הר שלם

כל זה הר באתר פרוטוקול ההכלאה דן שלבים קריטיים המבטיחים תוצאות באיכות גבוהה לשעתק לביטוי במחקרי גן בעוברי עכברי E8.5-E11.5 יום ישנים.

ההר כולו בהכלאה באתר הוא גישה מאוד אינפורמטיבי להגדרת דפוסי ביטוי גנטי בעוברים. בנהלי כלאה באתר הם ארוכים ותובעני מבחינה טכנית עם צעדים חשובים רבים שביחד תורמים לאיכות התוצאה הסופית. פרוטוקול זה מתאר בפירוט כמה צעדים מרכזי בקרת איכות לייעול תיוג חללית וביצועים. באופן כללי, הפרוטוקול שלנו מספק תיאור מפורט של הצעדים הדרושים לקריטיים reproducibly להשיג תוצאות באיכות גבוהה. ראשית, אנו מתארים את הדור של digoxygenin (DIG) בדיקות שכותרתו RNA באמצעות שעתוק במבחנה של תבניות שנוצרו על ידי PCR DNA. אנחנו מתארים שלושה מבחני בקרת איכות קריטיות לקביעת הסכום, היושרה והפעילות ספציפית של בדיקות DIG-הכותרת. פעולות אלה הן חשובות ליצירת חללית של מספיק רגיש כדי לזהות mRNAs אנדוגניים בעבר עכבר כולו.בנוסף, אנו מתארים שיטות לקיבוע והאחסון של עוברי עכברי E8.5-E11.5 יום ישנים לכלאה באתר. לאחר מכן, אנו מתארים שיטות מפורטות לעיכול K proteinase המוגבל של עוברי rehydrated אחרי את פירוט תנאי ההכלאה, התחליבים לאחר ההכלאה וטיפול RNase להסיר הכלאת בדיקה אינה ספציפית. נוגדן AP מצומדות משמש כדי להמחיש את החללית שהכותרת ולחשוף דפוס הביטוי של תמליל אנדוגני. נציג תוצאות מוצגות מניסויים מוצלחים וניסויים לא טובים טיפוסיים.

