה (להקלטות פוטנציאל שדה מקומי) ולפחות 40 קילוהרץ (להקלטות פוטנציאל פעולה) ולאחסן למחשב לניתוח במצב לא מקוון. השתמש בהגדרות מסנן מתאימות לשני הסוגים (למשל 2-300 הרץ לפוטנציאל שדה מקומי; 300 - הרץ 4,000 לפוטנציאל פעולה).
   6. בזהירות לבדוק את האיכות של ההקלטה לפני תחילת tיורד גשם (לא חפצי רעש או תנועה). החל FFT-מסנן מקוון לאות כדי לקבוע את המשרעת של 50 הרץ רעש. אם יש צורך לבדוק את כל החיבורים בין מחבר הראש, המתאמים, headstages, רתמה הכבל, והמגברים.
   7. להפחתה של חפצים בנתונים המדווחים עוררו על ידי גירוי חשמלי להשתמש הליך אינטרפולציה לשחזר את כל נקודות הנתונים מושפעות מהחפץ 1 ms לפני עד ~ 5 ms לאחר תחילת דופק בכל. לשם כך, הכנס אפסים בין נקודות נתונים מושפעות, ולהחיל מסנן FIR-סימטרי שממזער את השגיאות הממוצעת מרובע בין נקודות interpolated והערכים שלהם אידיאליים (פונקצית interp.m של Matlab). החל הליך זה לאות הגלם, בנפרד בכל ערוץ נוסף לפני ניתוח ^9.
2. פרטים טכניים של הכשרה-תיבת הסעות מקבילה, ICMS, והקלטה
   1. באופן כללי, להבטיח כי בעלי חיים להרגיש בנוח בתיבה surrounding. לאפשר לבעלי החיים לנוע בחופשיות ולהגיע לכל הפינות של התיבה. מספיק זמן כדי להרגיל יום לפני האימון הראשון (20 דקות) ולפני כל פגישה (3 דקות) הוא מועיל.
   2. לאחר כל טיפול כירורגים, לאפשר מספיק הזמן כדי להתאושש בעלי החיים תרופות כוללים במידת צורך (ראה לעיל 2.17) ולהתחיל לאמן את החיה היחידה, אם בעלי חיים לא מראים שום סימנים אופייניים לסובלים או כאב (עיניים עצומות, פנוטיפ הרדום, פרווה מוזנחת ^20).
   3. ודא הארקת חשמל תקינה של רצפת הרשת. לולאות קרקע בין מערכת הקלטה, תיבת הסעות ובעלי החיים יש להימנע. קרקע לבעלי החיים רק באמצעות אלקטרודה הקרקע המשותפת שלה, שעזבה את gridfloor במתח צף.
   4. חבר את ממריץ רב-ערוצי (MCS STG2000) למחבר ראש מערך אלקטרודות הגירוי המושתל באמצעות קווים נפרדים של מסתובב הממונע.
   5. השתמש באלקטרודה הקרקע המשותפת של הקלטה כקרקע או לחזור לאלקטרודה אניCMS, גם כן.

