جنبا إلى جنب المكوك بوكس ​​التدريب مع الكهربية اللحاء تسجيل وتحفيز كأداة لدراسة الإدراك والتعلم

وراسخة مكوك مربع التعلم في علم الأعصاب السلوكي تجنب. يصف هذا البروتوكول كيف مكوك مربع التعلم في القوارض يمكن الجمع بين مواقع محددة microstimulation الكهربائية intracortical (ICMS) والمزمنة في وقت واحد في تسجيلات فيفو كأداة لدراسة جوانب متعددة من التعلم والإدراك.

التعلم مكوك مربع تجنب هو وسيلة كانت راسخة في علم الأعصاب والتجريبية الاجهزة السلوكية عادة حسب الطلب؛ المعدات اللازمة متوفرة الآن من قبل العديد من الشركات التجارية. يوفر هذا البروتوكول وصفا مفصلا لاتجاهين مكوك مربع تجنب نموذج التعلم في القوارض (الجربوع هنا المنغولية، Meriones unguiculatus) بالاشتراك مع موقع معين microstimulation الكهربائية intracortical (ICMS) ومتزامنة مزمنة الكهربية في الجسم الحي التسجيلات. بروتوكول مفصل ينطبق على دراسة جوانب متعددة من السلوك التعلم والإدراك في أنواع القوارض المختلفة.

يستخدم ICMS موقع معين من الدوائر القشرية السمعية كما المحفزات مكيفة هنا كأداة لاختبار مدى ملاءمة الحسية من وارد معين، صادر والاتصالات intracortical. أنماط التنشيط متميزة يمكن أثار باستخدام مختلف آر التحفيز الكهربائيآيس ل، ICMS التي تعتمد على طبقة المحلية أو المواقع ICMS بعيدة. استخدام التحليل السلوكي الكشف عن إشارة يمكن تحديد أي استراتيجية التحفيز هو الأكثر فعالة للحصول على إشارة للكشف سلوكيا والبارزة. وعلاوة على ذلك، وبالتوازي مع الأقنية تسجيلات باستخدام تصاميم مختلفة القطب (أقطاب السطح، أقطاب العمق، الخ) تسمح للتحقيق المتغيرات الظاهرة العصبية على مدار الساعة من مثل هذه العمليات التعلم. سيتم مناقشته كيف يمكن للتغييرات في التصميم السلوكي يمكن أن تزيد من تعقيد المعرفية (مثل الكشف والتمييز، والتعلم انعكاس).

والهدف الأساسي من علم الأعصاب السلوكي هو إقامة روابط معينة بين خصائص الخلايا العصبية الهيكلية والوظيفية، والتعلم، والإدراك. النشاط العصبي يرتبط الإدراك والتعلم يمكن دراستها عن طريق تسجيل الكهربية من إمكانات العمل والإمكانات الميدانية المحلية في هياكل الدماغ المختلفة في مواقع متعددة. في حين توفر التسجيلات الكهربية الجمعيات المترابطة بين النشاط العصبي والسلوك، وكان microstimulation المباشر الكهربائية intracortical (ICMS) لأكثر من قرن الأسلوب الأكثر مباشرة لعلاقات اختبار السببية السكان متحمس من الخلايا العصبية والآثار السلوكية والإدراكية التي ^1-3. وقد أثبتت العديد من الدراسات أن الحيوانات قادرة على الاستفادة من مختلف الخصائص المكانية والزمانية من المحفزات الكهربائية في المهام الإدراكية اعتمادا على موقع التحفيز داخل على سبيل المثال شبكي التوضع ^4، رonotopic ⁵ أو ⁶ مناطق جسدي التوضع في القشرة. يتم تحديد انتشار النشاط منبهات المسموعة كهربائيا في القشرة أساسا من تخطيط الألياف محور عصبي وزعت التواصل فيما بينها متشابك ² أنه في القشرة، ومن الواضح ⁷ التي تعتمد على طبقة. تفعيل متعدد المشابك الناتجة التي حركها ICMS هو أكثر من ذلك بكثير من الآن فصاعدا انتشار واسع من الآثار المباشرة ^لل2،8،9 مجال كهربائي. وهذا ما يفسر لماذا عتبات الآثار الحسية التي تسببها microstimulation intracortical يمكن أن يكون بقوة ^8،10،11 التي تعتمد على طبقة ^و9 تعتمد على الموقع. أظهرت دراسة أجريت مؤخرا في التفاصيل التي تحفيز الطبقات العليا أسفرت عن أكثر تفعيل واسعة الانتشار من الدوائر corticocortical في طبقات supragranular أساسا، في حين تحفيز الطبقات العميقة من القشرة نتيجة في التنسيق، قشري صادر المتكررة intracolumnar التنشيط. وكشفت التجارب السلوكية موازية أن الأخير لديه أقل بكثير الكشف عبتي الإدراك الحسيesholds ^8. لذلك، تم استغلال ميزة خاصة بالموقع ICMS محفزات مشروطة كما هو الحال في تركيبة مع التسجيلات الكهربية لربط سببيا التنشيط الدوائر القشرية محددة ^{8 إلى} التدابير السلوكية في التعلم والإدراك في مربع المكوك.

اتجاهين مكوك مربع النموذج هو جهاز مختبر راسخة لدراسة تجنب التعلم ^12. يتكون A-مربع المكوك من 2 المقصورات مفصولة عقبة أو المدخل. A التحفيز (CS) مكيفة الذي يمثله إشارة مناسبة مثل ضوء أو الصوت، ويتبع محتملة من قبل المثير غير الشرطي مكره (US)، كما على سبيل المثال صدمة القدم على أرضية شبكة معدنية. يمكن تعلم المواد الدراسية لتجنب الولايات المتحدة من قبل في رحلات مكوكية من واحد مكوك مربع حجرة إلى أخرى ردا على CS. ينطوي التعلم مكوك مربع سلسلة من مراحل التعلم مميزة ^13،14: أولا،موضوعات تعلم للتنبؤ الولايات المتحدة من CS من قبل الإشراط الكلاسيكي وللهروب من الولايات المتحدة عن طريق تكييف فعال، كما يتم إنهاء الولايات المتحدة على مكوكية. في المرحلة المقبلة، والموضوعات تعلم لتجنب الولايات المتحدة تماما من قبل في رحلات مكوكية ردا على CS قبل ظهور الولايات المتحدة (تجنب رد فعل). عموما، التعلم مكوك مربع ويشمل الإشراط الكلاسيكي، تكييف فعال، فضلا عن السلوك الذي توجهه الهدف اعتمادا على المرحلة ¹⁴ التعلم.

