Method Article
בדו"ח זה אנו מתארים שיטה למחוץ העצב העכבר הנשה. שיטה זו משתמשת מלקחיים עוצר דמום זמינים ובקלות reproducibly מייצרת העצב המלא למחוץ הנשה. בנוסף, אנו מתארים שיטה להכין mounts שרירים שלמים מתאימים לניתוח של התחדשות עצבים אחרי למחוץ גיד הנשה.
הדור הבא של מערכת העצבים ההיקפית (PNS) נלמדת באופן נרחב גם על הרלוונטיות שלה למחלות האדם להבין את התגובה משובי חזקים רכוב על ידי נוירונים PNS ובכך אולי שהאירו את הכישלונות של התחדשות מערכת העצבים המרכזית 1. למעוך גיד הנשה (axonotmesis) הוא אחד המודלים הנפוצים ביותר של פגיעה עצבית היקפית במכרסמים 2. ריסוק קוטע את כל האקסונים אלא רבדים שוואן התאים הבזליים נשמרים כך התחדשות כי הוא אופטימלי 3,4. זו מאפשרת לחוקר לבחון דווקא את היכולת של האקסון הגוברת לקיים אינטראקציה עם התא הן שוואן ואת רבדים הבסיס 4. החולדות היו בדרך כלל את הדגמים המועדפים על בעלי חיים למחוץ העצב ניסיוני. הם זמינים באופן נרחב ועל גיד הנשה lesioned שלהם מספק קירוב סביר של נגעים עצב אנושיים 5,4. אם כי קטנים יותר מאשר עצב חולדה, עצב העכבר יש תכונות דומות רבות. והכי חשוב אם כי, mousמודלים אלקטרוניים הם בעלי ערך יותר ויותר בגלל הזמינות רחב של קווי מהונדס כעת מאפשרת לנתיחה מפורט של מולקולות בודדות קריטיים עבור התחדשות עצבים 6, 7. חוקרים קודמים השתמשו בשיטות רבות כדי לייצר דלוקה עצב או פציעה כולל מלקחיים זווית פשוטים, מלקחיים, מלקחיים מצוננים עוצר דמום, Clamps כלי הדם, וכן החוקר מלחציים, שנועדו 8,9,10,11,12. החוקרים השתמשו גם שיטות שונות של סימון האתר כולל פגיעה תפר, חלקיקי פחמן חרוזי ניאון 13,14,1. אנו מתארים את השיטה שלנו להשיג דלוקה מלאה reproducibly גיד הנשה עם סימון מדויק ועקבי של האתר, למעוך בעזרת מלקחיים עוצר דמום דקים פחמן לאחר המדליקה האתר סימון. במסגרת תיאור שלנו הליך גיד הנשה למחוץ כללנו גם שיטה פשוטה יחסית של כל שריר לעלות לאחר מכן אנו משתמשים כדי לכמת התחדשות.
1. בעלי חיים נושאים
1.1. טיפול
1.2. כירורגי הכנה
2. לשחזור גיד הנשה Crush
3. לאחר הניתוח טיפול
4. חצי דקה הכנה
5. הכנת כל הר שריר
6. מדידת הדור הבא
7. נציג תוצאות
באיור 1. סכמטי של אנטומיה גפה אחורית חשוב למעוך העצב. א חתך חצי עגול העור נעשה חושף השרירים הבסיסית. ב השרירים gluteal כבר נפרדו, גיד הנשה גילה (שלב 2.4 לעיל). החץ מציין את האתר למחוץ המשוער. מיקום מפשק מוצג כמדריך בכלל, מותאם במהלך ניתוח זה כדי להקל על ויזואליזציה של הירך ואת הגישה של מלקחיים עוצר דמום עבור מאוהבת ב '(השיבוץ). המיקום של הירך על הלסת התחתונה של מלקחיים עוצר דמום רק לפני למחוץ (שלב 2.5 לעיל). Fascicles נפרדים מסומנים על מנת להוכיח כי הם סמוכים אופקית, אך לא בצורה אנכית, במהלך הדוחק. למרות 3 fascicles מסומנים בתרשים זה, ניתן גם לראות fascicle 4, סניף במפרק של peroneal. עבור ציור אנטומי מפורט יותר של דפוסי הסתעפות של עצב הנשה fascicles דיסטלי עד כדי למעוך, עיין האנטומיה של גרין של עכברוש, איור 188 17.