5. ניתוח היסטולוגית של פוזיציות אלקטרודה

1. בעקבות סט אימון המלא, לשלוט על העמדה היציבה של מערך אלקטרודות הגירוי על ידי ניתוח היסטולוגית.
2. לטשטש חיות עם זריקת ip של תערובת של קטמין (100 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (5 מ"ג / קילוגרם) בדילול מלא 0.9% נתרן כלורי-סטרילי. לאחר מכן להחיל הנוכחי monopolar קתודית (30 מיקרו-אמפר במשך 60 שניות) מועבר דרך כל ערוצי הגירוי להשיג הפקדת ברזל ברקמות במיקום של השתלה ^8.
3. בעקבות הליך זה, להקריב את בעלי החיים על ידי שיטה מתאימה ומאושרת של המתת חסד (למשל הזרקת intraperitoneal של מנת יתר של pentobarbital; 100 מ"ג / קילוגרם).
4. הסר את המוח של החיה מייד ולהקפיא אותו ב2-methylbutane מקורר -70 ° C בחנקן נוזלי.
5. עכשיו לחתוך את האזור של עניין על microtome cryostat לתוך 50 מיקרומטר hחלקים ופקי.
6. היסטולוגיה: -staining Nissl ו" הכחול פרוסים "
   1. לזיהוי של שכבות בקליפת המוח מתייחס לכל הפרוסה שנייה עם Nissl מכתים. ראשית, להתרחץ פרוסות דקות 5 ב0.05 חיץ M נתרן trihydrate אצטט (4.0 pH -4.2).
   2. להתרחץ פרוסות ל5 - 10 דקות ב 5% אצטט סגול cresyl. יש לשטוף את הפרוסות במים מזוקקים.
   3. להתרחץ פרוסות דקות 2 ברצף ב0.05 חיץ M נתרן trihydrate אצטט (pH 4.0-4.2), ובפתרונות של 50%, 70% ו -90% אתנול, בהתאמה.
   4. להתרחץ פרוסות פעמיים ב isopropanol: 96% אתנול (2: 1) במשך 5 דקות כל אחד.
   5. לבסוף, להתרחץ פרוסות בRoticlear שלוש פעמים במשך 5 דקות.
   6. להשיג מיקום של ערוצי גירוי על ידי -staining "הכחול הפרוסים" של כל פרוסה אחרת שעושה את תצהיר הברזל עורר על ידי זרמי monophasic ארוכים לאחר הניסויים גלויים.
   7. הכן פתרון חדש של 1% hexacyanoferrat אשלגן (II) trihydrate ₄ K[Fe (CN) _6] על ידי ערבוב 2 גרם של ₄ K [Fe (CN) _6] בשנת 200 מיליליטר של 1% HCl.
   8. להוסיף 800 מיליליטר של 0.1 מ 'חיץ פוספט (pH 7.4).
   9. להתרחץ פרוסות מוח במשך 10 דקות במים מזוקקים, ולאחר מכן במשך 10 דקות בפתרון hexacyanoferrat.
   10. להתרחץ פרוסות פעמיים במשך 10 דקות במאגר פוספט 0.1 M ולבסוף במשך 5 דקות במים מזוקקים.

סעיף זה ממחיש דוגמא מייצגת של למידת תיבת הסעות בהגרביל מונגולי. הנושא הוכשר להפלות אתר ICMS בין שתי אלקטרודות גירוי מושתל 700 מיקרומטר מלבד אחד את השני בשמיעת קליפה (איורים 1 ו -2). יכולים להיות מותאמים אישית מערכי גירוי בעיצובים שונים מרחבית (איור 1). כאן, אפליה של שני אתרי ICMS נלמדה בתוך 3 אימונים עם מצגת של 30 CS + וCS- כל (3A-C איור). זה מסומן על ידי הבדל משמעותי יציב של שיעורי CR של תגובות להיט ואזעקה שווא בכל 7 מפגשים רצופים אימונים (איור 3). במקביל, ד 'הוא> 1 במפגשים אלה (איור 3 ג). שיהוי בריחה מהיר כלפי ארה"ב הוא יסוד, כפי שהם משקפים תגובה הבלתי מותנית מרתיעה יעילה. זה יכול להיות מובטח על ידי התאמת כוח הלם רגל מ -200 &# 181; ב -50 מיקרו-אמפר צעדים עד שיהוי בריחה קצר (ראה איור 3 E). במקביל, קלטות אלקטרו מECOG מערך תאפשר להעריך את דפוסי הפעלת spatiotemporal אתר ספציפי שמעוררים intracortical חשמל CS + או CS- באתרי גירוי מופרדים על ידי ~ 700 מיקרומטר (איור 4).