يمكن تعيين الإجراء مكوك مربع تصل بسهولة وعموما ينتج السلوك قوي بعد بضع جلسات تدريبية يوميا ^15-17. بالإضافة إلى تكييف بسيط تجنب (الكشف)، وصندوق المكوك يمكن أن تستخدم أيضا لدراسة التمييز التحفيز عن طريق استخدام نماذج العودة / nogo. هنا، يتم تدريب الحيوانات لتجنب الولايات المتحدة من خلال استجابة مكيفة (CR) (الذهاب السلوك؛ المكوكية إلى حجرة المقابلة) ردا على <قوي> الذهاب التحفيز (CS +) والسلوك nogo (البقاء في مقصورة الحالية، ولا CR) ردا على nogo التحفيز (CS-) microstimulation الموازي وتسجيل النشاط العصبي مع المصفوفات multielectrode ذات الكثافة السكانية العالية تسمح للدراسة. الآليات الفسيولوجية الكامنة وراء تعلم الناجح. العديد من التفاصيل التقنية التي تعتبر أساسية لتركيبات الناجحة للتدريب مكوك مربع، ICMS والكهربية بالتوازي مع ذلك، سيتم مناقشتها.

أجريت جميع التجارب التي قدمت في هذا العمل بالاتفاق مع المعايير الأخلاقية التي يحددها القانون الألماني لحماية حيوانات التجارب. وتمت الموافقة على التجارب من قبل لجنة الأخلاق من ولاية سكسونيا-أنهالت.

1. المتعددة الكهربائي صالحة للMicrostimulation وتسجيل مخصص الصنع

1. حسب الطلب microstimulation مجموعة
   1. لتقديم ICMS، وإعداد أقطاب التحفيز في التصميم المكاني المطلوب (مجموعة الجانبية هنا من 2 قنوات) باستخدام 3 سم طويلة أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ العزل تفلون (Ø مع العزلة = 50 ميكرون). انظر الشكل 2.
   2. تجعيد واحدة من نهاية الأسلاك إلى نظام دبوس الذكور (1.25 ملم الملعب).
   3. لمجموعة 2-قناة مع ~ 0.5 ملم أو 0.7 ملم ~ الأسلاك تمريرة مسافة الكهربائي عموديا من خلال اثنين من محاذاة عموديا المجهر الإلكتروني شبكات الكائن صاحب (المسافة من شبكات ~ 5 ملم) توجيه الأسلاك (0.1654 ملم الملعب).
   4. أسلاك الغراء جنبا إلى جنب مع قطرة صغيرة من الاكريليك الأسنان حوالي 4 مم فوق نهايات الأسلاك التي تخدم في النهاية إلى نصائح الكهربائي.
   5. وضع دبابيس الذكور في السكن المكونات.
   6. وضع القطب في طبق مع حل كهربائيا (على سبيل المثال، 0.9٪ كلوريد الصوديوم) وقياس مقاومة من كل قناة مع مقاومة جهاز قياس كل منها (على سبيل المثال، FHC الممانعة تكييف وحدة). تهدف إلى ممانعات في 100-500 مجموعة أوم.
      1. إذا مقاومة مرتفعة للغاية، وتقديم التيار الكهربائي قصيرة (1 ثانية، 1 أمبير) من خلال القنوات لخفضه. تحقق مقاومة مرة أخرى.
2. عالية الدقة صفائف تسجيل متعددة حسب الطلب
   ملاحظة: يصف هذا البروتوكول تصنيع صفائف سطح لتسجيل مخطط كهربية قشر الدماغ (ECoG) البيانات. ومع ذلك، تصاميم يمكن تكييفه لتلبية متطلبات السؤال البحثي المعني (التسجيلات العمق، الخ). المصفوفات المتعددة عالية الدقة هي الاكثر استخدامار عن طريق أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ العزل تفلون (Ø مع العزلة = 50 ميكرون) معقوص إلى نظام دبوس الذكور (1.25 ملم الملعب).
   1. لصفائف الكهربائي السطح، وتوجيه 18 الأسلاك من خلال مصفوفة 3 × 6 اثنين مستعدة المجهر الإلكتروني الكائن صاحب الشبكات.
   2. تضمين هذا الترتيب 6 × 3 من الأسلاك بين شبكات مع الاكريليك الأسنان ووضع المسامير في السكن المكونات.
   3. طحن الأسنان الاكريليك في كتلة مستطيلة باستخدام طاحونة تعلق على الحفر باليد.
   4. تأكد من أن مقاومة من جميع القنوات (انظر 1.1.6) في نطاق بين 100-500 أوم.
   5. قبل الزرع (راجع الخطوة 2) طحن سطح المصفوفات لتتناسب مع تحدب السطح القشري.