איור 2. באתר פחמן מסומן למחוץ באתרו ו toluidine כחול מוכתם, חצי דקה קטעי גיד הנשה כתוש. א למשל של אתר דלוק באתרו (איבר האחורית משמאל). פחמן שחור מציין האתר למעוך. כוכבית מסמנת ענף של העצב הטיביאלי כי innervates שרירי הירך ומהווה ציון דרך שימושי במהלך הניתוח מאוהבת. חטיבת השוקה של עצב השת המתואר כחול, peroneal בירוק, ואת sural בצהוב. ב חצי דקה סעיפים הוכחת דלוקה המלא הופיע עם כוח עוצר דמוםPS. ג חצי דקה סעיפים הוכחת למחוץ שלם הופיע עם מלקחיים בזווית. בתמונות הן המתנוונת פרופילים המיאלין מסומנים ראשי חץ. בלוח החצים ג לסמן דוגמאות של פרופילים המיאלין משומרים ו מצרר של אקסונים בחיים. סרגל קנה מידה הוא 10 מיקרומטר.
איור 3 הר שלם שרירים סכמטי ו NMJs נציג AC:.. תמונות המוצג של אדי (א '), longus peroneus (ב'), ו soleus (C) בניכוי שרירי הגפיים האחוריות מ. שרירי המוצגים הם מענף האחורית הימנית. הברך אנטומי אוריינטציה הקרסול כלולים גם לעיון. הגידים הם בצבע לבן התווה קו שחור מוצק כשהוא מוצב על גבי השרירים. הם מתוארים בקו מקווקו שחור כאשר הם להאריך מתחת לשריר. קיצוצים מוצגים קווים מקווקווים אדומים.השריר הוא התקלף מאתרים חתוכים, כפי שצוין על ידי חיצים כחולים, דליל לאחר מכן. לאחר דילול, שרירים מופרד הסיכות על ידי חיתוך סביב מה שנותר הגידים שתלו: DF. תמונות שניתנו מתאריך השרירים הר שלמים לאחר הסרה של רקמת חיבור ובעקבות דליל. להקות endplate מפורטים על כל שריר GH:. שרירים Soleus כל הר ארבעה עשר ימים לאחר למחוץ גיד הנשה הוכחת מחדש מעוצבבים (G) denervated (ח) צמתים התוקפת. על לוחות אלה, NMJs, אקסונים, תאים שוואן הם דמיינו כמתואר לעיל בסעיף 5.5.1. קולטני אצטילכולין אדומות, אקסונים ירוק, תא שוואן מעבד כחול. בלוח G, החצים מצביעים על תחומי NMJ כי כבר מחדש מעוצבבים על ידי האקסון. בלוח ראשי חץ ח עולה GAP-43 חיוביות סלולריים תהליכים שוואן. הערה העדר אקסונים. סרגל קנה מידה הוא 10 מיקרומטר.
הצגנו שיטה להשיג דלוקה מלאה ומהימנה גיד הנשה עם סימון מדויק של אתר דלוק. כאמור, למעוך גיד הנשה הוא מודל נפוץ של פגיעה עצבית היקפית בעכברים וחולדות. למרות כל שיטה של התאהבות יש יתרונות וחסרונות, מצאנו שיטה זו הופק דלוקה שלמה סומן בקלות עם מינימום של ציוד מיוחד (מלחציים מיוחדים למשל, וכו ').
למחוץ שיטות
הכלי הנפוץ ביותר המשמש למחוץ העצב העכבר הנשה הוא ב -5 מלקחיים מספר בזווית. למרות שניתן להשיג דלוקה מלאה בשיטה זו, מצאנו כי הכלי הזה הפיק דלוקה משתנה (גם כוח קטן האקסונים היוצאים שחסכו או גדולים מדי לקרוע את העצב), בעיקר בידי המשתמש החדש.
שיטות פחות נפוצים אחרים המשמשים לייצור למחוץ כוללים קטעי מפרצת קטנים, מלקחיים קפואים בחנקן נוזלי, speciall Y מיוצרים, מכויל, לא משוננים מהדק 9,12,5,7. כל המכשירים הללו יכולים לייצר באופן מהימן דלוקה מלאה. בחרנו מלקחיים עוצר דמום כי המכשיר קל להשיג, מייצרת דלוקה אמין, ומאפשר סימון ברור של אתר דלוק. חסרון אחד של מלקחיים עוצר דמום היא שאנחנו לא יכולים בקלות למדוד את הכוח הנוצר במהלך ההתאהבות. עם זאת, נבדק פעם אחת, מלקחיים עוצר דמום יהיה אמין לייצר דלוקה מלאה, והוא יכול בקלות להיות מוחלף על ידי כ מלקחיים זהים אם מלקחיים להתקלקל.