איור 1. עיצובי מערך אלקטרודות. () מערך עומק (2 x 1) לmicrostimulation intracortical בשני אתרים שונים בקליפת המוח. אלקטרודות מסודרות במרחק של interelectrode ~ 700 מיקרומטר. עיצובי מרחבי אחרים יכולים לאפשר לICMS המקומי שכבה תלויה במעמקי קליפת המוח שונים או מערכי רוחב עם אתרי גירוי לאורך ציר מסוים של רקמת קליפת המוח, כמו למשל שיפוע tonotopic של שמיעה קליפה ^8. surfa אפידורל (ב)מערך לסה"נ (3 x 6) להקלטה של ​​electrocorticogram ברזולוציה מרחבית גבוהה. אלקטרודות נעשו מחוט נירוסטה (מיקרומטר Ø 256) מסודר במטריצת 3x6 עם מרחק interelectrode של ~ 600 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. מיקום של אלקטרודות גירוי והקלטה מושתלים. (א) זוג שתי אלקטרודות גירוי (ראה איור 1 א) S1 (ירוק כהה) וS2 (אור ירוק) הם מושתלים לתוך עומק שדה הזכות הראשוני השמיעתי AI הקרוב לIV שכבת קלט שלה. ניתן למקם טיפים אלקטרודה לאורך ציר rostrocaudal (S1 אלקטרודה הזנב, S2 האלקטרודה מקורי) עם מרחק interelectrode של ~ 700 מיקרומטר. הקלטת 3 x 6 ECOGמערך (interelectrode מרחק 600 מיקרומטר) מרוכז epidurally על AI תקין. (ב) Nissl מוכתם סעיף אופקי של אזור במוח המתאים לאחר הליך ניסיוני מראה שני נגעים קטנים (חיצים), אשר נגרמו על ידי הטיפים של שתי אלקטרודות הגירוי מושתלים המציין את המיקום שלהם בתוך זמן קליפה. העמדה ניתן להעריך עוד יותר על ידי צביעה "הכחולה פרוסים". נתון זה שונה מDeliano et al., 2009. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

נתוני איור 3. הסעות תיבת הדרכה וניתוח של חיה אחת בודדת. סכימות () מהימין מתארות עיצוב משימה עבור CS + וניסויים CS- בה'דיסקרימינאטי'-תיבת הסעות דו-כיווניעל משימה ותוצאות התנהגותיות. עקומות למידה (B) זממו כמו שיעורי להיט ושקר אזעקה של אימונים אישיים. הבדלים משמעותיים בין להיט ושיעורי אזעקת שווא מסומנים בכוכביות (בדיקת המשחקים-האוול, p <0.05). ד מדד (ג) רגישות '> 1 (ראה 3.2.7) יכול לשמש כקריטריון סף לאפליה מוצלחת. (D ניטור) של המעברים ספונטניים בשלב ההתרגלות בדרך כלל להראות ירידה על מפגשים. Latencies תגובה (ה) במהלך ניסויים + CS הם זממו לניסויי פרט על כל האימונים. כל התגובות בשיהוי להלן 6 שניות מתאימות לתגובות להיט מוצלחות. שים לב לזמני שיהוי הבריחה כבר במחצית הראשונה של הפגישה הראשונה. לאחר הגדלת שיהוי בריחת כוח הלם הרגל ירד מתחת ל -2 שניות לאחר ההופעה בארה"ב מצביעה על שליטת הלם מספיק. היסטוגרמות (הבלעה ימין) של שיהוי תגובתם bimodאל המקביל לרמה של תגובות (<6 שניות) ולברוח תגובות. (6 - 8 שניות) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4. הקלטת אלקטרו מקבילה בבעלי חיים לומדים. (א) דוגמא טיפוסית של פוטנציאל (יפ) עורר חשמלי מחיה אחת בממוצע על פני CS + ניסויים בפגישה אחת של אימון. הנתונים נרשמו מECOG-מערך. הדמות משווה את עקבות יפ לפני (שחור) ואחרי ההסרה (אדום) של חפצי גירוי דופק יחידים. פרטים של הפחתת חפץ ראו סעיף 4.1.7. השיא השלילי הבולט המוקדם ניתן לראות בהשהיה של 20 מילישניות (N20). ניתוח נוסף של ההפצות המרחבי של משרעת N20 בתגובה ל+ CS בT (B)הוא מקורי אלקטרודה גירוי (למעלה) ולCS- באלקטרודה הזנב הגירוי (למטה) לחשוף את הרזולוציה המרחבית של מדינות עוררו ברחבי שמיעתית קליפה. כיוונים אנטומיים ביחס למערך ההקלטה מסומנים על ידי חצים (ד, הגבי; ג, הזנב; l, רוחב; מ ', המדיאלי; r, מקורי; נ', הגחון). נתון זה שונה מDeliano et al., 2009. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