2. زرع جراحة المصفوفات في سمعي اللحاء في Herbils المنغولية مخدرة لاستخدام المزمن

1. عقد الموافقة الرسمية لتنفيذ جميع الخطوات التجريبية الضرورية التي يتم التخطيط. ارتداء APPROملابس واقية priate (معطف، والقفازات المعقمة، قناع جراحي، غطاء محرك السيارة).
2. استخدام الجربوع الذكور البالغين المنغولية (Meriones unguiculatus) أو أي أنواع القوارض الأخرى. ارتداء القفازات الواقية ومعطف ودائما استخدام الأدوات الجراحية المعقمة والتي تم تحديدها بشكل جيد.
3. في حالة الجربوع، تخدير الحيوانات مع حقن الملكية الفكرية من خليط من الكيتامين (100 ملغ / كلغ) وزيلازين (5 ملغ / كلغ) المخفف في 0.9٪ من الصوديوم العقيمة محلول كلوريد. المحافظة من قبل ضخ 0.6 مل / ساعة / كجم من تأليف خليط من الكيتامين: زيلازين: كلوريد الصوديوم (0.9٪) في نسبة 9: 1: 10.
4. وضع الحيوان على لوحة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية خلال نظام التغذية المرتدة التحقيق المستقيم (على سبيل المثال، الآلات الدقيقة الدولي).
5. يحلق الفراء تغطي interoccipital، الجدارية، والعظام الزمنية. جو معقم و مطهر إعداد موقع شق مع مطهر فعال (على سبيل المثال، بالتناوب Betadine أو Nolvasan و 70 الدعك٪ كحول 3 مرات). العلاقات العامةعيون otect ضد التجفيف بواسطة مرهم العين.
6. قطع الجلد الجمجمة تغطي interoccipital، الجدارية، وأمامي العظام باستخدام مشرط وإزالة السمحاق عن طريق تحريك بلطف الحفر على سطح العظام.
7. حفر ثقوب صغيرة في الجدارية المقابل والعظم الجبهي الجانبية قدر الإمكان أن لا تعيق رئيس احق جبل. الآن المسمار اثنين من البراغي العظام التي يبلغ قطرها حوالي 1 مم بإحكام في الثقوب. تأكد من أن المسمار الجداري ديه اتصالات جيدة لالجافية، كما سيتم استخدامه كمرجع المشتركة والأرض، وكذلك عودة الكهربائي لتحفيز الكهربائي في وقت لاحق.
8. الغراء شريط الألمنيوم صغير إعلامي على العظام الأمامية واستخدامه بمثابة الرأس التثبيت خلال زرع من قبل headholder.
9. إزالة الجلد تغطي العضلة الصدغية على جانب واحد باستخدام المقص.
10. قطع الجزء الظهري للعضلات الزمنية للحصول على القبول في العظم الصدغي.
11. فضح القشرة السمعية التي كتبها حج القحف (~ 3 مم × 4 ملم) منفي العظم الصدغي باستخدام حفر الأسنان. تحديد موقع القشرة السمعية على أساس نموذجي الدم في الدماغ الأوعية الدموية توقيع ^18،19.
12. جعل بعناية شق الجافية مع مشرط الصغير في الموقع حيث يتم زرع قطب كهربائي التحفيز في الدماغ. تحرك بلطف على طول السطح حتى الدموع الجافية لحظر الأضرار التي لحقت neuropil الأساسي.
13. إدراج مجموعة التحفيز تحت السيطرة micromanipulator. اختيار زاوية الإدراج عرضية للسماح لمجموعة فوق الجافية لتوضع على المنطقة من الفائدة. اعتمادا على زاوية الإدراج وموقف وموقع يهدف من التحفيز، النظر بعناية في عمق الإدراج.
14. وضع فوق الجافية مجموعة تسجيل السطح مع اتصالات جيدة لسطح الدماغ الذي يغطي المنطقة من اهتمام (القشرة السمعية هنا) من قبل micromanipulator الثاني. الحرص على أن مجموعة مباريات انحناء القشرة ليست البادئة الجافية.
15. يحملق كل من صفائف الكهربائي والمكونات الخاصةالعلب مع الاكريليك الأسنان في الجمجمة.
16. يتعرض غطاء السطح القشري مع زيوت التشحيم مطهر (على سبيل المثال، KY جيلي) وحج القحف وثيق مع الاكريليك الأسنان (على سبيل المثال، Paladur، هيراوس Ulzer). نضع في اعتبارنا أن البلمرة قد تنتج الحرارة. استخدام زيوت التشحيم كاف بين neuropil والاكريليك الأسنان لمنع أي اتصال من الاكريليك الأسنان والسطح القشري، لأن ذلك قد يسبب تلف الأنسجة.
17. الآن السماح للحيوانات لاستعادة قبل بدء أي إجراء آخر. قد تختلف أوقات الانتعاش بين الأنواع (مثل الجربوع: ≥3 أيام، الفئران: ≥7 أيام). ترصد بدقة حالة الحيوان وإعطاء العلاج مسكن في الأيام التالية إن وجدت (على سبيل المثال، ميلوكسيكام؛ 1 ملغ / كغ بعد الجراحة و24 ساعة بعد الجراحة).

