Assay גיבוש Mammosphere משד אדם סרטן רקמות וקווים סלולריים

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

בדומה לרקמות בריאות, רב דם ומחל ממאירות סולידיות עכשיו חשבו להיות מאורגן באופן היררכי, עם תת-קבוצה של תאי סרטן כמו גזע שעצמי לחדש-בזמן והוליד צאצאים מובחנים יותר. הבנה ומיקוד תאים אלה גזע סרטני בסרטן השד, אשר עשוי להחזיק chemo- משופר והרדיו-התנגדות בהשוואה לגידול בכמות גדולה אינו גזע, הפכה אזור חשוב מחקר. סמנים כוללים CD44, CD24, ופעילות ALDH ניתן להעריך באמצעות תא קרינה המופעל מיון (FACS) כדי לבודד מכאן ולהבא תאים המציגים tumorigenicity משופר כאשר מושתלים לעכברי מדוכאי חיסון: גם assay mammosphere הפך בשימוש נרחב ביכולתה לזהות sphere- למפרע יצירת תאים המתפתחים משיבוטים כמו תא גזע בודד. כאן אנו מתארים גישות לculturing המתאים של mammospheres משורות תאים או דוגמאות מטופל עיקריות, passaging, וחישובים להעריך f תחוםיעילות orming (SFE). ראשית עלינו לדון בשיקולים מרכזיים ואת חסרונות בתכנון ובפרשנות של ניסויי mammosphere המתאימים.

קיומם של שושלות תאים הסרטניים בראשותו של תאי גזע סרטני כמו גזע הוסיף רב להבנת ההטרוגניות גידול שלנו. בעוד קצת גיוון פנוטיפי בגידולים אין נובע מהתולדה המשובט של שיבוטים גנטיים שונים, רכיב מהותי מופיע לנבוע מהבדלים אפיגנטיים: תאים סרטניים יכולים לעבור (לפעמים הפיך) בין גזע, אב, ומדינות מובחנות באמצעות הפעלה או דיכוי של גן ספציפי תוכניות ביטוי ^1-3. זה עשוי לשקף גורמים פנימיים או חיצוניים תא, המשקף את תכנית ביטוי גנים בימים אלה באים לידי ביטוי בתא עם איתות autocrine התוצאה שלה בשילוב עם המנגנון פאראקריני משכנות סרטן, סטרומה או תאי מערכת חיסונית ומספק גורמי modulatory, ותנאי microenviromental כגון מידת היפוקסיה ^2,4,5.

למרות גישות שושלת התחקות חדשניות מתקדמים את היכולת שלנו ללמוד תאי גזע סרטני משוערים בנישה שלהם in vivo ^6-8, מבחני יוצרי תחום להישאר גישה פופולרית ונוחה להעריך את הפוטנציאל של תאי סרטן השד להתנהג כמו תאי גזע, לפחות בתנאי assay בשימוש. הוא משמש לעתים קרובות לצד שיטות רטרוספקטיבית לתאי גזע סרטני טיהור, על ידי הביטוי שלהם CD44 סמני קרום ו ^-9 CD24, ורמת הפעילות של ALDH (dehydrogenase אלדהיד) האנזים ^10, סמנים שהוצעו למתאימים ליותר mesenchymal- ואפיתל תאי גזע סרטני דמויים בהתאמה ^11. גישת היווצרות הכדור פותחה לראשונה כassay neurosphere, מה שמאפשר את הצמיחה של תאי גזע המשוערת משיבוטים בודדים בתנאים שאינם חסיד, סרום חופשיים עם התוספת של גורם גדילת אפיתל (EGF) ^12, לאחר מכן מיושם מועיל למצב נורמלי וסרטני רקמות שד.

ss = "jove_content"> הזהות של תא מייסד יוצרי תחום, וסוגי התאים המעורבים המרכיבים את מסת הכדור, רלוונטיים למסקנות שיכולות להיות עשויה מmammo-, או-תחום אחר להרכיב מבחני. תאים לטווח ארוך עצם שקט בתום גזע, חשבו לנוח בשלב G0, לא תוכל לחוות את השילוב המדויק של גורמים שהיה מעדיפים הפעלה in vivo. Assay mammosphere במקום מאפשר את הצמיחה של תאים או בכוננות חלוקת mitotic או שכבר חילקו ^13. אבות אלו, אם כי לא תא באמת שקט, עשויים להיות שלב התא שמתרבה עם mitogens EGF וגורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF) המשמשת בassay. אף על פי כן, הם מכילים מגוון של האיתות הקשורים בתאי גזע מופעל מסלולים ^מ-14. בנוסף, קצב היווצרותם מתייחס לtumorigenicity של הרקמות שנלקחו מ, כשהיא נמדדת בעצמה שלהם במבחני דילול מוגבלים בxenografts עכבר ^{2,15,16 <}/ Sup>.

כאן אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים לבודד תאים בודדים וליצור mammospheres עיקרי משני קווים אנושיים סרטן שד תא ודגימות קליניות של גידולים בשד. אנו גם מתארים כיצד לבצע קטעים סידוריים של mammospheres העיקרי להעריך התחדשות עצמית, וכיצד לחשב תחום יצירת יעילות המאפשרת השוואה בין צפיפות זריעה שונה (ראה תכנית באיור 1).

ההנחיות המפורטות להלן אושרו על ידי אתית אימפריאל קולג ', לונדון.

1. דור של Mammospheres הראשוני משורות תאי סרטן שד האנושי

הערה: בצע את השלבים הבאים מתחת למכסת מנוע תרבות סטרילית.

1. הכן Mammosphere מדיה המכילה DMEM / F12 בתוספת L- גלוטמין 2 מ"מ, 100 U / ml פניצילין, 100 U / סטרפטומיצין מיליליטר. הכן תקשורת מלאה מייד לפני השימוש על ידי הוספת 20 גורם ng / ml רקומביננטי צמיחת אפידרמיס האנושי (EGF; Sigma), 10 ng / ml גורם רקומביננטי אדם בסיסי צמיחת פיברובלסטים (bFGF; מערכות R & D) ותוספת 1x B27.
2. תקשורת לשאוב מבקבוק המכיל MCF-7 או מד"א MB-231 תאים חסיד (או שורת תאי סרטן השד על פי בחירתך; 70-80 מפגש%), לשטוף פעמיים ב1x PBS, וtrypsinize תאים.
3. תאי צנטריפוגה XG 200 בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. תאי supernatant ו resuspend למזוג ב1-5 מיליליטר של תקשורת mammosphere. פיפטהלמעלה ולמטה ואם יש צורך להשתמש במסנן כובע מסננת תא 40 מיקרומטר להשיג השעיה תא בודד. השתמש hemocytometer כדי להבטיח השעיה תא בודדת יצרה (אם לא, השתמש מחט 25 G למזרק ההשעיה התא עד 3 פעמים).
4. אם CD44 בודד הצורך + CD24- משנה סלולארי באמצעות FACS באמצעות אנטי CD24-Phycoerythrin (PE) ואנטי-CD44-והעמסת isothiocyanate (FITC) נוגדנים חד-שבטיים ^9. לחלופין, לבודד אוכלוסייה כגון באמצעות תא-מגנטי הופעל מיון מערכת (MACS) עם אנטי CD44 וmicrobeads המשולב אנטי CD24 ביוטין לפי הוראות יצרן. לבצע סלקציה חיובית באמצעות LS עמודות, וסלקציה שלילית באמצעות עמודות LD ולאשר את פנוטיפים של כל התאים המבודדים על ידי cytometry זרימה ^17.
5. לחשב את מספר תאי קיימא לכל מיליליטר באמצעות trypan כחול.
   הערה: כדאיות תא מחושבת כמספר תאי קיימא מחולקים במספר הכולל של תאים בתוך הרשתות על hemocytometer. תאים שתופסים trypan כחול נחשבים לא-קיימא. ההליך הבא משמש כדי לקבוע שיעור של תאי קיימא בצורה מדויקת.
   1. הכן פתרון 0.4% מtrypan הכחול בPBS. להוסיף 0.1 מיליליטר של פתרון מניות trypan הכחול עד 1 מיליליטר של תאים. לטעון hemocytometer ולבחון באופן מיידי תחת מיקרוסקופ בהגדלה נמוכה. לספור את מספר התאים כולל ומספר תאי כתמי כחולים.
      תאי קיימא = [1.00 - (מספר התאים הכחולים ÷ מספר התאים כולל)] × 100.
   2. כדי לחשב את מספר תאי קיימא לכל מיליליטר של תרבות, השתמש בנוסחא הבאה. זכור לתקן את הגורם לדילול.
      מספר תאי קיימא × 10 × ⁴ = 1.1 תאים / מיליליטר התרבות
6. Resuspend סכום שנקבע מראש של תאים ב 2 מיליליטר של תקשורת mammosphere מלאה בכל טוב של צלחת חסיד 6-גם נמוכה במיוחד. צפיפות הזריעה היא בדרך כלל 500-4,000 תאים / ² סנטימטר תא בכל טוב. lo שימוש אופציונלי24 גם צלחות מצורפים w תוך זריעת תאים באותו הצפיפות ב 0.5 מיליליטר של תקשורת.
   הערה: אנו ממליצים אופטימיזציה של צפיפות זריעה ושעה של תרבות לכל שורות תאים של עניין.
7. דגירה 6-גם צלחות נמוך במיוחד קובץ מצורף על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ למשך 5-10 ימים (בהתאם לקו התא ואת גודל mammospheres) מבלי להפריע לצלחות, במיוחד בשלב הצמיחה של 5 הימים הראשונים .