פרוטוקול זה מתאר שיטה של ​​ICMS בו זמנית באתר ספציפי וקלטות אלקטרו רב-ערוצית בבעלי חיים לומדים באמצעות מערכת תיבת הסעות מבוקרת רגל-הלם מרתיע דו-כיוונית. הפרוטוקול מדגיש מושגי מפתח טכניים לשילוב כזה ומציין את החשיבות של האימונים בעלי החיים רק באמצעות אלקטרודה הקרקע המשותפת שלה, שעזב את gridfloor במתח צף. כאן, למידת תיבת הסעות שמיעתית הייתה מוחלת על גרבילים מונגולי כארגון מחדש פלסטיק הקשורות ללמידה של קליפת המוח השמיעתית בבעלי החיים אלה נחקרו רב ^{8,12,14,15,21,22.} עם זאת, הפרוטוקול המתואר ניתן להתאים עם שינויים קלים למינים מכרסמים אחרים, כמו לדוגמה ¹⁶ עכברים. בהקשר זה חשוב לשקול מינים ספציפיים הנוגעים לעיבודים זמן התאוששות לאחר הניתוח (2.17), בגובה של המשוכה (2.1.1), ורגישות ברגל-הלם של חיות אדם, אשר ניתן HIGhly משתנה (3.1.3-3.1.6).

הפרוטוקול נוסף נותן הסברים מפורטים כיצד ניתן להשתמש בעיצובי אלקטרודה מחוייט כדי לעורר אתרים שונים ברקמת קליפת המוח המוביל להפעלות רשת נפרדות כפי שנגזר מהניתוח של הקלטות multielectrode אלקטרו במקביל ^8,23. בהתאם למרחק של אלקטרודות אחד יכול לעורר אזורים שונים של למשל מפות טופוגרפיות ^9. על ידי יישום שכבת ICMS תלויה ניתן להפעיל באופן דיפרנציאלי תחזיות corticocortical ארוך טווח שתובלנה ליותר הפעלה נרחבת של קליפת המוח על ידי גירוי בשכבות קלט קליפת המוח III-IV. במקום זאת, גירוי בשכבות פלט corticoefferent V-VI הוביל להרבה יותר מוקדי הפעלה של מעגלי משוב intracortical וcorticothalamic ^8. בעת שימוש במערכי גירוי עם שתיים או יותר אלקטרודות גירוי, יכול להיות מיושם ICMS דו קוטבי במקום ICMS monopolar. מצב גירוי דו קוטבי יותריעילות מגייס סיבים עצביים פועלים במקביל לטיפי אלקטרודה, רצוי בכיוון של המוט קתודית לעומת סיבי nonparallel ^24. כגון תצורת גירוי ולכן מגדילה את הספציפיות כיוונית של הפעלות הרשת עצביות עוררו ^8. מניפולציות אלה בפרט ישירות של פעילות רשת sublaminar קליפת המוח באמצעות ICMS ^8,9, עד כה לא הוכח על ידי כל טכניקה אחרת ^3. כדוגמא לכח של שיטה זו, דו"ח האחרון נפרם התרומה של מעגלי משוב cortico-thalamocortical לתפיסה באמצעות למידת זיהוי של גירויים חשמליים intracortical ^8. זה מוכיח כי microstimulation קליפת המוח הישיר היא שיטה יעילה ומדינה של האמנות לסיבתי קישור פעילות במעגלים עצביים שצוינו והתנהגות ^1,3,11,25. על ידי גירוי חשמלי המקומי של אזורים בקליפת המוח מקביל לתכונות המפה טופוגרפיות מסוימות, כמו לInstאהה אזור tonotopic בקליפת המוח השמיעתי, יכולים להיות מאומנים נושאים בפרדיגמות למידת העברה להשוות מאפיינים של תפיסות שהושרו על ידי גירוי חושי חשמל או ציוד היקפי מרכזי. ניסויים אלו אולי לעורר את הפיתוח של אסטרטגיות לגירוי קליפת המוח תחושתי neuroprostheses ^5,9. פרוטוקול זה גם יכול להיות מועסק בגירוי החשמלי של אזורים אחרים במוח, כמו למשל אזור tegmental הגחון, ללמוד עיבוד שכר ואת הבסיס העצבי של גירוי מוחי עמוק ^26. קריטי עבור microstimulation היעיל כמה פרטים טכניים שיש לקחת בחשבון על רקע ההתקנה בודדת ואלקטרודות המשמשת. באופן כללי, השפעה של פרמטרים גירוי, כמו משרעת גירוי, קוטביות, כיוון האלקטרודה, וכו ', נבדקה ^11,24. חשיבות היא העברת תשלום על ידי אלקטרודה. העכבה של האלקטרודה מכאן היא גורם קריטי. לפיכך, לבדוק לא שהוא העכבה של אנשי קשר אלקטרודה היא בטווח הק"ג-אוהם לפני ההשתלה.