3. اتجاهين المكوك مربع تصاميم طريق ICMS المثير الشرطي كما

1. تدريب مكوك مربع
   1. وضع مربع المكوك (جustom والبناء أو أي منتج تجاري، على سبيل المثال، E10، E15، Coulbourn صكوك) في غرفة محمية سمعيا وكهربائيا. حيث نعرض لك في قسمين يفصل بينهما عقبة. النظر في ذروة العقبة لأنها تؤثر على التحيز السلوكي من الذهاب الردود. استخدام ارتفاعات مناسبة لأنواع محددة (على سبيل المثال، ~ 2 سم للفئران، ~ 3 سم للالجربوع).
   2. لتطبيق القدم صدمة (US)، استخدم الكلمة الشبكة مع مسافة بين القضبان المناسبة للأنواع قيد التحقيق ^12،15. دائما الحرص على أن لا شيء اختصارات كهربائيا القضبان الفردية (البراز، الشعر، كريم القطب).
   3. بعد فترة انتعاش كبير للحيوان (انظر 2.17)، وربط هذا الموضوع إلى تسجيل والتحفيز كابل يفضل دون استخدام أي تخدير المدى القصير. محاولة لتغطية الحيوان بمنشفة واتخاذ بلطف الحيوان في اليدين. كشف رئيس وموصلات للحيوان مع جهة أخرى وتوصيل الكابلات.
   4. سماح للحيوانات لروض إلى غرفة التدريب لمدة 3 دقائق قبل بداية كل دورة.
   5. لكل دورة تدريبية (1-2 يوميا) تطبيق بين 30-90 المحاكمات. فترات استخدام المحاكمة لمدة تصل إلى 15 ثانية، وفترات ما بين المحاكمة التي تختلف بشكل عشوائي بين 25 - 30 ثانية.
   6. لتقديم ICMS لتحفيز مشروط لالأقطاب تحفيز استخدام مشجعا متعددة (على سبيل المثال، MCS STG2000). للحصول على التأثيرات السلوكية دون الإضرار أنسجة المخ، وتطبيق القطارات النبض (على سبيل المثال، 300 مللي طول، 100 ذكر المكتب الصحفى) من ثنائية الطور والبقول المسؤول متوازن (الكاثودية أولا) مع 200 ميكرو ثانية مدتها المرحلة. كرر القطارات مع وقفة من 700 مللي ثانية لمدة 4 ثوانى (إطار المراقبة).
   7. لعرض السمعي CS استخدام لوحة PCI الناتج التناظرية (على سبيل المثال، NI PCI-6733). برمجة هذه الأجهزة مع مطلب للسيطرة بمرونة والأجهزة تحريك نظام المكوك الجزاء عن طريق خطوط الانتاج الرقمية.
   8. مسار إشارة خرج التناظرية إلى thالبريد مكوك مربع مكبرات الصوت عن طريق مكبر الصوت.
   9. مشروط بتسليم القدم صدمة الولايات المتحدة من خلال الكلمة الشبكة. لالأمثل الكهربية جودة التسجيل، وتوليد الصدمة التي كتبها ثانية الراقية متعددة مشجعا (MCS STG2000).
   10. لتطبيق التدريب الكشف الحالي فقط CS المحفزات +. هنا، الحالية المحاكمات فارغة دون CS والولايات المتحدة يتخلل بين التجارب اختبار (~ 10٪) لتصحيح سلوك المكوك منحاز (انظر 3.2). لمهمة أكثر تطلبا، وتدريب الحيوانات للتمييز بين CS + والمحفزات CS- المقدمة في الدورة نفسها من أجل العشوائية.
   11. تصنيف تغيير المقصورة بعد ظهور CS + ضمن إطار الوقت الحرج من 4 ثانية (CR) كرد ضرب. في + التجارب CS دون CR في النافذة وقت حرج (ملكة جمال)، وتقديم فورا صدمة القدم خفيفة لمدة 6 إلى 10 ثانية كما المثير غير الشرطي (US).
       ملاحظة: سوف المتكرر CS + التحفيز التي تتداخل مع الولايات المتحدة تقلل من جهد التعلم للحيوانات لالثاني تحسين سرعة التعلم والأداء ('تأخير' مقابل تكييف "التتبع"، انظر المناقشة).
   12. للمحاكمات CS- وتصنيفها تغيير مقصورة ضمن إطار الوقت الحرج استجابة انذار كاذب كما، وتطبيق الولايات المتحدة لمدة تصل إلى 10 ثانية مباشرة بعد هذه CR غير مناسب. لا تنطبق الولايات المتحدة بعد CS- عندما يبقى الحيوان في مقصورة (لا CR) خلال نافذة وقت حرج، وتصنيف هذه المحاكمة رفض الصحيح كما.
       ملاحظة: الأهم من ذلك أن القدم صدمة تشغيل دائما خارج الولايات المتحدة، عند الحيوانات تغير مقصورة ردا عليه (الهروب). استخدام ويندوز قتا أطول الحرجة للمحاكمات CS-، على سبيل المثال، إذا تم استخدام التحفيز مشروط المتكررة، على الرغم من أن هذا سوف فرض معيار التعلم أكثر تحفظا حيث أنه يتيح أعلى الجهد الحيوان لتمنع CR.
   13. للجمعية فعالة من CS والولايات المتحدة ضبط قوة الصدمة في نطاق معتدل من أجل أن تكون مكره ولكن ليس مؤلمة. initia الأمثللتر القوة الحالية تختلف بين الأنواع (على سبيل المثال، 50 أمبير بالنسبة للفئران، 200 أمبير للالجربوع). لذا، يرجى الاطلاع على الرصاص المقبلين لمزيد من التفاصيل التقنية:
       1. التكيف بشكل فردي قوة صدمة في الدورة التدريبية الأولى بدءا سعة خفيفة (~ 200 أمبير لالجربوع). إذا قوة الصدمة القدم أنه منخفض جدا، والهروب غضب الإختفاء والعلاقة بين CS والولايات المتحدة ليست الأمثل.
       2. دائما الاهتمام إذا الحيوانات تبدأ في نطق وتجميد ردا على CS. في هذه القوة footshock حالة مرتفعة جدا. هذا الرد الخوف مكيفة يتداخل مع التعلم الإبطال.
   14. تحديد بعناية الإختفاء الهروب. زيادة القدم قوة الصدمة خطوة بخطوة إذا الإختفاء الهروب أطول من 2 ثانية بعد محاكمات 20 الأولى. تحقق بعد كل تدريب إذا كان الحيوان تحت السيطرة صدمة، أي أنه يظهر الهروب الإختفاء أقل بكثير 2 ثانية.
       ملاحظة: ومع ذلك، تجنب زيادة القدمصدمة قوة بسرعة كبيرة جدا، واستراتيجية السلوكية للحيوان أكد للغاية يمكن أن تنخفض إلى ردوده الهروب نقية. لذلك تراقب عن كثب سلوك وخصوصا الإختفاء استجابة في حين ضبط السعة من الولايات المتحدة. للحصول على مثال انظر الشكل 3E.
   15. إذا يظهر الحيوان CR، والتوقف عن تقديم CS فورا. هذا أمر بالغ الأهمية لتعزيز الاستجابة الإبطال.
   16. إذا اكتسبت الحيوانات استراتيجية تجنب، أي إظهار CR المناسب لجميع CS، تختلف المعلمات (ICMS السعة، ومدة المرحلة، ومعدل تكرار الخ) لإجراء التحليلات النفسية. تطبيق الاختلاف CS حدودي بطريقة blockwise مع الاقتران الولايات المتحدة، ولكن الذي سوف تحفز التعلم والتكيف.
       1. لتجنب هذا، وتبدأ مع 15-30 محاكمات التدريب الأصلي، ومن ثم عشوائيا نثر الاختلافات CS دون الولايات المتحدة باعتبارها تجارب الاختبار بين تجارب تدريبية منتظمة مع ال CS الأصلي. الحد الأقصى شSE 25٪ من المحاكمات الاختبار.
   17. بعد التدريب إزالة الحيوان من غرفة التدريب وتنظيف بعناية مربع كاملة قبل تدريب الحيوان المقبل. في محاولة لتجنب تدريب أنواع مختلفة في وقت واحد في نفس الخانة، ورائحة الطبيعية قد تتداخل مع أداء التدريب.
2. تحليل بيانات التدريب
   1. تسجيل جميع التغييرات حجرة في مرحلة التعود.
   2. تسجيل جميع التغييرات المقصورة خلال التدريب وتقسم إلى إصابات وإنذارات كاذبة، والهروب الردود (يخطئ والمكوكات مرة أخرى بعد انذار كاذب) والمكوكات intertrial عفوية (ITS).
   3. حساب معدلات CR لCS + وCS- على النحو التالي: معدلات ضرب = يضرب / عدد CS + المحاكمات؛ أسعار انذار كاذب = الانذارات الكاذبة / عدد من التجارب CS-.
   4. الحصول على أسعار CR جلسة الحكيم. ومع ذلك، لتقييم ديناميات التعلم في القرار الزماني العالي، وحساب معدلات CR من كتل أقصر من نفس العدد من CS + والمحاكمات CS- ( على سبيل المثال، ن = 10)، على التوالي.
   5. مؤامرة معدلات CR بوصفها وظيفة من جلسة أو كتلة محاكمة لتقييم ديناميات التقدم التدريب والتعلم.
   6. لتقدير لحساسية سلوكية مستقلة عن الظروف التجريبية يتحامل رد الحيوان، تستمد القيم د 'على أساس نظرية الكشف عن إشارة ^8،9،17.
   7. لد 'استخدام تحليل Z عشرات من المقابلة ضرب والإنذارات الكاذبة معدلات (التعلم التمييز) أو ضرب الأسعار وITS (التعلم الكشف) المستمدة من العكوس وظيفة التوزيع العادي موحدة وطرح هذه وعشرات من ض. وضع معيار الحد الأدنى للكشف عن التحفيز من د '= 1.0، والتي تتطابق مع قوة إشارة انحراف معياري واحد فوق الضجيج. انظر الشكل 3 كمثال.
   8. بالإضافة إلى تحديد CR-والهروب أوقات رد الفعل استجابة لمختلف CS عن طريق قياس الفترة الزمنية بين CS بداية والاستجابة السلوكية (حجرة كاملةتغيير).
   9. الحصول على التحليل السلوكي أكثر تفصيلا من بتصوير سلوك مكوك مربع. تحقيق التزامن الزمني بين أنظمة الفيديو وتسجيل عن طريق تسجيل النبضات الزناد من مربع المكوك أو نظام التحفيز على أثر الصوت من الفيديو. تحليل الفيديو يسمح للاهتمام تقويم وتوجيه استجابات الحيوان التي سبقت CR.

