Method Article
En este informe se describe un método para aplastar el nervio ciático del ratón. Este método usa unas pinzas hemostáticas fácilmente disponibles y fácilmente reproducible y produce aplastamiento completo del nervio ciático. Además, se describe un método para preparar soportes de músculo entero adecuadas para el análisis de la regeneración del nervio después de aplastamiento del nervio ciático.
La regeneración en el sistema nervioso periférico (SNP) está ampliamente estudiada tanto por su relevancia para las enfermedades humanas y entender la respuesta contundente de regeneración montada por las neuronas del SNP por lo tanto, posiblemente, iluminando los fracasos de la regeneración del SNC 1. Aplastamiento del nervio ciático (axonotmesis) es uno de los modelos más comunes de lesión del nervio periférico en roedores 2. Triturado interrumpe todos los axones pero láminas de Schwann de células basales se conservan por lo que la regeneración es óptimo 3,4. Esto permite que el investigador para estudiar precisamente la capacidad de un axón en crecimiento para interactuar tanto con la célula de Schwann y láminas basales 4. Las ratas han sido por lo general los modelos animales preferidos para el aplastamiento del nervio experimental. Están ampliamente disponibles y su nervio ciático lesionado proporciona una aproximación razonable de las lesiones nerviosas humanas 5,4. Aunque de menor tamaño que los nervios de rata, el nervio del ratón tiene muchas cualidades similares. Pero lo más importante, los Memorandos de Entendimientomodelos e son cada vez más valiosa, debido a la amplia disponibilidad de líneas transgénicas ahora permite una disección detallada de las moléculas individuales fundamentales para la regeneración del nervio 6, 7. Antes los investigadores han utilizado varios métodos para producir un aplastamiento del nervio o lesión incluyendo simples pinzas de ángulo, pinzas frías, pinzas hemostáticas, pinzas vasculares, y las abrazaderas diseñadas por el investigador 8,9,10,11,12. Los investigadores también han utilizado diversos métodos para marcar el sitio de la lesión incluyendo la sutura, las partículas de carbono y perlas fluorescentes 13,14,1. Se describe nuestro método para obtener un flechazo nervio ciático reproducible completa con información precisa y persistente marcaje de la aglomeración de sitio, con una pinza hemostática y finas de carbono posteriores al aplastamiento marcar el sitio. Como parte de nuestra descripción del procedimiento del nervio ciático aplastar también hemos incluido un método relativamente simple de montar todo el músculo que utilizamos para cuantificar posteriormente la regeneración.
1. Los sujetos animales
1,1. Tratamiento
1,2. Preparación quirúrgica
2. Crush reproducible del nervio ciático
3. Cuidados post-operatorios
4. Semi-delgadas Preparación
5. Todo el montaje en la preparación muscular
6. Medición de la regeneración
7. Los resultados representativos
Figura 1. Esquema de la anatomía de las extremidades posteriores importante aplastamiento del nervio. A. Una incisión en la piel de medio punto se ha hecho revelando la musculatura subyacente. B. La musculatura glútea se ha separado, y puso de manifiesto el nervio ciático (paso 2.4). Una flecha indica el lugar aproximado de aplastamiento. Colocación retractor se muestra como una guía general, y se ajusta durante cada cirugía para aliviar la visualización del ciático y el enfoque de las pinzas hemostáticas para aplastar B (recuadro):. La colocación del ciático en la mandíbula inferior de las pinzas hemostáticas justo antes de aplastamiento (paso 2,5 supra). Fascículos separados están etiquetados para demostrar que son adyacentes en sentido horizontal, pero no verticalmente, durante el enamoramiento. Aunque tres fascículos están etiquetados en este diagrama, también se puede ver un fascículo en cuarto lugar, la rama articular del peroné. Para un dibujo anatómico más detallado de los patrones de ramificación de fascículos del nervio ciático distal hasta el punto de aplastamiento, por favor refiérase a la anatomía de Greene de la Rata, Figura 188 17.