כמה תופעות נוספות של למידה ניתן ללמוד על ידי הווריאציה המתאימה של העיצוב הבסיסי שתואר. לדוגמא, אפליית למידה בניגוד ללמידת זיהוי פשוטה יכולה להיחקר על ידי החדרת לפחות שני גירויים שצריכים להיות קשורים לתגובות דרכים וnogo, בהתאמה ^14,15. כמו כן למידת היווצרות קטגוריה ניתן ללמוד על ידי שילוב של אפליה כזו פרדיגמות ^12,21. פרדיגמות הסעות התיבה גם יכולות להיות מועסקות לחקור זיכרון עבודה, עיכוב התנהגות וגמישות מחשבתית כמו למשל צורך להיפוך מוצלח למידת ^14,17 או הסטה להגדיר. זיכרון עבודה יכול להיות מוערך על ידי השוואה "עיכוב" ואוויר "עקבות". ב'עיכוב 'אוויר ^27, CS מוצג לאורך חלון זמן CS-האמריקאי הקריטי ללא דיחוי בין CS שלתחילת fset וארה"ב. באוויר "עקבות", לעומת זאת, יש עיכוב של כמה שניות ולאחר קיזוז מצגת CS חולף. בניגוד לאוויר "עיכוב" האוויר "העקבות" מעמיד עומס גבוה על זיכרון עבודה ועיבוד בקליפת המוח. שילוב פרדיגמות למידת תיבת הסעות מפלות עם הניתוח של דפוסי spatiotemporal בelectrocorticogram המתמשך, היא שיטה מתאימה לזהות מצבים הדינמיים של קשורים לאפליית גירוי ⁹ קליפת המוח השמיעתית, והיווצרות קטגוריה ^21. עם זאת, כאימון תיבת הסעות משמש קלסי כמשימה הימנעות דו-כיוונית, הבעיות רעיוניות הכלליות עם למידת הימנעות חלות על כל עיצובי התנהגות אלה; כלומר שהתנהגות ההימנעות מוצלחת במפורש מונעת את התרחשותם של התמריצים המשמשים כחיזוק. תיאבון מתוגבר, למשל על ידי גירוי חשמלי ישיר של מעגלי תגמול המוח התיכון, יש דבורה רקn להחיל תיבת הסעות לימוד בחלק מהמחקרים ^26. כמו כן, למידת תיבת הסעות יש בעיקר נעשתה שימוש במיני מכרסמים ויושמה רק לעתים נדירות בחיות מעבדה גדולות יותר, כמו לכלבים למשל.

חוץ מזה עם ניתוח אלקטרו, למידת תיבת הסעות ניתן לשלב עוד יותר עם ​​התערבות תרופתית ^8,17, טכניקות נגע ^15, microdialysis ^28, או optogenetics. במיוחד השילוב של הפרוטוקול שלנו עם כלים optogenetic, או על ידי זיהום נגיפי של מערכת המודל (כלומר, גרבילים מונגולי), או על ידי בעלי חיים מהונדסים גנטי, כמו עכברים, יאפשר להגדיל בפרט סגוליות תת הסלולרית של הפעלה עצבית המלאכותית כולל קליפת המוח עיכוב, שאינו נגיש באמצעות ICMS ^3.

יש המחברים אין לחשוף.

העבודה נתמכה על ידי מענקים מDeustche Forschungsgemeinschaft DFG ולייבניץ-המכון לנוירוביולוגיה. אנו מודים מריה-המרינה Zempeltzi וקתרין או-ה-ל לקבלת סיוע טכני.