4. في تقنيات فيفو الكهربية في الحيوانات التعلم

1. تسجيل الكهربية أثناء التدريب
   1. خلال التدريب، وتسجيل إشارات الكهربية (على سبيل المثال، مع وصف ECoG صفائف) من أقطاب متعددة monopolarly ضد القطب مرجعية مشتركة / الأرض.
   2. إشارات تغذية من جميع الأقطاب في مكبر للصوت headstage إما مباشرة أو عن طريق توصيل محول القصير في موصلات الرأس.
   3. ربط headstage إلى مكبر للصوت الرئيسي عن طريق تسخير، الكابلات المرنة رقيقة ملفوفةبواسطة شبكة معدنية لحمايته من التلف عن طريق العض الحيوانات.
      ملاحظة: إجهاد في تسخير كابل يمكن أن يعفى من ربيع مزيد السماح بحرية حركة ودوران الحيوان في المربع. المثالي هو استخدام قطب تثرنبل والآلية. ومع ذلك، لتضع التجارب السمعية قطب خارج غرفة عازلة للصوت أو صوت حمايته مع رغوة للحد من الضوضاء عالية التردد السمعي التي تنتجها محركها.
   4. استخدام المضخم في مربع محمية لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء والفرقة تمرير تصفية الإشارة في نطاق التردد المطلوب.
   5. عينة البيانات في أكثر من 1 كيلو هرتز تردد أخذ العينات (لحقل المحلي التسجيلات المحتملة) وعلى الأقل 40 كيلو هرتز (للعمل التسجيلات المحتملة) وتخزينها في جهاز الكمبيوتر لتحليل غير متصل. استخدام إعدادات مرشح مناسب لكلا النوعين (على سبيل المثال 2-300 هرتز لإمكانات الميدانية المحلية، 300 - 4000 هرتز لإمكانات العمل).
   6. والتحقق من جودة للتسجيل بعناية قبل بدء رالسماء تمطر (أي ضجيج أو حركة القطع الأثرية). تطبيق على الانترنت الاتحاد الفرنسي للتنس فلتر للإشارة إلى تحديد السعة من 50 هرتز الضوضاء. إذا لزم الأمر انقر نقرا مزدوجا التحقق من كافة الاتصالات بين موصل الرأس، ومحولات، وheadstages، وتسخير كابل، ومكبرات الصوت.
   7. للحد من القطع الأثرية في البيانات المسجلة التي حركها التحفيز الكهربائي استخدام إجراء الاستيفاء لإعادة جميع نقاط البيانات التي تأثرت قطعة أثرية 1 مللي ثانية قبل حتى ~ 5 مللي ثانية بعد بداية كل نبضة. لهذا، إدراج الأصفار بين نقاط البيانات لم تتأثر، وتطبيق متماثل FIR مرشح أن يقلل من الأخطاء يعني مربع بين النقاط محرف والقيم المثالية الخاصة بهم (وظيفة interp.m مطلب ل). تطبيق هذا الإجراء إلى إشارة الخام، وحدة في كل قناة قبل إجراء مزيد من التحليل ^9.
2. التفاصيل الفنية للتدريب الموازي مكوك مربع، ICMS، وتسجيل
   1. بشكل عام، تأكد من أن الحيوانات تشعر بالراحة في surroundi مربعنانوغرام. السماح للحيوان على التحرك بحرية والوصول إلى كل ركن من أركان المربع. الوقت الكافي لروض قبل يوم من التدريب الأول (20 دقيقة)، وقبل كل دورة (3 دقائق) هو مفيد.
   2. بعد أي علاج جراحي، إتاحة الوقت الكافي الحيوان لاسترداد بما في ذلك الدواء إذا لزم الأمر (انظر أعلاه 2.17) والبدء في تدريب الحيوانات فقط، وإذا كانت الحيوانات لا تظهر أي علامات نموذجية من يعانون، أو الألم (عيون مغلقة، النمط الظاهري السبات العميق، والفراء ضيع ^20).
   3. ضمان التأريض الكهربائي السليم من الطابق الشبكة. ويجب تجنب الحلقات الأرض بين نظام التسجيل، مكوك مربع والحيوان. الأرض الحيوان فقط عبر القطب أرضية مشتركة لها، وترك gridfloor في الجهد العائمة.
   4. ربط مشجعا متعددة (MCS STG2000) بموصل رئيس زرع مجموعة التحفيز الكهربائي عبر خطوط منفصلة للقطب الآلية.
   5. استخدام القطب الأرض مشترك من تسجيل مثل الأرض أو العودة الكهربائي لICMS، كذلك.