1. דור Riboprobe באמצעות שעתוק במבחנה

1. הכנת מוצרי PCR לתבניות שעתוק במבחנה.
   1. פריימרים תכנון PCR עם רצפי פרומוטר שעתוק phage בקצות 5 'שלהם.
      הערה: רצף האמרגן הוסיף ל5'end של פריימר PCR תחושת הגדיל ישמש לתעתוק בדיקת התחושה, ורצף האמרגן הוסיף ל5'end של פריימר PCR antisense ישמש לסינתזת הבדיקה אנטי תחושה ^1-3. יש לנו לא זוהה כל הבדל ביעילות שעתוק בין תבניות המכילות רק את הרצפים לעומת תבניות המכילות מקדם הליבה בתוספת רצפים נוספים 5 'פרומוטר הליבה. שיטה זו נמצאת בשימוש עם ה-T3, T7 וSP6 יזמי phage.
      רצפים ששמורים באבולוציה בין בני משפחת גנים או רצפים חוזרים ונשנים מאוד יש להימנע מאחר והם עלולים לגרום להכלאה בלתי ספציפית וthereby להגדיל מכתים רקע. בדיקות עם תוכן GC גבוה תהיינה התאגדות digoxigenin-rUTP מוגבלת ורצפי DNA תבנית עם ריצות של שאריות T תגבלנה ההתאגדות של חפירות-UTP עקב הפרעה סטרית בין מולקולות digoxigenin. אורך החללית יכול לנוע בין 300bp ל1KB. אבל כל עוד את הקריטריונים הנ"ל מתקיימים, בדרך כלל בדיקות ארוכות יותר יש פעילויות ספציפיות גבוהות יותר.
   2. התבנית לPCR יכולה להיות שיבוט פלסמיד, שיבוט גנטי או הדנ"א הגנומי. בדרך כלל אנו לרכוש שיבוטי EST באורך מלא (לדוגמה מATCC או הפתוח Biosystems) שישמשו כתבניות PCR. מגדיל את הדנ"א התבנית באמצעות PCR נהלים סטנדרטיים כדי לייצר מוצר PCR המכיל את רצפי פרומוטר. כדי להפוך את תבניות בדיקה מספיק לתמיכה במספר תגובות סינתזת בדיקה אנחנו בדרך כלל להגדיר 8 50μl PCRs x. התגובות שלהם נקוו לצעד הבא. באופן כללי כמה PCRs נפח גדול או בתגובות קטנות יותר (כגון תגובות 50μl אנו משתמשים) שלמחדש מספיק כדי לייצר מספיק תבנית לכמה תגובות סינתזת בדיקה.
   3. כדי להסיר חלבונים מזהמים, בעיקר עקבות של RNase בהכנות פלסמיד, לעכל כל 100μl של תגובת PCR עם 1μl של 20mg/ml proteinase K ב 55 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפחות. כל ריאגנטים ופריטים אחרים המשמשים לאחר עיכול K proteinase זה צריכים להיות RNase חופשיים ובמיוחד מוקדשים לעבודת רנ"א.
   4. במהלך עיכול K proteinase, לרוץ דגם תגובת PCR על ג'ל כדי לבדוק את תקינותו של מוצר ה-PCR. אנו משתמשים בג'ל מיני acrylamide כדי לפתור מוצרים קטנים PCR (פחות מ 600-700 נקודתי בסיס) וג'ל agarose כדי לפתור מוצרי PCR גדולים (> 600-700 נקודתי בסיס) לניתוח בקרת איכות. אם אתה רואה להקות מרובות בג'ל, מומלץ לבצע אופטימיזציה תגובת PCR, כך שאתם מקבלים מוצר PCR יחיד של הגודל הנכון.
   5. יסודיות לחלץ K proteinase מתעכל תגובת PCR עם נפח שווה אחד פנול / כלורופורם (1:1) mixtיור, ואחרי שאיבה עם נפח שווה אחד כלורופורם. מערבב בכל שלב על ידי vortexing הצינור לפחות 30 שניות. יש לבצע את הפעולות הבאות במנדף כימי.
   6. תזרז את מוצר PCR המטוהר על ידי הוספת נפח 0.1 נתרן יצטט 3M ו 2 כרכים של אתנול 100%. השאר ב-20 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפחות.
   7. ספין במשך 5 דקות ב13000 סל"ד בmicrocentrifuge, להסיר supernatant ולשטוף עם אתנול 70%. אפשר דנ"א הגלולה להתייבש לחלוטין.
   8. דנ"א resuspend בהיקף המתאים (למשל 50μl) של 1xTE. למדוד את ריכוז ה-DNA באמצעות fluorometer.
   9. לקבוע את רצף הנוקליאוטידים של כל הכנת תבנית PCR באמצעות פריימרים מתאימים לרצפי פרומוטר phage או רצף פנימי בתוך החללית. זהו צעד קריטי בקרת איכות שמבטיח כי תבנית הבדיקה היא של הרצף הנכון.
   10. ה-DNA היא מוכנה לשמש כתבנית לתמליל מבחנהיון. אחסן את תבנית ה-DNA ב 4 ° C.
2. בשעתוק מבחנה באמצעות מוצר ה-PCR כתבנית.
   1. הגדרת תגובת שעתוק RNA בנפח סופי של 50μl. תגובת השעתוק כוללת 500 - 1000 ng של DNA תבנית, 5μl של מאגר התמלול 10X (עם DTT 100mm), 10μl 2.5mm חפירות-NTP לערבב, 3μl (50 ~ 90 יחידות) של RNA פולימראז, 1μl ^אלפא-32 P CTP (עד עד 6 חודשים) ושאר הנפח מורכב על ידי הוספת מי diethylpyrocarbonate טופלו. תמהיל 2.5mm חפירות-NTP מורכב בדרך כלל כמו מנייה עובדת 40μl מכילה 10μl 10mm CTP, GTP 10μl 10mm, 10mm 10μl ATP, 6.5μl 10mm UTP, 3.5μl 10mm digoxigenin-11 UTP. בהרכבת תגובת השעתוק, להיות בטוח שכל מרכיבי התגובה (פרט לאנזים) מתחממים לטמפרטורת חדר. מערבב את ה-DNA והמים ראשונים, לאחר מכן להוסיף את תגובת החיץ, לערבב ולאחר מכן להוסיף את שאר המרכיביםאחרת spermidine במאגר השעתוק יזרז את ה-DNA. דגירה עבור 2 שעות בטמפרטורה המומלצת לRNA פולימראז בשימוש.
      הערה: P ^α-32 נוסף לתגובה כדי לאפשר לך לקבוע את שיעור ברכת נוקלאוטיד מתחיל ששולבה בחללית רנ"א. זהו מדד חשוב ליעילות של התגובה. כל השלבים הבאים בצעו נהלים לטיפול ³² פ
      שיטה חלופית למדידת כמות חללית RNA המסונתז היא להשתמש בספקטרופוטומטר נפח קטן. זה ימנע את השימוש בתיוג ³² P (ראה הערות בשלב 1.3.1)
   2. במהלך הדקות אחרונות של דגירה, להכין את טור הספין המהיר (רוש) על פי הוראות היצרן.
   3. לאחר דגירה, להוסיף 1μl של RNase החופשי DNase אני ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   4. מדולל ל100μl עם 50μl של חיץ דילול תגובה (טריס 20mmpH7.5, 1% SDS, EDTA 20mm, 100mm NaCl (RNase חופשי, לעשות 50 מיליליטר מניות וחנות בטמפרטורת חדר)). קח 1μl (בדרך כלל ל4μl של 1x TE) לנצנץ מספירה של הספירה החל כוללת ולניתוח ג'ל.
   5. החל שאר התגובה על מרכז מיטת העמודה והספין ב1100 X גרם ל4 דקות בצנטריפוגה קלינית בראש הטבלה. אחרי ספין חללית RNA שלך היא בצינור האיסוף.
