TH17 דגם דלקת של לוע תחתון פטרת בעכברים immunodeficient

Although Candida infection models are available to study host immune resistance, a model to study T cell mediated immunopathology in the context of Candida infection is absent. Here we describe a method to establish Th17 immunopathology associated with oral Candida infection in immunodeficient mice.

Oropharyngeal Candidiasis (OPC) disease is caused not only due to the lack of host immune resistance, but also the absence of appropriate regulation of infection-induced immunopathology. Although Th17 cells are implicated in antifungal defense, their role in immunopathology is unclear. This study presents a method for establishing oral Th17 immunopathology associated with oral candidal infection in immunodeficient mice. The method is based on reconstituting lymphopenic mice with in vitro cultured Th17 cells, followed by oral infection with Candida albicans (C. albicans). Results show that unrestrained Th17 cells result in inflammation and pathology, and is associated with several measurable read-outs including weight loss, pro-inflammatory cytokine production, tongue histopathology and mortality, showing that this model may be valuable in studying OPC immunopathology. Adoptive transfer of regulatory cells (T_regs) controls and reduces the inflammatory response, showing that this model can be used to test new strategies to counteract oral inflammation. This model may also be applicable in studying oral Th17 immunopathology in general in the context of other oral diseases.

Oral infections and inflammation have been related to cancer and cardiovascular diseases, and have dramatic impact on overall human health^2,3. Opportunistic infections and inflammation caused by C. albicans are associated with primary immunodeficiencies (PID)^4,5, inflammatory disorders such as periodontitis ^6,7, Sjogren’s syndrome, and salivary gland disease^8,9, as well as oral squamous cell carcinoma ^10-12. C. albicans is a dimorphic commensal fungus that colonizes the mouths of 60% of healthy humans asymptomatically, yet it is the most common fungal pathogen causing infections when the host defense is weakened^13-15. It causes recurring and chronic infections and inflammation in patients with AIDS and PID, and also in other immunocompromised individuals. As a commensal, its colonization load is associated with the change in the diversity of the overall oral microbiome¹⁶. As a pathogen it causes several forms of oropharyngeal candidiasis such as acute pseudomembranous, acute atrophic, chronic atrophic, chronic hypertrophic/hyperplastic, and angular cheilitis.

Protection against C. albicans is determined not only by host immune resistance, but also by the ability to appropriately control Candida-induced immunopathology. Although commensals such as C. albicans contribute to modulation and exacerbation of other oral inflammatory conditions, the mechanisms by which dysbiosis occur during opportunistic infections are unclear. Besides the known role of adaptive Th17 cells in memory response to C. albicans¹⁷, their role in initiation and perpetuation of inflammation pathology during chronic infections remain unclear. Furthermore, oral inflammatory diseases such as Sjogren’s syndrome and periodontitis are associated with Th17 mediated pathology. Interestingly, these diseases are also strongly associated with frequent OPC. However, the interactions among Th17 cells, oral immunopathology of OPC and other oral inflammatory diseases are unstudied.

Although mouse models of primary and secondary infection of oral candidiasis are available, a mouse model to study Candida infection associated Th17 inflammation, especially in the context of immunodeficiency is unavailable. This study presents a method for establishing oral Th17 inflammation associated with oral Candida infection in mice. Candida infection in mice is characterized by fungal lesions, inflammation in the tongue, decreased food intake, weight loss and eventually a moribund state. Oral pathology resembles chronic candidal infection lesions, as well as epithelial dysplasia in mouse oral cancer models^12,18.

הערה: הניסויים באמצעות עכברים בוצעו בהתאם לועדת רווחת בעלי החיים המוסדיים (IACUC) הנחיות.

1. לשחזר את סמרטוט-1 ^{- / -} העכברים עם תאים אני n חוץ הגופייה בתרבית TH17 (שלושה ימים לפני זיהום)