Figura 2. Un sitio aplastamiento de carbono marcado in situ y azul de toluidina-manchado, semi-delgadas secciones de nervio ciático triturado. A. Un ejemplo de un sitio aplastamiento in situ (extremidad posterior izquierda). El carbono negro indica el sitio de aplastamiento. El asterisco marca una rama del nervio tibial que inerva musculatura del muslo y sirve como un punto de referencia útil durante la cirugía por aplastamiento. La división tibial del nervio ciático se describe en el azul, el peroneo en verde, y el sural en amarillo. B. Semi-secciones delgadas demostrando un aplastamiento completo realizado por la fuerza hemostáticaps. C. Semi-secciones delgadas que muestran un aplastamiento incompleta realizó con fórceps angulados. En ambas imágenes degeneración perfiles de mielina están marcados con flechas. En el panel de flechas C marcar ejemplos de perfiles de la mielina en conserva y un conjunto de axones a salvo. Barra de escala es de 10 micras.
Figura 3 esquemática muscular en todo el montaje y NMJs representativas. AC:. Las imágenes renderizadas de EDL (A), del peroneo lateral largo (B) y sóleo (C) los músculos después de la eliminación de las extremidades posteriores. Los músculos se muestran son de la extremidad posterior derecha. Rodilla y orientación anatómica del tobillo también se incluyen como referencia. Los tendones son de color blanco y se describe en una línea de color negro sólido cuando se lo coloca en la parte superior del músculo. Ellos se resumen en una línea discontinua negro cuando se extienden por debajo del músculo. Los cortes se muestran en líneas discontinuas de color rojo.El músculo se despega de sitios de corte, como se indica por las flechas azules, y se diluyó posteriormente. Después de adelgazamiento, el músculo se separa de los pines, cortando todo lo que queda de los tendones anclados DF:. Las imágenes renderizadas de los músculos de montaje entero tras la eliminación del tejido conectivo y posterior adelgazamiento. Las bandas de placa terminal se exponen en cada músculo de GH:. El músculo sóleo de montaje toda catorce días después de aplastar el nervio ciático que demuestra de nuevo inervados (G) y denervado (H), las uniones neuromusculares. En estos paneles, NMJs, axones y células de Schwann son visualizados como se describió anteriormente en la sección 5.5.1. Los receptores de acetilcolina son de color rojo, verde axones y células de Schwann procesa azul. En el panel G, las flechas indican las zonas de la NMJ que han sido re-inervados por un axón. En el panel de puntas de flecha indican H GAP-43 procesos positivos de células de Schwann. Nótese la ausencia de los axones. Barra de escala es de 10 micras.
Hemos presentado un método para obtener un flechazo nervio ciático fiable completa con identificación exacta del sitio de aplastamiento. Como se mencionó anteriormente, aplastamiento del nervio ciático es un modelo común de lesión del nervio periférico en ratones y ratas. Aunque cada método de aplastamiento tiene sus ventajas y desventajas, nos pareció que este método produce un flechazo total que se marcó con facilidad con un mínimo de equipos especiales (por ejemplo, unas pinzas especiales, etc.)
Métodos de Crush
El instrumento más común utilizado para el aplastamiento del nervio ciático del ratón es el N º 5 pinza en ángulo. Si bien es posible obtener un flechazo total con este método, se encontró que este instrumento produce un flechazo variable (muy poca fuerza dejando a los axones ahorrado grandes o demasiado desgarro del nervio), especialmente en las manos de un nuevo usuario.
Otros métodos menos comunes que se utilizan para producir aplastamiento son pequeños clips de aneurisma, pinzas refrigerados con nitrógeno líquido, y specially fabricados, calibrados y no dentadas abrazaderas 9,12,5,7. Cada uno de estos instrumentos de forma fiable puede producir un aplastamiento completo. Elegimos unas pinzas hemostáticas, porque el instrumento es fácil de obtener, produce un flechazo fiable, y permite la clara marca del sitio de aplastamiento. Uno de los inconvenientes de las pinzas hemostáticas es que no puede medir la fuerza producida durante el enamoramiento. Sin embargo, una vez probado, unas pinzas hemostáticas, producirá un aplastamiento completo, y puede ser fácilmente sustituida por una pinza idénticos si las pinzas se dañan.