   6. מוסיף 2 כרכים של 100% אתנול לתגובת eluted. מערבב היטב ולשמור על קרח ל5min (או ב-20 ° C או 30 דקות).
   7. ספין בצינור microcentrifuge בסל"ד המקסימאלי במשך 5 דקות עד גלולת RNA החללית.
   8. להסיר לגמרי את supernatant ידי פיפטה ולתת גלולת האוויר היבש. אל תתנה לגלולה על היבשה כי זה יהיה קשה מאוד לפרק אותו.
   9. ממס את רנ"א חללית עם 50 μl - 100 1xTE μl או DEPC-H ₂ O. קח לדוגמא 1 μl לקביעת אחוזים והתאגדות לניתוח denaturing ג'ל acrylamide. התאם ריכוז בדיקתך עד 100 ng / μl פי אומדן התשואה.
   10. בדיקות שעברו כל שלוש בקרות האיכות ניתן אז מאוחסנת ב-20 מעלות צלזיוס במשך 6 חודשים to12. אנחנו בדרך כלל למצות את מלאי בדיקה תוך 12 חודשים. סביר מאוד להניח כי בדיקות ניתן לאחסן לתקופות ארוכות מאוד ב- 20C.
3. הערכת איכות riboprobe - תשואת בדיקת מדידה.
   1. כדי לאמוד את תשואת הבדיקה, לחלק את הספירה התאוששה לאחר עמודת הספין על ידי הספירה בתגובה לפני עמודת הספין (נמדד בדגימות שנלקחו בפרוטוקול סינתזת הבדיקה). לתגובה זו, התאגדות 100% = 33 מיקרוגרם. תגובה מוצלחת בדרך כלל נותנת תשואה 15-50%. בדיקות עם התאגדות פחות מ 15% (<5 תשואת מיקרוגרם) לא צריכות להיות בשימוש.
      הערה: שיטה חלופית למדידת תשואת חללית היא להשתמש בספקטרופוטומטר נפח קטן או fluorometerישירות למדידת הכמות של RNA להציג לאחר כרומטוגרפיה עמודת ספין. גישה חלופית זו מונעת את השימוש בתיוג ³² P עקבות. יש לנו נמדדנו ריכוז riboprobe באמצעות ספקטרופוטומטר Microplate אפוק BioTek. השוואה בין הערכים המתקבלים מספקטרופוטומטר להערכות של מסת riboprobe משילוב P ³² הראתה כי שתי שיטות נותנות תוצאות דומות באמצעות מדגם קטן נפח דומה (2 μl) מהכנת החללית הסופית.
      כמעט תמיד נמוכה מאוד או ללא תשואה נובעת מזיהום שמקורו RNase הכנת פלסמיד המשמשת כתבנית לPCR. הקפד לטפל DNA פלסמיד לבין מוצר PCR עם proteinase K כמתואר בשלב 1.1.3.
4. הערכת איכות riboprobe - מדידת פעילות ספציפית.
   1. כדי למדוד את היקף digoxigenin - התאגדות UTP לבצע בדיקה במקום. זה CRUמבחן בקרת איכות חברתית.
      התאם את ריכוז החללית עד 100 ng / μl. μl ספוט 1 מתוך דילולים סידוריים (10 ^-2 עד 10 ^-5) של החללית על קוטר 82mm של מסנן ניילון שווה ערך האחר + Hybond-N (GE Healthcare) או. כולל דגימת DNA ללא תווית כביקורת שלילית. Crosslink המסנן הלח מייד בcrosslinker UV ב125mJoules או לפי הוראות היצרן למסנן הניילון אתה משתמש.
      את כל השלבים הבאים (1.4.2 - 1.4.6) מתבצעים בצלחת פטרי על פלטפורמה מתנדנדת בטמפרטורת חדר. אתה לא צריך לדאוג RNase אחרי שהבחין בדילולי הבדיקה על הפילטר
   2. לחסום את המסנן במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר ב10 מ"ל של 1% חסימת מגיב (רוש) ב1X TN (= 1M טריס pH7.5, 1.5M 10X TN חיץ NaCl)
   3. שטוף 1 X 15 דקות בחיץ 10ml 1X TN.
   4. דגירה עם בר Fab digoxigenin אנטי בדילול 1/5000 ב1X TN חיץ במשך 30 דקות.
   5. שטוף 2 X 15 דקות בחיץ 10ml 1X TN.
   6. תגובת הצבע מתבצעת עם מצע סגול בע"מ (צריך כ 5 מ"ל במנה). צבע צריך להיות גלוי על המקום מהדילול 10 ^-4 תוך 30 דקות. בשלב זה, לעצור את תגובת הצבע על ידי שטיפת 2 פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם TE 5X. אם האות אינה גלויה בנקודה מתאימה לדילול ^-4 10 אז הבדיקה אמורה להיות מושלכת.
      הערה: מניסיוננו, פעילות ספציפית לקויה נמצאה רק עם בדיקות קצרות. הגדלת הגודל של תבנית הבדיקה (עד 1KB) תוך שמירה על עיצוב קריטריונים האחרים המפורטים בפרוטוקול זה צריכה להגדיל את הפעילות הספציפית של החללית. פעילות ספציפית נמוכה מובילה לרמות נמוכות או בלתי ניתנות לגילוי של אות.
5. בדוק את תקינותו של החללית על ידי אלקטרופורזה באמצעות ג'ל acrylamide 5% denaturing.
   זהו עוד assay בקרת איכות חשובה.פרוטוקול זה מבוסס על הנחה שהבדיקה סומנה בתווית עם ³² P במהלך תגובת הסינתזה (ראה שלב 1.2.1). אנו משתמשים בג'ל denaturing acrylamide לספק רזולוציה גבוהה מאוד, המאפשרים לנו לזהות בדיקות מושפלות או לא שלמות בקלות. בדרך כלל 5% acrylamide minigel (אוריאת denaturing 7.5g,% acrylamide 1.9ml 40, 1.9ml 2% bis-acrylamide (או להשתמש 20:01 acrylamide: פתרוני bis-acrylamide), מאגר ג'ל 1.5ml 10X מגבים (0.2 מ 'morpholinopropanesulfonic חומצה, pH7.0, יצטט 50mm נתרן EDTA 5mm) וH ₂ O לנפח סופי של 15 מ"ל) עובדת טוב מאוד לפתרון בדיקות בגודל נע בשימוש בפרוטוקול זה.
   הערה: כחלופה, ג'לי TBE-אוריאת precast ניתן לרכוש מספקים שונים. בצע את הוראות היצרן להפעלת ג'לי טרומי.
   1. מערבב את המדגם עם נפח שווה של חיץ טוען ג'ל (Ambion) ומערבב היטב.
   2. חום עד 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לפגל כל מבנה שניוני.
   3. Immediately מגניב על קרח לפני הטעינה על ג'ל למנוע מחדש חישול-.
   4. הפעל לפני ואחרי דגימות העמודות יחד ב200v עד הצבע הכחול פועל לסוף ג'ל. ג'ל מנוהל במאגר ג'ל מגבי 1X.
   5. עטוף את הג'ל בניילון נצמד ולחשוף אותו לצילום רנטגן סרט או מסך imager זרחן כדי לזהות RNA radiolabeled. אם תיוג ³² P אינו משמש אתה יכול להכתים את הג'ל עם צבע פלואורסצנטי קונבנציונלי לגילוי RNA
   6. סינתזת חללית מוצלחת תביא לבדיקות RNA שנודדת כלהקה חדה מאוד קרובה לחלק העליון של ג'ל.

2. איסוף ואחסון של עוברי עכברים

1. עוברי עכברים יש לאסוף בקרח הקר PBST (PBS + 0.1% Tween 20, (diethylpyrocarbonate (DEPC) שטופל)) ושמרו על קרח במהלך הנתיחה.
2. העוברים מעובדים ב4 בקבוקוני זכוכית הכתירו בורג מ"ל. עוברים מרובים יכולים להיות קבועים בבקבוקון אחד. E9.5 רבים כמו 10-15או 5 עוברי E10.5 יכולים להיות קבועים בבקבוקון אחד. בשל גודלו הגובר של העובר, עוברי E11.5 יש התפצל לפתע בסכין גילוח לפני הקיבעון לסייע בגישה במהלך בדיקת ההכלאה. עד 3 עוברים התפצלו לפתע E11.5 יכולים להיות ממוקמים בבקבוקון אחד.
3. על מנת למקסם את האפקטיביות של הצעדים בפרוטוקול זה וכדי לצמצם את הניזק לעוברים, קיבעון עובר וכל הכביסות שמבוצעות בבקבוקוני דוגמה עם פתרונות מלאים לרמה הנמוכה יותר של צוואר הבקבוקון כך שרק בועת אוויר קטנה נשארת, אלא אם כן צוין. לכל שלבי שטיפת מבחנות מונחות על צדם על פלטפורמת נדנדה.
4. תקן עבור 6 שעות ללילה ב 4 ° C על שולחן עם נדנדת paraformaldehyde 4% (PFA) בPBST. בקבוקונים צריכים להיות ממוקמים בצורה אופקית והתנדנדו על פלטפורמת נדנדה ב 4 ° C.
5. לאחר קיבוע, עוברים נשטפים פעמים במשך 5 דקות כל אחד בPBST על קרח ולאחר מכן בשלבי התייבשות דרך methaנול / PBST סדרה (מתנול 25% בPBST, 50% מתנול בPBST ו75% מתנול בPBST) לתוך מתנול 100% על ידי החלפת פתרונות בבקבוקון הזכוכית באמצעות pipettes פסטר. עוברים יכולים להיות מאוחסנים ב- 20C במתנול 100% במשך 8 חודשים ואולי יותר.

3. כלאה של digoxigenin מתויגת בדיקה לעוברי עכברים שלמים

1. לבבות לנקב וראשי E10.5 ועוברים מבוגרים עם סכין microdissection בעוד העוברים עדיין במתנול (אם זה לא נעשה בזמן הנתיחה). הצעד הזה פשוט מאפשר פתרונות לשטוף להיכנס לשלפוחית ​​המוח ואת חדרי לב ובכך להפחית באופן משמעותי רקע מכתים.
2. Rehydrate את העוברים על ידי שטיפות רצופות בסדרת מתנול / PBST (מתנול 75% בPBST, 50% מתנול בPBST ולאחר מכן 25% מתנול בPBST) למשך 5-10 דקות בכל ריכוז מתנול. לשטוף פעמים במשך 5 דקות כל אחד לשטוף בPBST 100%.
3. דגירה ב04:01 PBST: 30% H ₂ O ₂במשך שעה 1 על קרח. לאחר מכן לשטוף עם 3 שינויים 5 דקות כל אחד בPBST 1X.
4. הסר את שטיפת PBST האחרונה ולהחליף עם 1ml 10 מיקרוגרם / המ"ל proteinase K בPBST. במהלך מקום proteinase K העיכול אנכי את הצינורות במעמד ב° C אמבט מי 25.
   הערה: פתרונות של proteinase K לאבד פעילות לאורך זמן בשל לעיכול עצמי. כדי להבטיח פעילות מקסימלי ועקבית פתרון K proteinase חייב להתבצע טרי מייד לפני כל שימוש. עבור כל שימוש לייצר כמות קטנה של מניות 1mg/ml אז לדלל אותו. זמן הדגירה צריך להיקבע לכל מנה של אבקת K proteinase ולכל גיל עובר. לדוגמה, עבור עוברי E9.5 זמן טוב הוא בדרך כלל 10-15 דקות ב 25 ° C ואילו לE10.5 זה בדרך כלל 20-30 דקות ב 25 ° C. זמן דגירת K proteinase גם צריך להימדד דווקא בניסויים כדי לאפשר השוואה תקפה בין בקבוקונים ובין ניסויים. הטמפרטורה צריכה להישמר בקפידה במהלך העיכול להגדלהשחזור. הבדלים קטנים כמו 1 ° C יכול לשנות את הכמות של עיכול בין ניסויים. מומלץ מאוד שdigestions proteinase K להתבצע בחממה או waterbath לבקרת טמפרטורה מדויקת. שלב זה הוא קריטי למאפשר הבדיקה לחדור לרקמות ובכך לייצר אות חזקה. עם זאת, יתר העיכול יפגע בעוברים והם יתפוררו בהדרגה במהלך השלבים הנותרים.
5. עצור את עיכול K proteinase ידי שטיפת פעמים במשך 5 דקות כל שטיפה בטמפרטורת חדר עם טרי 2 מ"ג / המ"ל גליצין בPBST. לאחר מכן לשטוף פעמים במשך 5 דקות כל אחד בPBST.
6. תקן את העוברים מתעכלים במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר ב4% PFA / PBST, gluteraldehyde 0.2% (Polysciences). אל יתר או underfix. לשטוף 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד בPBST.
7. בשלב זה, עוברים צריכים להיות מחולקים לקבוצות להכלאה. הסר את PBST. הוסף חיץ הכלאת מ"ל 1 (ult 50%rapure פוראמיד (Invitrogen), SSC 5x, 5 pH, 1% SDS, 50 מיקרוגרם / המ"ל הפרין (acros), 50 מיקרוגרם / המ"ל Torula רנ"א (סיגמא)) כי כבר חממו עד 65 מעלות צלזיוס (ללא בדיקה). אפשר עוברים להתיישב, ואז להסיר את כל חיץ hybrization ולהחליף עם חיץ 1 מ"ל טרי מחומם הכלאה ללא בדיקה.
8. Prehybridize במשך שעה 1 על 65 מעלות צלזיוס באמבט מים רועד או בתנור על מצע נדנדה (לדוגמא התנור 'n' Shake Boekle אופה, ראה טבלה 1). אם אתה מדגיר את המבחנות באמבט מים להיות בטוחות מים מגיעים עד, אך לא מעל, את צמרות הבקבוקונים. טמפרטורת ההכלאה ניתן להגדיל עד 70 ° C. טמפרטורות הכלאה מעל 65 מעלות צלזיוס אינן משפיעות על עוצמת אות או רקע ברוב הבדיקות שכבר בדקו. העוברים יהפכו שקופים, דביקים, ושברירית במאגרי פוראמיד (למשל חיץ הכלאה) להיות זהיר בעת טיפול בם.
9. החלף את חיץ prehybridization עם חיץ ההכלאה 0.4ml המכיל בחלליתריכוז של 0.25-1 מיקרוגרם / מ"ל. השתמש 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​של חללית לעוברים עד כ E8.5. לעוברים מבוגרים, בדיקות צריכות להיות טיטרציה 1-0.1 מיקרוגרם / מ"ל ​​כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי לאות טובה עם רקע נמוך (0.25-0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​או כך בדרך כלל). שים לב שנפחים גדולים יותר הכלאה עשויים להיות נחוצים לעוברים הגדולים יותר. להכליא בין הלילה על 65 ° C.
10. אם את העוברים כבר מעל טופל בproteinase ק הם יופיעו מאוד שקופים. הם יכולים גם להיצמד לצדי הבקבוקון, או שיתפרקו. עוברים המופיעים בדרך זו אמורות להיות מושלכים בשלב זה בפרוטוקול. עיבודם נוסף לא יגרום לנתונים לפירוש.
11. החלף את חיץ ההכלאה עם פתרון המחומם (50% פוראמיד, 5x SSC pH 5, 1% SDS) בשעת 70 ° C. לשטוף פעמים במשך 30 דקות בכל שטיפה לE8.5 עוברים, שלוש פעמים במשך 30 דקות לשטיפה לE9.5 ומבוגר.
12. לשטוף פעם אחת עם פתרון מראש התחמם 50%: 50% פתרון השני (0.5M NaCl, 10mm טריס HCl pH 7.5, 0.1% Tween 20) עומד על 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
13. לשטוף שלוש פעמים במשך 5 דקות לשטיפה עם הפתרון השני בטמפרטורת חדר.
14. החלף חיץ עם הפתרון השני מכיל RNase 100 מיקרוגרם / מ"ל, RNase T1 100 יחידות / מ"ל. לדגור על כיסא נדנדה בחדר החם ב37C פעמים במשך 30 דקות לכל לשטוף. לשטוף RNase הוא חיוני עבור הפחתת רקע נבע מבדיקות הכלאת nonspecifically.
15. שטוף בפתרון שלישי (פוראמיד 50%, 2x pH5 SSC) על 65 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות פעמים בכל שטיפה לE8.5, 3 פעמים במשך 30 דקות לשטיפה לE9.5 ומבוגר.
16. לשטוף 3 פעמים במשך 5 דקות לשטיפה עם 1X TBST (100 מ"ל של TBS 10X מכיל 8G NaCl, KCl 0.2g, 12.5ml 2M טריס HCl 7.6 pH במים. כדי להפוך 1X TBST לדלל TBS 10X בנפח מתאים של מים ו להוסיף Tween 20-0.1% ריכוז סופי)
17. אלא אם צוין, כל הכביסות מתבצעות בבקבוקוני הדוגמא עם פתרונות מלאים לרמה הנמוכה יותר שלצוואר בקבוקון. עבור כל שלבי השטיפה, בקבוקונים הם הניחו בצד שלהם על פלטפורמת נדנדה.