2. דור של Mammospheres הראשוני מדוגמאות קליניות לסרטן השד האנושי

ניתן להשיג רקמת סרטן השד אנושית מחולים שעברו ניתוח להסרת גידולים בשד: הערה. רקמת חנות על קרח למשך עד 24 שעות בצינורות סטרילי 50 מיליליטר בתקשורת ובתרבות המכילות 100 U / ml פניצילין ו -100 U / ml סטרפטומיצין. בצע את השלבים מתחת למכסת מנוע תרבות סטרילית הבאים.

1. להעביר את המדגם לתוך צלחת פטרי רקמות 100 מ"מ עם נפח קטן של תקשורת. Removדואר רקמת שומן באמצעות מספריים, scapel ופינצטה סטרילית.
2. להוסיף 2-3 מיליליטר של DMEM / F12 וברר את המדגם לתוך 1 מ"מ ³ חתיכות עם scapel סטרילי או סכין גילוח עד שלא יישארו חתיכות גדולות.
3. Resuspend חתיכות רקמה במראש חימם DMEM 10 מיליליטר המכיל אנזימי מפרקי חלבונים (3000 U / collagenase מיליליטר ו -1000 U / hyaluronidase מיליליטר) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס שייקר סיבובי עד שכל שברי הרקמה מתעכלים. בדרך כלל עיכול שלם לוקח בין 1-3 שעות. התאם את זמן עיכול על פי תווים פתולוגית של גידולים. (לדוגמא אדנוקרצינומה השד היא בדרך כלל קשה יותר לעיכול בהשוואה לקרצינומה רִירָנִי שהוא שביר יותר וזקוק לזמן עיכול קצר יותר). להעריך את מידת העיכול בכל שעה וחצי על ידי התבוננות 20 השעיה μl תחת hemocytometer.
4. לאפשר לברים למשקעים במשך 5 דקות, ולאחר מכן להעביר את supernatant בצינור חרוטי 15 מיליליטר פוליפרופילן צנטריפוגות ב XG 200 עבור 10 דקות ב TEM החדרperature. למזוג בזהירות את תאי supernatant ו resuspend ב 1 - 5 מיליליטר של תקשורת mammosphere.
5. בצע את השלבים שתוארו לעיל 1.1-1.4 לשורות תאים להשיג וצלחת השעיות תא בודדות. עובר תאים דרך 25 G מזרק מרבי של פי 2 במידת צורך להגביל תאי נזק.

3. Mammosphere יצירת יעיל (%) חישוב

1. לאחר תקופת התרבות, לספור את mammospheres (יותר מ 40 מיקרומטר) קוטר תחת מיקרוסקופ בהגדלה 40X. תמונה דיגיטלית 5 שדות אקראיים באמצעות מצלמה דיגיטלית במיקרוסקופ אור ולקבוע את גודל mammospheres באמצעות תוכנת הרכישה. השתמש בכל תמונת ניתוח תוכנה.
2. חישוב יעיל Mammosphere יצירת (% MFE) באמצעות המשוואה הבאה:
   MFE (%) = (# של mammospheres לכל טוב) / (# של תאי זרע בכל טוב) x 100