No importa el método elegido para llevar a cabo un flechazo, tal vez la parte más crítica del procedimiento de aplastamiento es para verificar la integridad de aplastamiento del nervio. Esto es especialmente importante en las manos de un usuario nuevo. Semi-fino análisis de nervio distal al sitio de la lesión (Figura 2) proporciona un método sencillo para hacerlo y puede revelar un aplastamiento completo (Figura 2, panel B) o un aplastamiento incompleto (Figura 2, panel C).
La consideración final en el método de aplastamiento es la duración de la aglomeración. Hemos probado por aplastamiento duraciones de 15 segundos a 60 segundos de tiempo de enamoramiento total, con ninguna diferencia en la translucidez del nervio o la preservación de las fibras mielinizadas. Esto es consistente con las observaciones de la Puente y sus colegas, que en comparación con amores de 15-60 segundos de duración en el nervio ciático de la rata con fórceps de un joyero y no encontró diferencias significativas morfológicos, histológicos, electrofisiológicos, o funcional entre las diferentes duraciones de aplastamiento 18. Sin embargo, mayores tiempos de aplastamiento o aplasta que degradan significativamente el endoneuro células Schwann se altera la tasa y / o el éxito de la regeneración.
Métodos de marcado
Los dos métodos viables para el sitio de aplastamiento de marcado que no sea carbón en polvo son una sutura de 10-0 a través del epineuro del nervio ciático 13,19, y FluoSpheres producido por Molecular Probes, Eugene, OR 1 . Una sutura 10-0 groseramente marca el sitio aplastamiento, pero requiere un mayor nivel de habilidad microquirúrgica, y la variabilidad en la aplicación de los resultados de sutura en menos preciso marcado de los límites del sitio aplastamiento de carbono marcado. Cuando se estudia la tasa de regeneración, el límite del vertedero y al aplastamiento debe ser precisamente marcada después de la lesión. No hemos investigado FluoSpheres, sin embargo, que cumplan los criterios para la precisión y la persistencia de aplastar el sitio marcado. Son particularmente útiles cuando la imagen in vivo regeneración en líneas de ratones YFP 1. Para nuestros propósitos, nos pareció que el marcado de carbono adecuada y de bajo costo, con el beneficio adicional de ser fácilmente visto en la posterior evaluación microscópica semi-fino o de electrones. Además, hemos encontrado que el carbono marcado persiste durante al menos seis semanas por lo que es adecuado para los experimentos de mayor duración.
Análisis de la regeneración después de aplastar
Un total investigacionesción de la regeneración posterior aplastamiento combina evaluaciones funcionales, electrofisiológicas y morfológicas 5,16. Evaluaciones morfológicas después de la regeneración son, quizás, el más común. Estas evaluaciones pueden ser separados en los que evaluar la latencia de crecimiento, tasa de crecimiento axonal, y la especificidad de la reinervación 16. En este informe, hemos presentado un todo el procedimiento de montaje del músculo que se puede utilizar para evaluar de forma rápida la regeneración morfológica (Figura 3). En este análisis NMJs denervados marcados por la alfa-bungarotoxina y la célula de Schwann GAP-43 se han cuantificado y comparado con re-inervados uniones como etiquetados por neurofilamentos, SV2, y alfa-bungarotoxina. GAP-43 es marcadamente upregulated por las células de Schwann después de la denervación y bien identifica denervado terminales células de Schwann en la unión neuromuscular 20. Aunque GAP-43 se expresa por los axones, el uso concomitante de neurofilamentos fácilmente distingue 43 GAP-axones positivos a partir de células de Schwann. Además,porque NMJs profundas dentro del músculo no puede ser fácilmente etiquetados por el anticuerpo (en comparación con la molécula pequeña alfa-bungarotoxina) de células de Schwann GAP-43 inmunoreactividad importante confirma el estado de un denervado unión neuromuscular y mejora la precisión al contar NMJs denervados.