4. גילוי נוגדנים של digoxygenin מתויג חללית

1. עוברים הם מראש חסמו ב0.5 מ"ל 1X TBST סרום כבשים + חום 10% מטופלים. אז לטלטל את המבחנות אנכיות בטמפרטורת חדר (~ 20 מעלות צלזיוס) במשך לפחות 2.5 שעות.
2. החלף את פתרון חסימה עם TBST 1X טרי + סרום המכיל 10% 1:2000 - 1:5000 דילול של שברי אלקליין phosphatase-מצומדות כבשים אנטי digoxigenin Fab (נגרע ידי דוגר עם אבקת אצטון עובר, ראה להלן). השתמש בדילולים גבוהים יותר עבור E9.5 ועוברים ישנים, עד 1:5000 למזער רקע. דגירה אנכית בנדנדה ב 4 ° C למשך הלילה.
   הערה: אנחנו גילינו שהדגירה של שברי Fab אנטי digoxigenin עם אבקת אצטון עובר מפחיתה את רמות הכתמת רקע בפרוטוקול זה. כדי להכין את אבקת אצטון עובר הומוגני embr נקווה E12.5-14.5 עכברyos בהיקף מינימאלי של PBS. הוסף 4 כרכים של קרח אצטון, תערובת קרה ולדגור על קרח במשך 30 דקות. הסרת supernatant ידי מסתובב ב 10000 XG במשך 10 דקות. שטוף את הכדור עם אצטון הקר כקרח ומסתחרר שוב. מורח את הכדור ולטחון לאבקה על גיליון נייר סינון ולאפשר לו לייבוש באוויר. אבקה ואז ניתן לאחסן בצינור אוויר חזק ב 4 מעלות צלזיוס במשך שנים.
   לנוגדן החיסור, הנוגדנים צריכים להיות מראש נספג לאבקת אצטון העובר להפחית מחייב ספציפי במהלך או לפני החסימה מראש. דגירת נוגדן ב1 / 100 עם כמות קטנה של אבקת עובר (הכמות אינה קריטית) ב1xTBST/10% סרום לפחות 1 שעות ב 4 ° C עם נדנדה. הסר אבקה ע"י מסתובב בmicrocentrifuge במשך 10 דקות ב 4 ° C. נוגדן נגרע ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך 6 חודשים לפחות.
3. לשטוף שלוש פעמים 5 דקות כל אחד עם TBST 1X, אז 5-6 פעמים לכל 1 שעות בטמפרטורת חדר כדי להסיר נוגדנים עודפים. אם pהתייחס, לעשות שטיפת לילה מורחבת ב 4 ° C כדי להפחית את הרקע. לשטוף באופן דרמטי בין הלילה יכול להפחית את רמות רקע וכך להגדיל את יחס האות לרעש.
4. לשטוף פעמים במשך 20 דקות לכל לשטוף עם חיץ phosphatase אלקליין טרי (טריס 100mm, 9.5 pH, 50mm MgCl _2, NaCl 100mm, 0.1% Tween 20. הוסף levamisole 0.5mg/ml, מעכב AP אנדוגני, לE9.5 ומבוגר עוברים).
5. החלף את השטיפה האחרונה עם מצע AP הסגול בע"מ (רוש) prewarmed לטמפרטורת חדר.
6. אפשר תגובת הצבע לדגירה בטמפרטורת חדר, ולצפות לאות מעת לעת באמצעות מיקרוסקופ לנתח. לתגובות צבעים מורחבות (כמה שעות ללילה) את הבקבוקונים צריכים להיות מוגנים מפני אור. אותות לmRNAs שפע צריכים להיות גלויים בתוך 15 דקות. תגובות יש להפסיק כאשר אתה מרוצה עם האות, או כאשר הרקע מתחיל להיות בעיה. אם הפתרון עצמו מתחיל להשחיר תוכל להאריך את גתגובת olor ידי החלפת מצע הפתרון.
7. עצור תגובה על ידי שטיפת פעמים במשך 5 דקות לשטיפה ב1X PBST/5mM EDTA.
8. העברה ל4% paraformaldehyde / PBST מחדש לתקן, מכמה שעות ללילה. או עוברים ניתן לאחסן 4% PBST paraformaldehyde/1X לשנים או יכולים להיות מעובד באופן מיידי לחתך. צעד קיבוע סופי זה הוא קריטי עבור שימור לטווח ארוך של הדפוס המכתים.