5. تحليل النسيجي من المراكز الكهربائي

1. بعد مجموعة التدريب الكامل، والسيطرة على الموقف المستقر للمجموعة التحفيز الكهربائي عن طريق التحليل النسيجي.
2. تخدير الحيوانات مع حقن الملكية الفكرية من خليط من الكيتامين (100 ملغ / كلغ) وزيلازين (5 ملغ / كلغ) المخفف في 0.9٪ معقم الصوديوم كلوريد. ثم تطبيق التيار الكاثودية القطب (30 أمبير لمدة 60 ثانية) المقدمة من خلال جميع قنوات التحفيز للحصول على ودائع الحديد في الأنسجة في موقف زرع ^8.
3. وبعد هذا الإجراء، التضحية الحيوانية طريقة مناسبة وافق القتل الرحيم (مثل حقن داخل الصفاق من جرعة زائدة من بنتوباربيتال و 100 ملغ / كلغ).
4. إزالة دماغ الحيوان فورا وتجميده في 2-methylbutane تبريده الى -70 درجة مئوية في النيتروجين السائل.
5. الآن قطع المنطقة من الفائدة على مشراح ناظم البرد إلى 50 ميكرون حأقسام orizontal.
6. الأنسجة: نيسل و "بروسيا الأزرق" -staining
   1. لتحديد الطبقات القشرية علاج كل شريحة الثانية مع نيسل تلطيخ. لأول مرة، والاستحمام شرائح 5 دقائق في 0.05 M الصوديوم العازلة خلات هيدرات (الرقم الهيدروجيني 4.0 -4.2).
   2. يستحم شرائح ل5-10 دقيقة في 5٪ الكريزيل البنفسجي خلات. شطف شرائح مع الماء المقطر.
   3. يستحم شرائح لمدة 2 دقيقة على التوالي في 0.05 M الصوديوم العازلة خلات هيدرات (درجة الحموضة 4،0-4،2)، وحلول من 50٪، 70٪ و 90٪ من الإيثانول، على التوالي.
   4. يستحم شرائح مرتين في الأيسوبروبانول: 96٪ من الإيثانول (2: 1) لمدة 5 دقائق لكل منهما.
   5. وأخيرا، والاستحمام شرائح في Roticlear ثلاث مرات لمدة 5 دقائق.
   6. الحصول على موقع قنوات التحفيز عن طريق "بروسيا الأزرق" -staining من كل شريحة أخرى أن يجعل ترسب الحديد التي حركها التيارات الطور طويلة بعد التجارب مرئية.
   7. يعد حل جديد من 1٪ hexacyanoferrat البوتاسيوم (II) هيدرات K ₄[الحديد (CN) _6] عن طريق خلط 2 غرام من K ₄ [الحديد (CN) _6] في 200 مل من 1٪ حمض الهيدروكلوريك.
   8. إضافة 800 مل من 0.1 M العازلة الفوسفات (7.4 درجة الحموضة).
   9. يستحم شرائح الدماغ لمدة 10 دقيقة مع الماء المقطر، ثم لمدة 10 دقيقة في حل hexacyanoferrat.
   10. يستحم شرائح مرتين لمدة 10 دقيقة في المخزن الفوسفات 0.1 M وأخيرا لمدة 5 دقائق في الماء المقطر.

يوضح هذا القسم مثالا نموذجيا للتعلم مكوك مربع في يربوع المنغولي. تم تدريب تخضع لتميز الموقع ICMS بين قطبين التحفيز مزروع 700 ميكرون بعيدا عن بعضها البعض في القشرة السمعية (الشكلان 1 و 2). صفائف التحفيز يمكن تخصيصها في التصاميم المكانية المختلفة (الشكل 1). هنا، وتعلم التمييز المواقع ICMS اثنين في غضون 3 دورات تدريبية مع عرض 30 CS + وCS- كل (الشكل 3A-C). ويدل على ذلك فرقا كبيرا مستقر معدلات CR من ضرب وانذار كاذب ردود طوال 7 دورات تدريبية متتالية (الشكل 3B). في المقابل، د "هو> 1 في هذه الدورات (الشكل 3C). الإختفاء الهروب سريعة تجاه الولايات المتحدة هي الأساسية، كما أنها تعكس استجابة فعالة من دون شروط مكره. وهذا يمكن أن تكون مضمونة عن طريق تكييف القدم قوة الصدمة من 200 &# 181؛ A في 50 أمبير الخطوات حتى الإختفاء الهروب هم قصيرة (انظر الشكل 3 E). في موازاة ذلك، التسجيلات الكهربية من ECoG مصفوفة تسمح لتقييم أنماط التنشيط الزمانية المكانية الخاصة بالموقع التي حركها intracortical الكهربائية CS + أو CS- في مواقع التحفيز مفصولة ~ 700 ميكرون (الشكل 4).