1. להקמת תאי TH17, תרבות תאי T מסוג CD4 + הנאיבי CD44low CD62Lhigh CD25- (3 x 104) ב 96 צלחות U-תחתונה גם לבד, או שיתוף תרבותם יחד עם 3 x 104 CD4 + CD25 + Foxp3 + Tregs בנוכחות מסיסה α-CD3, α-CD28 (2 מיקרוגרם / מיליליטר) נוגדנים ותאי הצגת אנטיגן, בתנאי TH17 (מקוטב באמצעות IL-6 (25 ng / ml), β TGF- (2 ng / ml) (1 מיקרוגרם / מיליליטר) , Α-IFN-γ (2 מיקרוגרם / מיליליטר) ו-IL-4 α (2 מיקרוגרם / מיליליטר)) לשלוש עד ארבעה ימים.
   הערה: תאים נאיביים _{ובתקנות} T מוינו באמצעות תא קרינה המופעל מיון (FACS)ד נהלי בידוד תא מגנטי ותרבותי כפי שתואר לעיל ^19-22.
2. ביום 4, לאחר resuspending תאי TH17 באמצעות פיפטה, לאסוף אותם מתרבויות, וצנטריפוגות בתנאים סטריליים.
   1. קח aliquot קטן של תאים אלה לבחינת הכדאיות שלהם ועבור phenotyping. Resuspend אותם 500 μl של מדיום RPMI, להוסיף יודיד propidium (200 ng / ml) ולהעריך את הכדאיות שלהם באופן מיידי על ידי cytometry זרימה. בצע phenotyping ידי cytometry זרימת ההערכה של ייצור IL-17 א לאחר restimulation (ראה סעיף 6.3).
3. צנטריפוגה ולשטוף את הנפח העיקרי של התאים בPBS סטרילי ב 480 XG במשך 6 דקות ב 4 ° C בכל השלבים, אלא אם כן צוין אחרת.
4. להשתמש בתאים אלה להעברת מאמצת לCD45.2 Rag1 6-8 שבוע ישן - / - עכברי immunodeficient.
   1. Resuspend התאים בצפיפות תאי 1 x 10 ⁷ תאים / מיליליטר באמצעות PBS סטרילי הקר.
   2. הזרק של התאים 100 μl ידי intrapהזרקת eritoneal, באמצעות 25 מחטים G על 1 מיליליטר מזרקים טוברקולין, כך שעכבר אחד מקבל 1 x 10 ⁶ תאים. עכברים מסוימים יקבלו תאי PBS או TH17 בלבד, ועכברים אחרים יקבלו תאי TH17 שהיו שיתוף תרבותי עם תאי Treg.
      הערה: בצע את כל שלבי סביבה נקיה מחיידקים.

2. גידול C. אלביקנס לזיהום (יום אחד לפני זיהום)

1. לפני החיסון, לפזר חמש מושבות של ג CAF2-1 זן אלביקנס מעבדה בהשעית PBS סטרילי 100 μl, ומוסיף את ההשעיה למרק סטרילי.
2. לחסן 5 מושבות של ג אלביקנס ב 50 מיליליטר של בסיס חנקן שמרים (YNB ללא חומצות אמינו) / Peptone / בינוני דקסטרוז מרק ודגירה בחממה שייקר ב 30 מעלות צלזיוס למשך 15-18 שעות ב 130 סל"ד.
3. לפקח על המרק לעננות, כפי שהיא אינדיקציה לצמיחה של הפטרייה.

3. קנדידהקציר וסדר ספירה (ביום של זיהום)

1. לאסוף 10 מיליליטר של מרק קנדידה ב 15 מיליליטר צינורות. לנפחים גדולים יותר, לאסוף קנדידה בצינורות 50 מיליליטר.
2. צנטריפוגה blastospores ב1,900 XG במשך 5 דקות בRT בכל השלבים, אלא אם כן צוין אחרת. גלולה blastospores ידי צנטריפוגה, ואחריו הסרת supernatant.
3. אם יש צינור אחד או יותר, בריכת blastospores קנדידה מצינורות מרובים, הוספת PBS סטרילי לכדורים וresuspend אותם 10 מיליליטר של PBS לספירה.
4. קח 20 μl של blastospores בצינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge, להוסיף 20 μl של paraformaldehyde 2X ולדגור על RT במשך 15-20 דקות. רוזן blastospores הקבוע באמצעות hemocytometer מתחת למיקרוסקופ.
   הערה: Paraformaldehyde הוא מסרטנת. פתח את הפתרון חי רק במנדף.
5. בינתיים, לחזור על שטיפת blastospores לפחות פעמיים, על ידי צנטריפוגה tמכפלת בPBS, וpelleting blastospores. שמור את כדורים ב 15 מיליליטר צינורות ב RT, בשכונה ABSL1, מוכן לזיהום.
6. להשאיר כמה PBS סטרילי בRT לresuspending blastospores לזיהום.
7. לאחר ספירה, להוסיף PBS סטרילי לגלולת blastospore להתאים את מספרי תא השמרים blastospore עד 2 x10 ⁸ תאים / מיליליטר שמרים. זה ההשעיה blastospore שישמש להדביק עכברים.
   הערה: בצע את כל שלבי סביבה נקיה מחיידקים.