5. פרפין הטבעה וחתך של עוברים מוכתמים

1. לפני העוברים קבועים לאחר תגובת הצבע (שלב 4.8) תמונות של העוברים מוכתמי ההר השלמים נלקחות כאשר הרמה המכתימה היא בעצמה הרצויה. אחרי שתעד את דפוסי הביטוי בעוברים השלמים הם מודגרת במצע הסגול BM לילה עד 24 שעות בטמפרטורת חדר עד שכל העובר הופך לכחול כהה. צעד זה הוא להבטיח כי המכתים יהיה כהה במידה מספקת כדי להופיע בחלקי רקמת ה. שים לב כי הצבע הכחול של העובר בשל התצהיר של שכבה דקה מאוד של פיגמנט על כל פני העובר. מכתים רקע זה לא לגלות אותו בתוך הרקמה של עניין לאחר החתך.
2. שטוף את העוברים המוכתמים עם PBS שלוש פעמים כדי להסיר את המצע העודף משקע ולתקן את הלילה ב4% PFA ב 4 ° C.
3. לשטוף עם PBS שלוש פעמים, ולאחר מכן מייבש את העוברים לתוך מתנול 100% (כפי שמתואר ב2.4).
4. החלף מתנול האחרון עם קסילן. שטוף ב2 עד 3 פעמי קסילן עבור 2 דקות כל שטיפה עד שהעוברים יתבהרו. לא על לשטוף בקסילן מאז זה יגרום רקמה פריכה מאוד אחרי שהיא מוטבעת הופכת אותו מאוד קשה לשחזר קטעים שלמים. חזותי לפקח כל דגירת קסילן לעשות עוברים בטוחים הם רק עד לנקודה של להיות ברור ולהיות זהירים מאוד שלא לאפשר דגירת קסילן להרחיב מעבר לנקודה זו.
5. עוברי העברה (E10.5 ומבוגר) לתוך קלטות ביופסיה בטח-Tek (Fisherbrand), ודגירה כל הקלטת בשעווה (Fisherbrand) עבור 15 ~ 30 דקות ב 65 ° C. שינוי בשעווה טריה עוד 15 ~ 30 דקות ולאחר מכן לשנות שוב. עוברים קטנים / גזעי רקמות דורשים זמן דגירה קצרה יותר שעווה. עוברי E9.5 ניתן להציב בתבניות ההטבעה של הרקמות לכל שינויי השעווה. במקרים אלה תוכל להסיר את השעווה מהתבנית במקום להעביר את העוברים.
6. אחרי שלושה שינויי שעווה, עוברי העברה לתוך תבניות ההטבעה של הרקמות (Polysciences) ולהטביע בשעווה טריה. זהירות למקם את העוברים למטוס הרצוי של חתך. בואו השעווה להתקרר עד שהתגבש.
7. סעיף גושי השעווה לתוך 8 ~ 14μm פרוסות באמצעות microtome הסטנדרטי (למשל יקה RM2155). איסוף חלקים על שקופיות מיקרוסקופ (Fisherbrand).
8. תן את השקופיות שכבו ויבש בslidewarmer. את השקופיות ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך חודשים.
9. סעיפי יבשי dewaxed על ידי שני 5 דקות xylenכביסות דואר וrehydrated לתוך מים על ידי מתרחץ מתנול / מים סדרתיים (100% מתנול 2 דקות, 100% 2 דקות מתנול, 2min 90% מתנול / מים, 2min 70% מתנול / מים, 5 דקות מי deionized).
10. להכתים את החלקים עם פתרון גרעיני מהר אדום (סיגמא) מכתים דקה 1. כדי לייצר פתרון המכתים הגרעיני מהר האדום, לדלל מניות מרוכזות של אדום מהיר גרעיני (0.1% אדומים גרעיני במהירות 5% סולפט אלומיניום במים, מתמוסס עם חום ולסנן דרך נייר הסינון Whatman) 01:05 בתמיסה מימית של 5 סולפט אלומיניום%. לאחר ההכתמה לשטוף את השקופיות עם מים זורמים עד שהמים הופכים צלולים. המעשים הגרעיניים המהירים האדומים כcounterstain חושף מבנה רקמות הכולל במקטעים. הצבע שלו עומד בסתירה היטב עם הכתם סגול הכחול המסמן את הלוקליזציה של חללית רנ"א. אדום מהיר גרעיני הוא להרוות כתם והעוצמת המכתימה נשלטת על ידי הריכוז של הפתרון המכתים. אם עוצמת הכתמים האדומים מהר הגרעינייםהוא לקוי בעת שימוש בפתרון מכתים זה תוכל לחזור על שלב זה בפתרון מהיר גרעין מרוכז יותר אדום.
11. הכן את השקופיות להרכבת coverslips ידי שטיפות בכל אחד מהפתרונים בסדרה הבאה: 90% מתנול / מים ואחרי 2 כביסות במתנול 100% ואחרי 2 כביסות בxylenes. דגירת השקופיות במשך 2 דקות בכל אחד מהכביסות.
12. הר את השקופיות עם מדיום Cytoseal 60 הרכבה (ריצ'רד-אלן מדעי). שים לב כי תקשורת הרכבה המימית תתמוסס מהר האדום הגרעיני כתם.
    הערה: יש לנו גם בשימוש שרף הטבעת פלסטיק (חיסוני מיטה, Polysciences Inc) כדי לייצר חלקים של עוברים מוכתמים עם תוצאות מצוינות ^4.

6. נציג תוצאות:

איור 1 מדגים תוצאות המתקבלות באמצעות נציג בפרוטוקול זה. האיור 1 א מציג את דפוס הביטוי של Gata3 בעוברי עכברי E10.5. פנל זה ממחיש R טובesult עם אות גבוהה יחס ברקע. התרשים 1C, לעומת זאת, מראה נכשל כלאה באתר לGata3 mRNA ששמש חללית RNA באופן חלקי מושפלת. בדיקת פעילות ספציפית נמוכה תביא לתוצאות דומות עם אות נמוכה לניגוד רקע. השוואה של לוחות ו-C ממחישה את החשיבות ביצוע הערכות בקרת איכות קפדניות של איכות בדיקה, כדי להבטיח תוצאות באיכות גבוהה. התוצאות המתקבלות בבדיקת Foxg1 (האיור 1B) מדגימות גם תוצאה טובה בצביעה ספציפית בtelencephalon עם רקע נמוך בחלקים אחרים של המוח. המוח והלב הם אתרים נפוצים של צביעת רקע שנגרמים על ידי השמנת חללית. ניקוב המוח ולב עם מלקחיים מאפשר לשטוף פתרונות לעובר וכתמי רקע ממזערים (ראה שלב 3.1). 1D האיור ממחיש את הרקע תכלת הטיפוסי מצא כאשר המוח אינו מנוקב. זה מראה תוצאה אופטימלית מתקבלת באמצעות בדיקת Pax1. Pax1 אינו מתבטא בכל חלק של המוח וכל המכתימים ראו במוחו של עובר וזאת בשל רקע שאינו ספציפי.

איור 1. נציג תוצאות מראות דוגמאות מוצלחות (A, B) ושל תת אופטימלי (ג', ד ') תוצאות. עובר E10.5 א הכלאה עם Gata3 חללית. עובר E11.5 B. הכלאה עם Foxg1 חללית. ג E10. 5 עובר הכלאה עם Gata3 בדיקה כי באופן חלקי, מושפל, מראה אותות חלשים מאוד אבל רקע גבוה לאורך כל העובר. עובר E10.5 ד הכלאה עם Pax1 בדיקה ללא ניקוב הראש, מראה כתמי רקע בחדרי הלב (ראשי חץ).