לא משנה השיטה שנבחרה לבצע למעוך, אולי החלק הכי קריטי של הליך ההתאהבות היא לוודא שלמות של התאהבות העצב. זה חשוב במיוחד בידי המשתמש רומן. חצי דקה של עצב ניתוח דיסטלי למקום הפגיעה (איור 2) מספק שיטה פשוטה לעשות את זה והוא יכול לחשוף את דלוקה שלמה (איור 2, לוח ב ') או למעוך חלקית (איור 2, לוח ג).
"Jove_content"> השיקול הסופי בשיטת למחוץ הוא משך הדוחק. בדקנו את משך שהייתי דלוקה עליו 15 שניות ל -60 שניות של זמן למחוץ מוחלט, ללא הבדל של השקיפות של העצב או שמירה על סיבי myelinated. זה עולה בקנה אחד עם התצפיות של גשר ועמיתיו, שהשוו מוחץ של משך 15-60 2 בעצב עכברוש הנשה באמצעות מלקחיים של חנות תכשיטים לא מצאו משמעותיים מורפולוגיים, היסטולוגית, הבדלים אלקטרו, או תפקודית בין התאהבות אחרת המשכים 18. פעמים למחוץ עם זאת, יותר או שמועכת באופן משמעותי לבזות endoneurium תא שוואן תשנה את קצב ו / או הצלחה של התחדשות.
שיטות סימון
שתי השיטות מעשית עבור אתר למחוץ לציון מלבד פחמן אבקת הם תפר 10-0 באמצעות epineurium של עצב הנשה 13,19, ו FluoSpheres המיוצר על ידי בדיקות מולקולריות, יוג'ין או 1 . תפר 10-0 גסה מסמן את האתר למעוך, אבל דורש רמה גבוהה יותר של מיומנות microsurgical וכי השונות ביישום של תוצאות תפר בתוך פחות מדויק סימון הגבול של אתר דלוק מאשר פחמן לציון. כאשר לומדים את קצב התחדשות, הגבול של אתר דלוק חייב להיות מסומן דווקא הפציעה הבאה. אנחנו לא חקרו FluoSpheres, אך הם עומדים בקריטריונים של דיוק והתמדה של המדליקה האתר סימון. הם שימושיים במיוחד כאשר ב-vivo הדמיה התחדשות בקווים YFP העכבר 1. לענייננו מצאנו פחמן סימון נאותה ולא יקר, עם יתרון נוסף של שיראו בקלות בהערכה מיקרוסקופית לאחר חצי דקה או אלקטרונים. בנוסף, מצאנו כי פחמן סימון נמשכת לפחות שישה שבועות מה שהופך אותו מתאים ניסויים משך זמן ארוכים יותר.
ניתוח של הדור הבא אחרי קראש
שלמה investigation של התחדשות למחוץ הודעה משלב הערכות תפקודיות, אלקטרו, ו מורפולוגי 5,16. הערכות מורפולוגיים בעקבות התחדשות הם אולי הנפוץ ביותר. הערכות אלו ניתן לחלק את אלה להעריך את זמן האחזור של צמיחה, קצב הצמיחה axonal, וספציפיות של 16 reinnervation. בדו"ח זה, הצגנו הליך שרירים כל הר, שניתן להשתמש בהם כדי להעריך במהירות התחדשות מורפולוגי (איור 3). בניתוח זה NMJs denervated שכותרתו ידי bungarotoxin אלפא תא שוואן GAP-43 הם לכמת ולעומת מחדש מעוצבבים צמתים כפי שכותרתו ידי neurofilament, SV2, ו אלפא bungarotoxin. GAP-43 הוא שהוגברו במידה ניכרת על ידי תאים שוואן לאחר denervation ו יפה מזהה denervated מסוף תאים שוואן בצומת neuromuscular 20. למרות GAP-43 מתבטא אקסונים, השימוש קשורה של neurofilament בקלות מבדיל GAP-43 אקסונים חיוביות מתאי שוואן. יתר על כן,כי NMJs עמוק בתוך השריר לא יכול להיות מתויג בקלות על ידי נוגדנים (לעומת מולקולה קטנה אלפא bungarotoxin) GAP-43 שוואן תא immunoreactivity חשוב מאשר מצב denervated לצומת neuromuscular ומשפר דיוק כאשר ספירת NMJs denervated.