الشكل 1. تصاميم مجموعة الكهربائي. (A) مجموعة العمق (2 × 1) لmicrostimulation intracortical في موقعين مختلفين في القشرة. يتم ترتيب الأقطاب الكهربائية على مسافة interelectrode من ~ 700 ميكرون. ويمكن لتصاميم مكانية أخرى تسمح تعتمد على طبقة المحلي ICMS في أعماق القشرية المختلفة أو صفائف الجانبية مع مواقع التحفيز على طول محور معين من الأنسجة القشرية، كما على سبيل المثال التدرج التوضع النغمي من القشرة السمعية ^8. (B) فوق الجافية المعالمجموعة م (3 × 6) للتسجيل من مخطط كهربية قشر الدماغ في قرار مكانية عالية. وأدلى الأقطاب الكهربائية من أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ (Ø 256 ميكرون) مرتبة في مصفوفة 3X6 مع مسافة interelectrode من ~ 600 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. تحديد المواقع من زرع التحفيز وتسجيل الأقطاب. (A) زوج من قطبين التحفيز (انظر الشكل 1A) يتم زرعها S1 (الأخضر الداكن) وS2 (الضوء الأخضر) في عمق الحق الأساسي مجال السمعي AI بالقرب من طبقة المدخلات IV. يمكن وضعه نصائح الكهربائي على طول محور rostrocaudal (S1 الذيلية الكهربائي، منقاري القطب S2) مع مسافة interelectrode من ~ 700 ميكرون. تسجيل 3 × 6 ECoGمجموعة (600 ميكرون مسافة interelectrode) يتركز epidurally أكثر من حق منظمة العفو الدولية. (B) نيسل الملطخة القسم الأفقي للمنطقة في الدماغ منها بعد يبين الإجراء التجريبي اثنين من الآفات الصغيرة (الأسهم)، والتي كان سببها نصائح من اثنين من أقطاب التحفيز مزروع مشيرا إلى موقعها داخل القشرة الزمنية. موقف يمكن تقييمها بمزيد من "البروسي الأزرق" تلطيخ. تم تعديل هذا الرقم من Deliano وآخرون، 2009. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3. المكوك المربع بيانات التدريب وتحليل حيوان فرد واحد. (A) المخطط على اليمين وصف التصميم مهمة لCS + والمحاكمات CS- في اتجاهين discriminati مكوك مربععلى المهمة والنتائج السلوكية. منحنيات (B) تعلم تآمرت كما ضرب والإنذارات الكاذبة معدلات الدورات التدريبية الفردية. يتم وضع علامة فروق ذات دلالة إحصائية بين ضرب ومعدلات انذار كاذب من قبل العلامات النجمية (الألعاب هويل الاختبار، ف <0.05). مؤشر د "(C) حساسية> 1 (انظر 3.2.7) يمكن استخدامها كمعيار للتمييز عتبة النجاح. (D ) مراقبة المعابر عفوية خلال مرحلة التعود تظهر عادة انخفاضا خلال الجلسات. (E) الإختفاء الاستجابة أثناء يتم رسم المحاكمات + CS عن التجارب الفردية على جميع الدورات التدريبية. جميع الردود مع الإختفاء أقل من 6 ثانية تتوافق مع ردود ضرب الناجحة. لاحظ الإختفاء الهروب أطول في النصف الأول من الدورة الأولى. بعد زيادة انخفضت صدمة القدم الإختفاء قوة الهروب أقل من 2 ثانية بعد بدء الولايات المتحدة تشير إلى السيطرة صدمة كافية. وbimod رسوم بيانية (الشكل الأيمن) من الإختفاء استجابةآل المقابلة لضرب الردود (<6 ثانية) والهروب الردود (6-8 ثانية) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4. تسجيل الكهربية الموازي في حيوان التعلم. (A) مثال نموذجي لأثار كهربائيا المحتملين (EEP) من حيوان واحد في المتوسط ​​عبر CS + المحاكمات في جلسة واحدة من التدريب. تم تسجيل البيانات من EcoG مصفوفة. يقارن هذا الرقم التتبع EEP قبل (أسود) وبعد (أحمر) إزالة واحدة التحف نبض التحفيز. تفاصيل للحد من القطع الأثرية انظر القسم 4.1.7. يمكن أن ينظر إليه في وقت مبكر ذروة سلبية بارزة في الكمون من 20 مللي ثانية (N20). (ب) مواصلة تحليل التوزيعات المكانية من السعة N20 ردا على CS + تي فيانه منقاري القطب التحفيز (أعلى) وإلى CS- في القطب التحفيز الذيلية (القاع) كشف التحليل المكاني للدول أثار في جميع أنحاء القشرة السمعية. يشار إلى الاتجاهات التشريحية النسبية لمجموعة التسجيل عن طريق السهام (د، الظهرية، ج، الذيلية؛ ل، الأفقي؛ م، وسطي، ص، منقاري، الخامس، بطني). تم تعديل هذا الرقم من Deliano وآخرون، 2009. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

يصف هذا البروتوكول وسيلة لICMS في مواقع محددة في وقت واحد والتسجيلات الكهربية متعددة القنوات في حيوان التعلم باستخدام مكره القدم صدمة نظام التحكم مكوك مربع في اتجاهين. ويؤكد البروتوكول المفاهيم الأساسية التقنية لمثل هذا الجمع ويشير إلى أهمية التأريض الحيوان فقط عبر القطب أرضية مشتركة لها، وترك gridfloor في الجهد العائمة. هنا، تم تطبيق التعلم السمعي مكوك مربع لالجربوع المنغولية حيث تم دراسة إعادة التنظيم البلاستيك ذات الصلة التعلم من القشرة السمعية في هذه الحيوانات على نطاق واسع ^{8،12،14،15،21،22.} ومع ذلك، يمكن تكييفها بروتوكول صفها مع تغييرات طفيفة على أنواع القوارض الأخرى، وبالنسبة للفئران المثال ^16. في هذا الصدد، من المهم للنظر، وارتفاع العقبة (2.1.1)، وحساسية القدم صدمة الحيوانات الفردية، والتي يمكن HIG أنواع محددة التعديلات المتعلقة الانتعاش مرة بعد الجراحة (2.17)HLY متغير (3.1.3-3.1.6).