4. זיהום עכברים (3-5 ימים לאחר העברת Cell)

הערה: הליך הזיהום הבסיסי מבוצע כפי שתואר לעיל ^19,23-25.

1. לשקול את סמרטוט-1 - / - העכברים שקיבלו PBS או תאי שלושה ימים קודם לכן.
2. לחשב את המינון של חומרי הרדמה באמצעות משקל גופם. להרדים את העכברים על ידי מתן קטמין / תערובת xylazine (16.1 מ"ג / מיליליטר ו -1.6 מ"ג / מיליליטר), באמצעות 25 מחטים G על 1 מיליליטר מזרקים טוברקולין, על ידי מילת קריאההזרקת aperitoneal.
   1. לנהל 50 μl לכל 10 גרם של משקל גוף. (כלומר, 0.8 מ"ג של קטמין ו0.08 מ"ג של xylazine / 10 גרם של משקל גוף או 80 מ"ג של קטמין ו -8 מ"ג xylazine לכל קילוגרם של משקל גוף בהתאמה). שים לב לתגובת קמצוץ הבוהן כל 15 דקות לאחר הרדמה.
      הערה: מינון זה יגרום 60-90 דקות של הרדמה, וזה מספיק להליך הזיהום.
   2. החל המשחה הסיכה עיניים בעיניים של העכברים כדי למנוע את הקרניות מהתייבשות. כחומר הסיכה העין עלולה להתייבש, לחזור על שימון עיניים כל 45 דקות.
3. הזרק 1 מיליליטר של תמיסת מלח (0.9% NaCl) תת עורי בגב הצמוד לforelimb, כדי לסייע להחזרת נוזלים של העכברים במהלך הרדמה.
4. להשיג כלוב חדש, נקי. בצע את עכבר הליך אחד זיהום בזמן, הצבת כל עכבר לכלוב החדש הנגוע פעם. בצע את PBS / זיהום הדמה ראשון, ולאחר מכן להמשיך לGro זיהום קנדידהעליות.
5. להרים את העכבר הרדים ולפתוח את הפה הרחב כדי לחשוף את בסיס הלשון.
   1. הנח כותנה קוטר כדור 3 מ"מ רווי עם 50 μl של PBS או blastospore השעיה, sublingually בחלל הפה למשך 90 דקות. הפוך את העכברים כל חזית 15 דקות וחזרתי למניעת גודש ריאה, על מנת להבטיח שכדורי צמר גפן לא זזו.
6. הגדרת טיימר לכל עכבר כדי להבטיח 90 דקות של חיסון שאם או קנדידה בחלל הפה.
7. שמור אותם בכלוב תחת מנורת החום (4 מטרים), וכל עכבר על כריות ג'ל חום.
8. ודא כי הלשון תבוטל בתוך ומחוץ לשיניים, כדי למנוע את השיניים ופצעו את הלשון.
9. בתום 90 דקות, להסיר את כדור צמר גפן מפיו של העכבר. Watch עבור כל עכבר שעשוי להתאושש מהרדמה מוקדם מ -75 דקות. במקרה כזה, להרדים אותם שוב עם קטמין (40 מ"ג / קילוגרם) בלבד.

5. ההודעה Procedurדואר ניטור (בהרדמת 90 דקות)

1. השתמש ברפידות ג'ל החום במהלך ההרדמה 90 דקות.
   1. כדי לשמור על טמפרטורת הגוף ולמנוע חנק, אל תאפשר עכברים להתאושש על מצעי עכבר התירס של הרגילים.
2. לאחר ההתאוששות מהרדמה, לנהל 1 מיליליטר נוסף של 0.9% מתחת לעור NaCl סטרילי בשני מקומות על הגב.
3. שמור עד חמש PBS (דמה) עכברים מחוסן בכל כלוב. בית עכברים נגועים רק 1-2 בכל כלוב.
4. מלא את כרטיס ההליך בראשי תיבות בכל יום לאחר ההליך כדי לרשום את השינויים במשקל הגוף, טיפוח הרגלים ועל בריאות כללית.