השיטות המתוארות בפרוטוקול זה הותאמו ממספר מקורות שונים והמותאמים לכל הר עוברי עכברי E8.5-E11.5 יום ישנים. שיטות לכל הר כלאה באתר של עוברי החולייתנים הופיעו לראשונה בשנת 1990 ^2,5-12 מוקדם. פרוטוקול זה הותאם בעיקר משיטות שפותחו לעוברי Xenopus ^7,8, כמו גם עכבר ^2,11. בפרוטוקול שלנו הרבה דגש על הערכת איכות קפדנית של החללית. תשומת לב רב להפקה באיכות גבוהה ורנ"א פעילות הספציפי גבוה בדיקה כפי שנקבעה על ידי את הצעדים הראשונים בפרוטוקול זה יגדיל משמעותי את איכות הנתונים ולחסוך סכומים ניכרים של זמן ומאמץ בטווח הארוך. הפרוטוקול שלנו כולל גם שימוש בתבניות שנוצרו DNA PCR לשעתוק RNA פולימראז פאג. גישה זו היא מהירה ומדרגים מאוד. זה יכול לאפשר לדור של מספר גדול של RNA בדיקות foבקנה מידה גדול r כלאה באתר מסכים ^13-15.

מספר שלבים בפרוטוקול זה צריך להילקח בחשבון כאשר הרקע הוא גבוה, אך האות נמוכה. שיקול אחד הוא החללית. מעולם לא היה לנו רקע גבוה עם בדיקות RNA שעמדו בקריטריונים המפורטים בעיצוב פרוטוקול זה ושעברו את כל שלוש בדיקות בקרת האיכות (פעילות תשואה, ספציפית ואורך חללית). גורם נוסף שיכול להשפיע על רמות רקע הוא היכולת של החללית לחדור לתוך הרקמות העובריות. יש להקפיד במהלך הנתיחה כדי להסיר את הקרומים המכסים extraembryonic עובר לחלוטין. בנוסף, צעד עיכול K proteinase הוא חיוני לעוברים מעל גיל E9.5. זמני עיכול K proteinase כבר לתת רקע נמוך ואות חזקה יותר, עם זאת, זמני עיכול מוגזמים יכולים לגרום לניזק לרקמות גדל ועלולים לגרום להתפוררות של העובר במהלך ההליך. Optimizatיון של זמן העיכול לכל מנה של proteinase K נדרש כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר. צעד נוסף שיכול להיות מותאם להשגת אות גבוהה ליחסי רקע הוא דגירת RNase (שלב 3.14). הפרוטוקול שלנו משתמש בתערובת של RNase וRNase T1. שני אנזימי עיכול RNA גדילים בודד אבל כל אנזים יש סגולי בסיס אחר. שילוב של שתי תוצאות אנזימים בעיכול נרחב של RNA גדילים הבודדים לoligoribonucleotides הקטן. זה מאפשר ביותר של חללית ההכלאה הלא במיוחד כדי להסיר על ידי פוסט ההכלאה רוחצת שהביאו לירידה גדולה בצביעת רקע. שימוש בתוצאות לבד T1 RNase או ברקע מוגבר ויש להימנע. גם אנחנו גילינו שהאיכות של תגובת הצבע הסופית היא השיפור באמצעות חיץ AP טרי, עשה מייד לפני שימוש.

הפרוטוקול שלנו יכול להיות מותאם לעוברים מבוגרים או רקמות מבוגרות עם עיבוד נוסף. לדוגמה, יש לנו גםשימוש בפרוטוקול זה כדי לבצע באתרם על הכלאות (100 מיקרומטר) סעיפי vibratome עבים של מוח עכבר בוגר (נתונים אינם מוצגים). יש לנו גם בשימוש בפרוטוקול זה כדי ללמוד ביטוי גנים בעוברים מבוגרים. בחלק מהמקרים השתמש בפרוטוקול זה כדי להמחיש ביטוי גנים על פני השטח של E13.5 וE14.5 עוברים, כגון Gad1 ביטוי בזקיקים של vibrissae ^4. במקרים אחרים יש לנו להשתמש בסכין גילוח או אזמל כדי לחתוך E12.5-E14.5 עוברים כדי לספק גישה לבדיקת רקמות ספציפיות בתוך העובר. ברי עובר שהוכנו באופן זה יכול להיות מעובד באמצעות פרוטוקול זה עם שינויים מסוימים. במקרים אלה את האורך של כל הטיפולים וצעדי כביסה צריך להיות מותאם לפי גודל רקמה ומותאמת באופן אמפירי.

הפרוטוקול שלנו כולל גם שיטות לחתך לאחר הכלאה וניתוח של דפוסי ביטוי. בשילוב עם הדמית ההר השלמה של ביטוי הגנים addi זהצעד תזונתי נוסף יכול להוסיף מידע רב נוסף לגבי דפוס הביטוי של גן. יש לנו מוטבע עוברים לאחר שעבר כלאה באתר בפרפין, כמו גם בשרף הפלסטיק ^4,16. קטעי עוברים מוכתמים יכולים לשמש כדי ליצור שחזור תלת ממדים של דפוס הביטוי מתגלה על ידי כל ההר בהליך כלאה באתר. אנחנו השתמשנו בתוכנת שחזור מתוכנת SURFdriver למטרה זו.

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקי R21MH082360 (BGC) וR01HD056315 (NRM), כמו גם באוניברסיטת ג'ורג'יה.