4. Passaging הסידורי של Mammospheres להערכה של התחדשות עצמית

1. פיפטה מדיה המכילה mammospheres מכל טוב לתוך צינור 15 מיליליטר. לשטוף את הבארות עם PBS ולהוסיף לתקשורת שנאסף. צנטריפוגה ב 115 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר.
2. בטל supernatant ו resuspend גלולה ב 500 μl של 0.5% EDTA טריפסין / 0.2% מראש חימם. דגירה במשך 2-3 דקות.
3. הוסף 500 μl של FCS לנטרל טריפסין. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות. בטל supernatant וגלול גלולים בתקשורת של mammospheres, pipetting עד 100 μl ולמטה כדי disaggregate תחומים.
4. ספירת תאים עם hemocytometer ולקבוע אם תאים בתרחיף תא בודד. אם לא תעבור דרך 25 G מזרק עד 3 פעמים כדי להשיג תאים בודדים. זרעי התאים לתוך צלחת אולטרה חדשה נמוכה מצורף 6-גם באותו הצפיפות בשימוש בדור העיקרי.
5. לאחר 5-10 ימים, לספור תחומים> 40 מיקרומטר ולחשב את יעילות יוצרי תחום שימוש בנוסחא דווחה בעבר.

מדגמים שונים או אלה נתון לטיפולים שונים עשויים להשתנות במספר mammospheres> 40 מיקרומטר היוצרים לאחר נרמול לתאים ראשוניים שנזרעו. לחשב את יעילות mammosphere להרכיב (MFE) עבור כל טיפול גדל בשלושה עותקים. זה מאפשר ניסויים עם צפיפות זריעה שונה להשוואה. הנתונים מוצגים הטוב ביותר בגרף עמודות, באופן אידיאלי עם בקרות חיוביות ושליליות, ובו מוצגות סטיית התקן פני הבארות בשלושה עותקים. באופן עקבי להעביר תאים חסיד לתוך צלחות שאינן חסיד במפגש בין 60-80%. ספירת תאים זהירה היא חיונית לכימות במדויק את ההשפעות של טיפולים. להעריך את מידת ההשתנות שצעד מפתח זה תורם לתוצאות שלך על ידי הכנת השעיות מרובות בנפרד מאותו הטיפול טוב. אם ריכוז התא נמדד שונה באופן משמעותי מאותו היטב, לשקול לצמצם את הגישה שלך ספירה (איור 2).

איור 2: תוצאות נציג של mammospheres נוצר מאסטרוגן החיובי אפיתל (MCF-7), וnegati משולש mesenchymalve איחוי תאים מינימליים (מד"א MB-231) שורת תאים. / צבירה הושגה על ידי ציפוי בצפיפות נמוך, כאן ב -500 תאים / ² סנטימטר על MCF-7, ו1,000 תאים / ² סנטימטר למד"א MB-231.

הערכה מוצלחת של mammospheres הראשוני והמשני מסתמכת על תאים שמצופים בצפיפויות נמוכות מספיק שmammospheres צורה משיבוטים אחד, עם צבירת תחום מינימאלית. עם זאת בצפיפויות נמוכות מדי, מעט מדי mammospheres עלול להיווצר להבחין את ההשפעות של טיפולים סטטיסטיים. צפיפות זריעה צריכה להיות מותאמת לשורת תאים כל שימוש שכן הם יכולים להשתנות במידה ניכרת ביעילות תחום יצירתם (אלה מבטאים E-cadherin הנמוך עלולים להיווצר תרבויות mammosphere טווח פחות יציבים וקצרות ^18). שלב אופטימיזציה זו צריך להבטיח רוב תוצאות היווצרות כדור ראשוניות ומשניים מהצמיחה המשובט של תאים בודדים. ציפוי תא אחד לכל גם הוא הדרך היחידה להבטיח היווצרות mammosphere משובט לחלוטין, ויכול להיות מומלץ לכימות שיעורי התחדשות העצמית / בידול של דגימות טריות נגזרות ^13. עם זאת, גישה זו סובלת גם מגורמים שמסבך: mammosphere יוצריםיעילות של 1% תניב mammosphere אחת בלבד לכל צלחת 96-היטב, ויעילות יכולה לזלזל עם פחות mammospheres מתהווה בהיעדר גורם גדילה אוטוקריני איתות בין תאים מושעים. לבסוף, בתדירות של תחומים משניים לאחר passaging יכולה להעריך רמות של התחדשות עצמית, ויעילות גבוהה יותר של משנית מאשר היווצרות כדור העיקרית צריכה להיות צפויה אם באמת בחירה לתאים עם תכונות תא גזע סרטני. Reaggregation היא בעיה מסוימת בגזירת התחומים משניים וצפיפות תא תא מהסוג מתאימה מאוד נמוכה צריכים להיות מותאמים לכיוון.

הזמן שלוקח לmammospheres לגדול ל> 40 מיקרומטר גם ישתנה, וmammospheres מדגימות קליניות ייתכן שיהיה הצורך לספור בין 5-12 ימים, תלויים במהירות צמיחת התחום. צבירה ושילוב של תחומים באופן בלתי נמנע מתרחש עקב תנועה טבועה של תאים סביב התקשורת, אבל התהליך נראה משופר באופן משמעותי על ידי לשעברperimenters נע הצלחות בשלב הצמיחה ^19, יש להימנע משהו לכן.

בעוד תחומים רבים נחשבים באופן שיגרתי למגיעים מתאי גזע עם קיבולת replicative לטווח ארוך גבוהה יותר יש להתייחס הנחה זו בזהירות. תחומים גדולים יותר עשויים לשקף את יכולת השגשוג של תאי אב, ההיענות לגורמי גדילה, או להיות תוצר של צבירה או היתוך. שני תאי הגזע ותאי בת ההגברה המעבר שלהם הם מסוגלים לתת עלייה לmammospheres ^20, אם כי בתדירות המשולבת של שני סוגי התאים, עדיין עשויה לשקף tumorigenicity של רקמת המקור.

Assay mammosphere מוגבל על ידי כישלון כדי ללכוד את המורכבות של יצירת תאי גזע סרטני והתנהגות בנישה שלהם in vivo. באמת להעריך את הטווח הארוך במבחנה ובהתחדשות עצמית vivo והתמיינות של תאי גזע של סרטן השד מבודד מכאן ולהבא, mammoולכן צריכים להתבצע באופן אידיאלי מבחני תחום בשיתוף עם מעקב שושלת וניסויים השתלה שלא מבן-מינה. בעוד מעקב שושלת מסתמך על סמנים המשקפים במדויק את קבוצת המשנה של תאי גזע הסרטני, שהם מאוד נהנים משמירת in vivo התנאים שתורמים להיווצרות הדינמית של תאים 'בתום עצם' גזע סרטני. הערכת היווצרות גידול בניסויים בעכברי xenograft מדוכאי חיסון תספק גם רכיבי נישה רבים חסרות מבחני mammosphere, ועדיין חסרות מרכיבים חיסוניים וסטרומה אנושיים ^21. למרות שיותר תובעני מבחינה טכנית, טכניקות אלה צריכים להיות ניסיון לאור מאפייני תא גזע של סרטן השד וtumorigenicity שלם יותר ואינפורמטיבי.

Assay mammosphere מספק כלי אינפורמטיבי ונוח, בתנאי שהוא מבוצע בזהירות והמגבלות מעל נחשבות: אכן כידע של קונדי in vivo שלנומשא וחווה התקדמות תאי גזע סרטני, מבחני mammosphere עשוי לשלב מגוון הולך וגדל של גורמים מולקולריים וסביבתיים. שימוש בגישה שתוארה לעיל, שיעורי תחום היווצרות מתאים לשיעורי גידול-ייזום בxenografts ^2,15,16, והתחדשות עצמית של תחומים עושה עלייה במקרי סרטן השד אגרסיווי יותר ²² והתערבויות הגדלת תאי גזע הבאות כגון כימותרפיה ^23. בינתיים התחומים עצמם יכולים לספק משאב יקר ערך שעם ללמוד הבדלי ביטוי וגורמים מעורבים ברומן אדריכלות ביטוי גנים בתאי גזע.

The authors declare that there is no conflict of interest that could be perceived as prejudicing the impartiality of this article.

עבודה זו נתמכת על ידי הקיסרי BRC, המכון הלאומי לחקר בריאות, והפעולה נגד הסרטן עם אזכור מיוחד להילארי קרפט וסר דאגלס מאיירס.