6. הערכת הדלקת

משקל 6.1) הפסד

1. לשקול את העכברים בכל יום במהלך הזיהום, החל מהיום לפני הליך זיהום.
   הערה: בדרך כלל, עכברי immunodeficient הוזרקו תאי TH17 וללא _{את תקנות} T להיכנע עד 2030% ירידה במשקל עקב העלייה פטרייתי נטל ¹⁹ והחריפה את דלקת.

6.2) ניקוד היסטולוגיה של הלשון

1. להקריב את העכברים על ידי CO ₂ מחנק ואחריו נקע בצוואר הרחם.
2. פתח את הלסתות ולנתח את הלשון עם מספריים ומלקחיים. שימוש במלקחיים בוטים להחזיק את הלשון, ובאמצעות המספריים להגיע לחלק האחורי של הפה כדי לחתוך את הקצה האחורי של הלשון.
3. לhematoxylin immunocytochemical וeosin מכתים (H & E) של רקמות הלשון, לשטוף את רקמות לשון עם קרח הקר PBS. הוסף 5 מיליליטר של פורמלין 10% במשך 2-3 לשונות ולתקן אותם O / N ב 15 מיליליטר צינורות.
   1. למחרת, להסיר את פורמלין ולטבול את הרקמות ב 5 מיליליטר של אתנול 70% כדי למנוע היפר-קיבעון. שלח אותם לשירות מסחרי להמשיך עם הטבעת פרפין, חתך וצביעת חלקי פרפין.
      הערה: שירות היסטולוגיה מסחרי משמשת כדי לבצע שלבים אלה.
4. ברגע השקופיות חזרו משירות היסטולוגיה המסחרי, הכיתה הדלקת על ידי התבוננות בסעיפי הרקמות תחת מיקרוסקופ אור.
   1. ציון 0-5, עם 0 להיות לא דלקת, ו -5 להיות הדלקת החמורה ביותר. ציון הדלקת באמצעות טבלה 1.

6.3) ייצור ציטוקינים על ידי תאי TH17

הערה: ייצור TNF-α מופרז היא אחד מהקריאות לimmunopathology מוגזם. כאשר עכברים מועברים adoptively עם תאי TH17 רק, זה גורם immunopathology המשויך לייצור TNF-α מוגזם בתאי TH17.

1. לאסוף השעיה תא בודדת מטחול, בלוטות לימפה בצוואר הרחם, lymphnodes בבית השחי, ולשון, תוך שימוש בשיטות שתוארו קודם לכן ^19.26.
2. Restimulate התאים עם אצטט myristate phorbol (PMA) (50 ng / ml) וionomycin (500 ng / ml) במשך שעה 4 עם Brefeldin (10 מיקרוגרם / מיליליטר) הוסיף בlAST שעה 2. לשטוף את התאים עם PBS ולתקן אותם באמצעות ערכת הקיבוע / permeabilization מסחרית בהתאם להוראות יצרן.
3. לבצע מכתים ציטוקינים סלולריים תוך שימוש באנטי TNF-α fluorochrome מצומדות, אנטי-IL-17 א ונוגדני ROR-γt כפי שתואר לעיל ^19.
4. בקצרה, resuspend תאי חיץ permeabilization 1X עם הקוקטייל של אנטי TNF-α, אנטי-IL-17 א ונוגדני ROR-γt, כל נוגדן ל 2 - 3 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז סופי.
5. דגירה התאים עבור שעה 1 ב RT.
6. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים עם חיץ permeabilization 1X.
7. Resuspend התא גלולה ב 500 μl של PBS עם 0.5% אלבומין בסרום שור לניתוח cytometry זרימה.