يعطي بروتوكول مزيد من تفسيرات مفصلة عن كيف يمكن استخدام القطب تصاميم حسب الطلب لتحفيز مواقع مختلفة في الأنسجة القشرية مما يؤدي إلى التنشيط شبكة متميزة مستمدة من تحليل المتزامنة التسجيلات multielectrode الكهربية ^8،23. اعتمادا على المسافة من الأقطاب الكهربائية واحدة يمكن أن تحفز مناطق مختلفة من على سبيل المثال الخرائط الطوبوغرافية ^9. من خلال تطبيق تعتمد على طبقة ICMS فمن الممكن لتنشيط تفاضلي بعيدة المدى توقعات corticocortical مما يؤدي إلى المزيد من التنشيط واسعة الانتشار من القشرة عن طريق التحفيز في طبقات إدخال القشرية III-IV. بدلا من ذلك، أدى التحفيز في طبقات الانتاج قشري صادر V-VI إلى تفعيل أكثر الوصل الكثير من intracortical والقشرية المهادية الدوائر ردود الفعل ^8. عند استخدام المصفوفات التحفيز مع اثنين أو أكثر من أقطاب التحفيز، ثنائي القطب ICMS يمكن تطبيقها بدلا من القطب ICMS. وهناك طريقة التحفيز القطبين أكثرتجند بشكل فعال الألياف العصبية مواز للنصائح الكهربائي، ويفضل أن يكون في اتجاه القطب الكاثودية مقارنة مع الألياف غير متوازي ^24. مثل هذا التكوين التحفيز وبالتالي يزيد من خصوصية الاتجاه من التنشيط شبكة العصبية أثار ^8. هذه المناورات معينة مباشرة لأنشطة الشبكة sublaminar القشرية باستخدام ICMS ^8،9، وحتى الآن لم يتضح من أي تقنية أخرى ^3. وكمثال على قوة هذه الطريقة، تداعى تقرير صدر مؤخرا مساهمة-القشرة مهادية قشرية الدوائر ردود الفعل لتصور باستخدام التعلم الكشف عن المحفزات الكهربائية intracortical ^8. هذا يدل على أن microstimulation القشرية المباشر هو وسيلة فعالة وللدولة من بين الفن لسببيا النشاط الرابط في الدوائر العصبية المحددة والسلوك ^{1،3،11،25.} من خلال التحفيز الكهربائي المحلي في المناطق القشرية الموافق ميزات محددة خريطة طبوغرافية، أما بالنسبة انستتعصب منطقة التوضع النغمي في القشرة السمعية، والموضوعات يمكن تدريب في نماذج التعلم نقل للمقارنة بين خصائص التعاليم التي تسببها المركزي الكهربائية أو الطرفية الحواس. مثل هذه التجارب قد تحفز تطوير استراتيجيات التحفيز للneuroprostheses القشرية الحسية ^5،9. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول في التحفيز الكهربائي للمناطق الدماغ الأخرى، وعلى سبيل المثال منطقة السقيفية البطنية، لدراسة معالجة الثواب والأسس العصبية من التحفيز العميق للدماغ ^26. حاسمة لmicrostimulation فعالية العديد من التفاصيل الفنية التي يجب مراعاتها على خلفية الإعداد الفردي والأقطاب الكهربائية المستخدمة. بشكل عام، مثل السعة التحفيز، والاستقطاب، والتوجه القطب، وما إلى ذلك، تم استعراض تأثير المعلمات التحفيز ^11،24. من الأهمية هو نقل التهمة القطب. مقاومة للإلكترود بالتالي يشكل عاملا حاسما. وبالتالي، تأكد رانه مقاومة للاتصالات القطب هو في حدود أوم قبل الزرع.

عدة ظواهر إضافية للتعلم يمكن دراستها من قبل الاختلاف المناسب من التصميم الأساسي وصفها. على سبيل المثال، والتمييز التعلم على النقيض من التعلم كشف بسيط يمكن التحقيق من خلال إدخال اثنين على الأقل من المحفزات التي يجب أن تترافق مع الذهاب وnogo الردود على التوالي ^14،15. وبالمثل التعلم تشكيل فئة يمكن دراستها عن طريق الجمع بين هذا التمييز النماذج ^12،21. كما يمكن استخدام النماذج مكوك مربع للتحقيق في الذاكرة العاملة، وتثبيط السلوك والمرونة الإدراكية كما على سبيل المثال اللازم لانعكاس ناجح تعلم ^14،17 أو مجموعة متغيرة. يمكن تقييم عمل الذاكرة بمقارنة 'تأخير' وتكييف "أثر". في "تأخير" تكييف ^27، وقدم CS في جميع أنحاء CS-الولايات المتحدة النافذة وقت حرج دون تأخير بين CS لfset والولايات المتحدة بداية. في تكييف "التتبع"، من ناحية أخرى، هناك تأخير لعدة ثوان بعد إزاحة العرض CS عابر. في المقابل إلى "تأخير" تكييف تكييف "التتبع" يضع عبئا كبيرا على عمل الذاكرة والمعالجة القشرية. الجمع بين التمييزية نماذج التعلم مكوك مربع مع ​​تحليل أنماط الزمانية المكانية في مخطط كهربية قشر الدماغ المستمر، هو وسيلة مناسبة لتحديد الدول الديناميكية من القشرة السمعية المتصلة بالتمييز التحفيز ^9، وفئة تشكيل ^21. لكن، وكما يستخدم التدريب مكوك مربع الكلاسيكي كما في اتجاهين مهمة الابطال، المشاكل المفاهيمية العامة مع التعلم تجنب لا ينطبق على كل من هذه التصاميم السلوكية. أي أن سلوك التهرب الناجح يمنع صراحة وقوع التحفيز التي هي بمثابة معزز. تعزيز مشهي، على سبيل المثال عن طريق التحفيز الكهربائي المباشر للدوائر مكافأة الدماغ المتوسط، ويحتوي النحل الوحيدن تطبيقها على المكوك مربع التعلم في بعض الدراسات ^26. أيضا، بصورة رئيسية استخدمت التعلم مكوك مربع مع أنواع القوارض ونادرا ما يتم تطبيقها عند حيوانات المختبر أكبر، كما للكلاب المثال.

وإلى جانب مع تحليل الكهربية، والتعلم مكوك مربع يمكن زيادة جنبا إلى جنب مع التدخل الدوائي ^8،17، وتقنيات آفة ^15، microdialysis ^28، أو optogenetics. خصوصا مزيج من بروتوكول لدينا مع أدوات optogenetic، إما عن طريق العدوى الفيروسية من النظام النموذجي (أي الجربوع المنغولية)، أو عن طريق الحيوانات المعدلة وراثيا، والفئران، وسيسمح لزيادة ولا سيما خصوصية النمط الفرعي الخلوية الاصطناعي تنشيط الخلايا العصبية بما في ذلك القشرية كبت، والتي لا يمكن الوصول إليها باستخدام ICMS ^3.

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

وأيد العمل من المنح المقدمة من دوتش للبحوث DFG وللمعهد ليبنيز لعلم الأعصاب. نشكر ماريا مارينا Zempeltzi وكاترين OHL للحصول على المساعدة الفنية.