Este método proporciona un método sencillo y eficiente para evaluar el estado de la banda de reinervación muscular placa terminal de una vez. Otros han utilizado tu PPC-1-(23) / S100 buenas prácticas agrarias de los ratones que expresan la proteína fluorescente cian en los axones y las buenas prácticas agrarias en las células de Schwann de seguir re-inervación de los tibiales anteriores después de aplastamiento del nervio ciático 2. Una advertencia debe tenerse en cuenta, sin embargo. Este método se basa en los neurofilamentos y SV2 inmunoreactividad para cuantificar la reinervación. Es posible que axón resultado puede ser sin impedimentos pero la expresión subsiguiente de SV2 puede retrasarse 21. Por lo tanto, en algunos experimentos, será importante para confirmar que la regeneración retardada y no delayed expresión presináptica de SV2 (es decir, pre-sináptica de diferenciación) representan un fenotipo observado.
No tenemos nada que revelar.
Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones K08NS065157 (al TAF) Además, el Centro Penn para los trastornos musculoesqueléticos, P30AR050950 Premio Número del Instituto Nacional de Artritis, Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel apoya este trabajo (TAF y Steven S. Scherer). Por último, Shriners Pediatric Research Center financiación inicial (TAF) apoya este trabajo. Nos gustaría agradecer al Dr. Young-Jin Hijo de un principio que demuestra todo el procedimiento de montaje y Amy A. Kim, por su asistencia en la elaboración de los bocetos de la figura 1.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nombre (descripción / cantidad) | Proveedor | Número de catálogo | |
Clipper Mini 0000 con el N º hoja | Roboz | RC-5903 | |
Nair depilación (9 oz.) | Iglesia y Dwight Co., Inc. | N / A | |
Betadine lavado quirúrgico (1 galón) | Fisher Scientific | 19066452 | |
Ungüento oftálmico (1 oz.) | Fisher Scientific | 19082795 |
Herramientas quirúrgicas:
Nombre (descripción / cantidad) | Proveedor | Número de catálogo |
FST 250 Hot cordón esterilizador | Herramientas de Bellas Ciencia | 18000-45 |
Iris Tijeras (11 cm de largo) | World Precision Instruments | 500216 |
Potts-Smith Pinzas (recta, 18 cm; 1x2 dientes) | Herramientas de Bellas Ciencia | 11024-18 |
McPherson Vannas Tijeras (5 cuchillas mm) | World Precision Instruments | 14124-G |
Dumont # 5 Pinzas-Dumoxel Standard Tip | Herramientas de Bellas Ciencia | 11252-30 |
Dumont º 5/45 Pinzas-Dumoxel Standard Tip | Herramientas de Bellas Ciencia | 11251-35 |
Ultra Hemostats Bellas (recto; superficies lisas en su interior) | Herramientas de Bellas Ciencia | 13020-12 |
Carbón activado en polvo (500 g) | Fisher Scientific | C272-500 |
Tamaño 6-0 Suturas con aguja C-1 (Silk estéril, Negro, trenzado,No absorbible, 18 "de longitud, caja de 36) | Roboz | SUT-1073-1011 |
Reflejo de aplicador de clips (de 9 mm clips) | World Precision Instruments | 500345 |
9 mm de acero inoxidable Reflex Clips (caja de 100) | World Precision Instruments | 500346 |
Cuidado de Animales:
Nombre (descripción / cantidad) | Proveedor | Número de catálogo |
De sodio al 0,9% de cloruro de inyección (sin conservantes; 20 ml) | Hospira | 0409-4888-20 |
Sistema completo Manta homeotérmicos con sonda flexible (mediana, 115 VAC, 60 Hz) | Aparato de Harvard | 507222F |