במודל זה, שני עכברי קנדידה -infected ועכברים נגוע בסמרטוט-1 ^{- / -} רקע immunodeficient הועבר adoptively עם תאי TH17 3-5 ימים לפני הזיהום. בסך הכל 10-12 עכברים שימש לניסויים, עם 2 עכברים בכל קבוצות שאם נגוע, ו4-5 בכל אחת מהקבוצות נגועות קנדידה. תאים נאיביים נגזרו מעכברי Thy1.1 או CD45.1 congenic, כך שתאי TH17 הזריקו אותרו in vivo באמצעות Thy1.1 או CD45.1 צביעת בהתאמה (איור 1 א). _{את תקנות} T-הועבר Co נגזרו מעכברי CD45.2 כדי להבדילם מתאי CD45.1 TH17. עבור חלק מניסויים, CB-17 Thy1.2 עכברי נמען SCID, תאי תורם TH17 שהתקבלו בעכברי Thy1.1 BALB / C _{ובתקנות} T שהתקבלו בעכברי Thy1.2 congenic היו בשימוש. רק קנדידה -infected עכברים, אבל לא העכברים נגוע הציגו הגיוס והרחבת CD45.1 מחדש ⁺ תאי TH17 בCLN, בלוטות לימפה ניקוז. תוצאה זו מעידה על כך שהתגובה הספציפית פטריית TH17 היא יזם בבלוטות לימפה לשון ניקוז (איור 1 א). התוצאות מייצגות נתונים מעכבר אחד בכל קבוצה.

רק בעכברים, כי הם משתפים הועברו עם _{את תקנות} T, CD4 + השלילי תאי Foxp3 + CD45.1 אותרו בCLN. זה מראה כי _{את תקנות} T הזריקו גם גויסו לאתר של זיהום (איור 1). התוצאות מייצגות נתונים מעכבר אחד בכל קבוצה. בעוד נגוע סמרטוט-1 ^{- / -} במשקל לרדת במשקל והתאושש לאחר 4 ימים של זיהום, עכברי immunosuppressed קורטיזון לא התאוששו אבל אבוד נוסף, כפי שהוצג קודם ^27. שתי הקבוצות של עכברים שקיבלו את תאי TH17 בנוכחותו או היעדריו של _{את תקנות} T ירדו במשקל בהתחלה. עם זאת, העכברים שקיבלו _{את תקנות} T התאוששו מירידה במשקל ופתרו את הזיהום. 2 מ 'קרח שימש בקבוצה שאם נגוע, ו- 4 בכל קבוצה נגועה קנדידה. היו שם 3 עכברים בקבוצת קורטיזון. העכברים שקיבלו את תאי TH17 בלבד, ירדו במשקל בהדרגה (איור 2) ^19. חלק מהעכברים שבקבוצה היה צריך להיות מורדמים. תוצאות אלו מראות הממוצעת של המשקולות של כל העכברים שבקבוצה. למרות נויטרופילים נדרשים לאישור הראשוני של הזיהום, נוכחותם המתמדת וגיוס ברקמה הוא סימן לדלקת לא פתורה. לכן חדירת נויטרופילים נבדקה בלשון נגועה, על ידי קביעת הביטוי של סמן נויטרופילים, Gr-1, בנקודות זמן מאוחר יותר כגון יום-7 לאחר הדבקה. עכברים שקיבלו את תאי TH17 רק, היו מחלחל גבוה דלקתי (איור 3 א), ובכלל זה Gr-1 + נויטרופילים אפילו יום-4 לאחר הדבקה, בהשוואה לעכברים שהוזרקו עם _{את תקנות} T (איור 3). תוצאות אלו מראות כי בpresencדואר של _{את תקנות T,} עכברים פתרו את הדלקת ביעילות רבה יותר והתאוששו מהזיהום.

ביום 7 לאחר הדבקה, רקמות טחול (SPLN), CLN והלשון היו מבודדות, והשעיות תא בודדות נעשו לזרימת cytometry ניתוח. CLN חשף מוגבר תאי CD45.1 TH17 (איור 1) וייצור TNF-α מוגבר (איור 4 א, ​​4 ב) בעכברים שקיבלו את תאי TH17 בלבד. מצד השני, T _רג המקבלים הראו ירידה בתדירות של תאי TH17 וייצור TNF-α מופחת על ידי תאי TH17 (איור 1 & 4 א, ​​4 ב). בניסויים אלה, נתונים מCLN של עכבר אחת, ורקמות לשון שנקטפו ונקוו מ 2 עכברים מוצגים. אם כי בנקודתי זמן מוקדמות ייצור IL-17 א היה גבוה יותר בT _רג מקבלי ^19, בנקודות זמן מאוחר יותר בשתי הקבוצות, ייצור IL-17 א על ידי תאי TH17 היה מינימאלי (מידע לא מוצג). צביעה של החומצה שיף תקופתיתשל הלשון הראה גדילת פטריית העובש בעכברים שקיבלו את תאי TH17 בלבד, ואילו עכברים שקיבלו _{את תקנות} T פינו גם הפטרייה ביום-5 ויום-7 לאחר ההדבקה (איור 5). יתר על כן, ניקוד histopathology של דלקת הלשון הראה גם ציוני דלקת מופחתים בעכברים שקיבלו _{את תקנות} T, בהשוואה לעכברים שקיבלו רק תאי TH17 (איור 6). ניקוד הדלקת התבסס על הפרמטרים לשון histopathological כגון, נוכחות של גבשושיות, שלמותו של השכבה השטחית אפיתל, השמרים גלויים או העובש, העובש הפולש המצביע על אי-פתרון זיהום, העיבוי של שכבת בסיס (מעידה על תיקון רקמות מתמשך), ואת הנוכחות של חדירת תאי מערכת חיסון (תאי נויטרופילים וTH17). תוצאות אלו הפגינו הזרקה של תאי TH17 שלא ישירות להפחית זיהום, אך הגדילו את הנטל פטרייתי וimmunopathology נגרמים על ידי C. העיקרי infec אלביקנסtion, ואילו שיתוף העברת _{את תקנות} T להשתפר immunopathology.

איור 1. הזריק תאי TH17 ותאי T _reg לגייס ולהרחיב בבלוטות לימפה ניקוז (CLN) של C albicans נגוע עכברים () Rag-1 ^{-.. / -} עכברי CD45.2 היו מחדש עם תאי TH17 או TH17 + T _רג תאים שמקוטבים בתנאי TH17 במשך 5 ימים. תאי TH17 התקבלו מעכברי CD45.1 congenic ותאי T _reg התקבלו מעכברי CD45.2. עכברים כלשהי לא קיבלו את כל תאים (Sham או קנדידה + PBS). עכברי נמען בכל קבוצה היו נגועים בבקרת אחיזת עיניים או עם ג אלביקנס. ביום 5 לאחר הדבקה, CLN היה בידוד עed לעשות השעיה תא בודדת ולעקוב אחר CD45.1 הזריק לבטא בתאי TH17 ידי cytometry זרימה (נשלטים על כל כדוריות הדם לבנות בFSC, פיזור SSC) (B) Rag-1 ^{-. / -} CD45.2 עכברים מחדש עם תאי TH17 או תאי TH17 + T _reg כמו "A" ונגוע בC. אלביקנס. CLN בודדו לעשות השעיה תא בודדת ולמדוד CD45.1 וביטוי תאיים Foxp3 ידי cytometry זרימה (נשלטים על כל תאי CD4). שערי _reg T בחלקות להראות CD45.1 השלילי, Foxp3 + CD4 + תאים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

תאי TH17 איור 2. יצוקה לגרום לירידה במשקל בC . עכברים נגועים אלביקנס ושיתוף ממשל של _{את תקנות} T משפרים התאוששות מירידה במשקל. SCID CB-17 עכברים מחדש עם תאי TH17 או תאי _reg TH17 + T כמו באיור 1 א. 3 ימים לאחר מכן, עכברי הנמען היו נגועים בג אלביקנס. עכברי חלק בכל קבוצה היה נגוע בבקרת אחיזת עיניים. עכברי immunosuppressed קיבלו אצטט קורטיזון הזרקה (קורט). אחוז השינוי במשקל בעכברים מחדש עם תאים מצויינים ונגועים באלביקנס ג, ביחס לd-1 (לפני הדבקת יום אחד) מוצג. הנתונים מנורמלים על נתוני משקל מעכברים נגוע (Sham + PBS). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