שיטה זו מספקת שיטה פשוטה ויעילה על מנת להעריך את מצב reinnervation של הלהקה שרירים endplate כולו בבת אחת. אחרים השתמשו שלך-1-CFP (23) / S100-GFP עכברים אקספרס ציאן חלבון פלואורסצנטי של אקסונים בתאי שוואן GFP לעקוב מחדש העצבוב של tibialis הקדמי לאחר למחוץ גיד הנשה 2. אזהרה אחת יש לציין, אם כי. שיטה זו מסתמכת על neurofilament ו SV2 immunoreactivity לכמת מחדש עצבוב. ייתכן כי תוצאה האקסון עשוי להיות ללא הפרעה, אך הביטוי הבאות של SV2 עשויה להתעכב 21. על כן, בניסויים מסוימים זה יהיה חשוב לאשר התחדשות מאוחרת ולא Delayed ביטוי presynaptic של החשבון (כלומר מראש הסינפטי בידול) SV2 על הפנוטיפ הנצפה.
אין לנו מה למסור.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH K08NS065157 (כדי TAF) בנוסף, מרכז פן על צ'כית, מספר פרס P30AR050950 מן המכון הלאומי של דלקת פרקים, מחלות השלד והשרירים והעור נתמך בעבודה זו (TAF וסטיבן ס 'שרר). לבסוף, שריינרים ילדים מרכז המחקר זרע מימון (TAF) נתמך על העבודה הזאת. ברצוננו להודות לד"ר יאנג, ג'ין בן עבור בתחילה הוכחת הר ההליך כולו ואיימי א 'קים על עזרתה בהפקת סקיצות של איור 1.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
שם (תיאור / כמות) | ספק | מספר קטלוגי | |
קליפר מיני עם מס '0000 Blade | Roboz | RC-5903 | |
נאיר מסיר שיער (9 גר '.) | הכנסייה דווייט ושות' בע"מ | N / A | |
בבטאדין ליטוש כירורגי (1 ליטר) | פישר סיינטיפיק | 19066452 | |
משחת עיניים (1 גר '.) | פישר סיינטיפיק | 19082795 |
כירורגי כלים:
שם (תיאור / כמות) | ספק | מספר קטלוגי |
FST 250 חם חרוז מעקר | מדע כלים עדינים | 18000-45 |
איריס מספריים (11 ס"מ) | Precision של מכשירים בעולם | 500216 |
פוטס, סמית מלקחיים (סטרייט, 18cm; 1x2 שיניים) | מדע כלים עדינים | 11024-18 |
מקפרסון, Vannas מספריים (5 להבים מ"מ) | Precision של מכשירים בעולם | 14124-G |
דומונט # 5 מלקחיים - Dumoxel תקן עצה | מדע כלים עדינים | 11252-30 |
דומונט # 5/45 מלקחיים - Dumoxel תקן עצה | מדע כלים עדינים | 11251-35 |
Hemostats יפות במיוחד (סטרייט, בתוך משטחים חלקים) | מדע כלים עדינים | 13020-12 |
אבקת פחם פעיל (500 גרם) | פישר סיינטיפיק | C272-500 |
6-0 גודל התפרים עם מחט C-1 (משי סטרילי, שחור, קלועה,שאינם נספגים, 18 "אורך; Box של 36) | Roboz | SUT-1073-1011 |
רפלקס Applier קליפ (במשך 9 קליפים מ"מ) | Precision של מכשירים בעולם | 500345 |
9 מ"מ נירוסטה רפלקס קליפים (100/box) | Precision של מכשירים בעולם | 500346 |
Animal Care:
שם (תיאור / כמות) | ספק | מספר קטלוגי |
% 0.9 סודיום כלוריד להזרקה (חינם חומר משמר; 20 מ"ל) | Hospira | 0409-4888-20 |
מערכת שלמה שמיכה Homeothermic עם בדיקה גמיש (בינוני, 115 VAC, 60 הרץ) | הרווארד Apparatus | 507222F |
כירורגי Platforמ 'ו Retractors:
(לרכוש בחנות המקומית לחומרי)
שם (תיאור /) | כמות |