Platfor quirúrgicam, y retractores:
(Comprada en la tienda local de hardware)
Nombre (descripción /) | Cantidad |
Plataforma de acero inoxidable (molido; ~ 12 "x12" x1 / 8 ") | 1 |
Botón de imanes (Ejemplo: Eclipse E825) | 3 |
Pernos de acero inoxidable (3 "de largo, diámetro determinado por el imán de botón) | 3 |
Tuercas de acero inoxidable (tamaño para adaptarse a los pernos) | 9 |
Las bandas de goma (tensión de Luz) | 3 |
Pasadores de insectos (ambos extremos doblados para formar ganchos) | 3 |
Semi-Thins:
Nombre (descripción / cantidad) | Proveedor </ Strong> | Número de catálogo |
El paraformaldehído (1 kg) | Sigma-Aldrich | P6148-1kg |
Fosfato de sodio dibásico anhidro (500 g, que se utiliza para preparar tampón fosfato) | Fisher Scientific | S375-500 |
Fosfato de sodio monobásico anhidro (1 kg, que se utiliza para preparar tampón fosfato) | Fisher Scientific | AC38987-0010 |
Glutaraldehído (50%; 10 x 10 ml) | Ted Pella, Inc. | 18431 |
Tetróxido de osmio (4% acuoso, 10 x 10 ml) | Ted Pella, Inc. | 18465 |
Óxido de propileno (450 ml) | Ted Pella, Inc. | 18601 |
Insertar 812 (Kit, para los bloques de disco duro o alto contraste de imagen) | Microscopía Electrónica de Ciencias | 14120 |
Toluidine Azul (25 g) | Ted Pella, Inc. | 19451 |
Todo el montaje en la preparación muscular y de inmunohistoquímica:
Nombre (descripción / cantidad) | Proveedor | Número de catálogo |
El paraformaldehído (1 kg) | Sigma-Aldrich | P6148-1kg |
Fosfato de sodio dibásico anhidro (500 g, que se utiliza para preparar tampón fosfato) | Fisher Scientific | S375-500 |
Fosfato de sodio monobásico anhidro (1 kg, que se utiliza para preparar tampón fosfato) | Fisher Scientific | AC38987-0010 |
10% de diluyente de BSA / solución de bloqueo (200 ml) | Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. | 50-61-00 |
Triton X-100 (100 ml) | Punto Científico Incorporated | 9002-93-1 |
La glicina, 98% (1 kg) | Fisher Scientific | AC12007-0010 |
Tissue-Tek Cryo-octubre Compuesto (Caja de 12, 4 botellas de oz) | Fisher Scientific | 14-373-65 |
Sylgard DOW 170 (2 Kit de libras) | Fisher Scientific | NC9492579 |
Pasadores de acero inoxidable de insectos, tamaño 1 (100/caja) | Herramientas de Bellas Ciencia | 26001-40 |
Tetrametilrodamina-A-bungarotoxina (0,5 mg) | Sigma-Aldrich | T0195-.5MG |
Anticuerpo monoclonal de ratón contra el SMI-312 (0,1 ml) | Covance | SMI-312R |
Anticuerpo monoclonal de ratón contra SV2 (0,1 ml) | Estudios del Desarrollo del Banco hibridoma (DSHB) | SV2 |
Conejo Polyanticuerpo monoclonal contra el GAP-43 | Novus Productos Biológicos | NB300-143 |
Fluoresceína conjugado de cabra anti-IgG de ratón, Fc gamma Subclase una específica | Jackson ImmunoResearch | 11 5-095-205 |
DyLight 649 burro conjugado anti-IgG de conejo | Jackson ImmunoResearch | 711-495-152 |
4 ',6-diamino-2-fenilindol (DAPI, dilactato; 10 mg) | Invitrogen | D3571 |
Medio de montaje Vectashield (10 ml) | Vector Laboratories | H-1000 |
Superfrost Plus preparaciones para microscopio (Blanco, Tamaño: 75 x 25 mm, paquete de 144) | Fisher Scientific | 12-550-15 |
Fisherfinest gafas Premium Cover (Tamaño: 40 x 22 mm; Paquete de 1 oz.) | Fisher Scientific | 12-548-5C |
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