"Src =" / קבצים / ftp_upload / 52,538 / /> 52538fig3highres.jpg "
תאי TH17 איור 3. יצוקה לגרום immunopathology הלשון בC. אלביקנס נגוע עכברים ושיתוף ממשל של _{את תקנות} T מפחית את הערכת immunopathology. היסטולוגית של הלשונות של ג אלביקנס נגוע עכברים. עכברים מחדש עם תאים המצוין ונגועים כמו באיור 1 א. ביום 5 לאחר הדבקה, לשונות היו מבודדות מעכברים. (א) סעיפי sagittal של הלשונות הוכתמו H & E להעריך דלקת והסתננות (IF) של תאי מערכת החיסון. (אבא) ו- (EP) נסמן גבשושיות ושכבת האפיתל של לשון בהתאמה. תמונות מיקרוסקופיות של השקופיות נצפו הגדלה at50X. (ב) immunostaining היסטולוגית לסמן נויטרופילים Gr-1 באמצעות נוגדן Gr-1 אנטי (קלהne: 1A8-Ly6g) בסעיפי הלשון ביום 5 לאחר ההדבקה (חום, כונה על ידי IF). תמונות מיקרוסקופיות של השקופיות שנצפו בהגדלה 100X מוצגים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4. Co-מנהל של _{את תקנות} T מפחית α TNF- בתאי TH17 מוזרקים. () Rag-1 ^{- / -} עכברי CD45.2 היו מחדש עם תאי TH17 או תאי _reg TH17 + T ונגוע בג אלביקנס כמו באיור 1 א. ביום 5 לאחר הדבקה, רקמות CLN והלשון בודדו לעשות השעיה תא בודדת. תאים אלה restimulated עם PMA וionomycin לפני staini תאיתng ולזרום מנתח cytometry. חלקות גובה cytometric זרימת ROR-γt תאיים וTNF- α ביטוי של תאי TH17 מוצגות (נשלטים על CD4 + תאים). (ב) ייצוג סטטיסטי של אחוז תאי TNFαpositive מניסויים שבוצע כמו "". הנתונים מייצגים 4 עכברים בקבוצה נגוע, ו6 עכברים בכל קבוצה נגועה, והם אספו משני ניסויים בלתי תלויים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

immunopathology איור 5. מוגבר קשור גם עם נטל פטרייתי מוגבר בC. אלביקנס נגוע עכברים. CB-17 מיקרופון SCIDדואר היו מחדש עם תאי BALB / C TH17, או תאי _reg TH17 + T כמו בFigure1A, והיו נגועים בג אלביקנס. הערכה היסטולוגית של הלשון מעכברים נגועים מוצגת. ביום 7 לאחר הדבקה, לשונות נקצרו ומוכתם בשל תקופתי החומצה שיף (PAS) כדי להעריך את הנגעים פטרייתיים, דלקת והסתננות (IF) של תאים, וכדי לזהות פטרייה (Ca). השקופיות נתפסו הגדלת at100X. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6. _{את תקנות} T לשפר immunopathology בC. עכברים נגועים אלביקנס. CB-17 עכברי SCID היו מחדש עם תאי BALB / C TH17, או תאי _reg TH17 + T כמו באיור 1 א, והיו נגועים בג אלביקנס. ייצוג סטטיסטי של הציונים היסטולוגית הממוצעים של הלשונות מעכברים נגועים העריכו כמו באיור 5. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

טבלת 1: ערכי ניקוד היסטולוגית

מודל זה מבוסס על גרימת ג האוראלי זיהום אלביקנס דלקת TH17 תלויה. בגלל העדר _{את תקנות} T, דלקת תא TH17 המושרית היא חסרת מעצורים ומובילה לimmunopathology גרוע נפתר. במבחנה נגזרת תאי CD4 נאיביים מקוטבים כמו תאי TH17 שמשו להעברת המאמצת. 40 - 50% מCD4 + תאים בתרבית להראות ביטוי לגילוי IL-17 א סביב יום 3 (תאי TH17), ולכן שמשו להזרקה בעכברים. היתרון העיקרי של המודל הוא שתאי TH17 לגרום immunopathology ספציפי זיהום שיכול להשתפר ביעילות עם הזרקת _reg T. כך המודל יכול להיות מועסק על מנת לבחון אסטרטגיות תפקוד מערכת חיסון עם הזרקת _reg T כביקורת חיובית. דלקת מוערכת בקלות מבוססת על הירידה במשקל, ניקוד histopathological וייצור ציטוקינים פרו-דלקתי על ידי תאי TH17 של העכברים הנגועים.

לאחר tהוא מאמץ העברה של תאי TH17, הם היגרו לאיברים ורקמות הלימפה משניים שונות, כוללים הלשון, האתר הראשי של זיהום. לאחר ההדבקה, תאים דלקתיים אחרים גם גויסו ללשון כדי לנקות את הזיהום. עם זאת, ללא תפקוד מערכת החיסון _reg T בתיווך, תאי TH17 עצמם לא פתרו את הזיהום, אך נגרמו immunopathology המוגבר. Co-העברת _{את תקנות} T נפתרה לחלוטין הדלקת. מעניין, עכברים עם דלקת החמירה בהעדר _{את תקנות} T, גם הראו גדילת פטריות נטל. הדו"ח הקודם שלנו הראה שזה היה בגלל ייצור IL-17 א מופחת בעכברים, בהשוואה לאלו עם _{את תקנות} T. הניסויים הנוכחיים שלנו תומכים ברעיון שזה יכול להיות גם בשל עליית TNF-α שהחמיר את הדלקת, ככל הנראה על ידי אפופטוזיס תא אפיתל הגדלת וגדל פטריית נטל ^28. בהתחשב בהשפעות immunoprotective של IL-17 א ברירית, אנו מאמינים כי פתולוגיה דלקתית שאנו רואים עם הגדלת נטל פטרייתי היא לא בשל IL-17 א מיוצרים על ידי תאי TH17 או חוסר התנגדות מארח. הוא נגרם עקב TNF-α וציטוקינים פרו-דלקתיים אחרים ואולי מיוצרים על ידי תאי TH17 מוזרקים. זה יכול להיות מאומת על ידי התצפית שסמרטוט - / - עכברים נטולי תאי TH17 להציג רק מינימאלית דלקת ותוצאה מהחלטת הזיהום ורק מי שקיבל את תאי TH17 נכנעו לירידה במשקל חמורה (איור 1). עקבי לנתונים אלה, זה כבר הראה בעבר גם סמרטוט ^{ש-- / -} עכברים לנקות את זיהום OPC העיקרי בלי הרבה immunopathology ^27. בתנאים אלה, מנגנוני פיצוי תלוי בIL-17 א לייצור תאים חיסוניים מולדים הוכחו כדי לנקות את הזיהום בסמרטוט - / - עכברים ^17,29,30. יחדיו, למרות שIL-17 א מיוצר על ידי תאי TH17 וגיוס נויטרופילים משחקים תפקיד מגן בשלבים ראשוניים של זיהום, EXCייצור essive של TNF-α וציטוקינים אחרים על ידי תאי TH17, ונוכחותם המתמדת של גורמי נויטרופילים החריף immunopathology. התפקידים של ציטוקינים פרו-דלקתיים TNF-α מלבד מיוצר על ידי תאי TH17 להישאר להיחקר בהקשר של immunopathology.

המגבלה העיקרית של המודל היא השאלה אם זה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית לOPC האנושי. למרות שתאי TH17 מוצגים להיות מתווכים פתולוגיים במספר מחלות אוראליות, אם הפעלה כרונית של תאי TH17 היא פתוגניים בOPC להישאר להיחקר. עם הממצאים אחרונים רומזים התפקיד של ג אלביקנס בדלקת וסרטן, immunopathology TH17 בחלל הפה הוא שדה פעיל של חקירה ^31. כך המודל המתואר כאן ניתן להשתמש כדי ללמוד יותר בזהירות תפקידים ספציפיים של תאי TH17 וכיצד הם פועלים עם תאים חיסוניים מולדים, נותנים תובנות מפורטות למחלות חיסוניות אוראליות וסרטן פה.

השלב הקריטי בטכניקה הוא הגיוס והרחבת תאי TH17 הועברו adoptively המתאימים. זה תלוי מאוד בייצור הכדאיות וIL-17 א של התאים במבחנה TH17 מקוטבים לפני ההעברה. עדיף לבדוק ייצור הכדאיות וציטוקינים על ידי cytometry זרימת מנתח ^19. ביצוע נכון של זיהום הזרקת תאים ועכברים TH17 יוביל לimmunopathology TH17 התלוי זיהום. מודל זה יכול להיות מיושם כדי לבחון אסטרטגיות לסיכול immunopathology TH17 ודלקת אוראלית בהקשר של זיהומים אחרים גם כן. כמו כן, שימוש במודל זה, ניתן לבצע מחדש זיהומים משניים וללמוד את התפקיד של תאי TH17 בהחרפת immunopathology בהקשר של דלקות כרוניות. כמודל זה כרוך עכברי immunodeficient, זה יכול להיות מאוד רלוונטי לdysbiosis האוראלי ראה בחולי איידס וPID, הסובלים מדלקות חוזרות קנדידה כרוניות.

The authors declare that they have no competing financial interests.

We thank Dr. Helene Bernstein for providing us with access to her flow cytometer. We also thank CFAR flow cytometry facility for the flow cytometry services. This project was in part supported by CTSC core utilization funding and STERIS corporation/University Hospitals-Division of Infectious diseases grant to PP.