פלטפורמת פלדה אל חלד (מחורץ, ~ 12 "x12" x1 / 8 ") | 1 |
לחצן מגנטים (לדוגמה: ליקוי חמה E825) | 3 |
פלדה אל חלד (3 ברגים "ארוך, קוטר נקבע על ידי מגנטים לחצן) | 3 |
נירוסטה אגוזים (בהתאמת גודל ברגים) | 9 |
גומיות (המתח אור) | 3 |
סיכות חרקים (שני הקצוות בנט טופס הוקס) | 3 |
חצי מאריה:
שם (תיאור / כמות) | הספק </ Strong> | מספר קטלוגי |
Paraformaldehyde (1 ק"ג) | Sigma-Aldrich | P6148-1 ק"ג |
פוספט נתרן Dibasic נטול מים (500 גר ', המשמשים להכנת מאגר פוספט) | פישר סיינטיפיק | S375-500 |
פוספט נתרן Monobasic נטול מים (1 ק"ג, המשמשים להכנת מאגר פוספט) | פישר סיינטיפיק | AC38987-0010 |
Glutaraldehyde (50%, 10 x 10 מ"ל) | טד פלה, Inc | 18431 |
אוסמיום Tetroxide (מימית 4%, 10 x 10 מ"ל) | טד פלה, Inc | 18465 |
פרופילן אוקסיד (450 מ"ל) | טד פלה, Inc | 18601 |
הטמע 812 (קיט, על בלוקים קשיחים / ניגודיות תמונה גבוהה) | מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים | 14120 |
Toluidiנה כחול (25 גרם) | טד פלה, Inc | 19451 |
הכנת כל הר שריר ו אימונוהיסטוכימיה:
שם (תיאור / כמות) | ספק | מספר קטלוגי |
Paraformaldehyde (1 ק"ג) | Sigma-Aldrich | P6148-1 ק"ג |
פוספט נתרן Dibasic נטול מים (500 גר ', המשמשים להכנת מאגר פוספט) | פישר סיינטיפיק | S375-500 |
פוספט נתרן Monobasic נטול מים (1 ק"ג, המשמשים להכנת מאגר פוספט) | פישר סיינטיפיק | AC38987-0010 |
10% diluent BSA / פתרון חסימת (200 מ"ל) | Kirkegaard & פרי Laboratories, Inc | 50-61-00 |
טריטון X-100 (100 מ"ל) | דוט מדעי Incorporated | 9002-93-1 |
גליצין, 98% (1 ק"ג) | פישר סיינטיפיק | AC12007-0010 |
רקמת-Tek cryo-אוקטובר מתחם (המקרה של 12, 4 בקבוקי עוז) | פישר סיינטיפיק | 14-373-65 |
Sylgard דאו 170 (2 ערכת פאונד) | פישר סיינטיפיק | NC9492579 |
נירוסטה סיכות חרקים, גודל 1 (100/pkg) | מדע כלים עדינים | 26001-40 |
Tetramethylrhodamine-A-Bungarotoxin (0.5 מ"ג) | Sigma-Aldrich | T0195-.5MG |
עכבר נוגדן חד שבטי נגד SMI-312 (0.1 מ"ל) | Covance | SMI-312R |
עכבר נוגדן חד שבטי נגד SV2 (0.1 מ"ל) | התפתחותית מחקרים Hybridoma בנק (DSHB) | SV2 |
הארנב פולינוגדן נגד משובטים GAP-43 | נובוס ביולוגיות | NB300-143 |
Flourescein מצומדות נגד עכבר עיזים IgG, Fcγ סדרה 1 ספציפי | ג'קסון ImmunoResearch | 11 5-095-205 |
DyLight 649 מצומדות נגד ארנב חמור IgG | ג'קסון ImmunoResearch | 711-495-152 |
4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, dilactate, 10 מ"ג) | Invitrogen | D3571 |
Vectashield הרכבה בינונית (10 מ"ל) | וקטור מעבדות | H-1000 |
Superfrost פלוס שקופיות מיקרוסקופ (לבן, גודל: 75 x 25 מ"מ, חבילה של 144) | פישר סיינטיפיק | 12-550-15 |
Fisherfinest כיסוי פרימיום משקפיים (גודל: 40 x 22 מ"מ; חפיסת עוז 1.) | פישר סיינטיפיק | 12-548-5C |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved