La diffusion biologique à rayons X à petit angle fournit des mesures structurelles des complexes macromolécules et macromoléculaires. Idéalement, l’échantillon à mesurer doit être monodispersé. Bien que dans certains cas, la chromatographie d’exclusion de taille SAXS ne soit pas suffisante pour produire la monodispersité, une déconvolution logicielle des données SAXS peut être effectuée pour produire une courbe SAXS idéalisée.
Suivant ce protocole, un programme de déconvolution et le programme Scatter convivial peuvent être utilisés pour analyser les mutants exominus de polymérase d’ADN du virus Vaccinia. Pour effectuer une soustraction d’arrière-plan des données de chromatographie d’exclusion de taille, ouvrez le programme Scatter 4 basé sur Java et ouvrez l’onglet SEC. Faites glisser et déposez les fichiers de données réduits dans les données de chute sous la fenêtre et cliquez sur le bouton répertoire de sortie et ouvrez pour définir le répertoire de sortie dans lequel les données seront enregistrées.
Entrez le nom de l’échantillon dans l’enregistrer sous forme de boîte et cliquez sur trace. Cliquez sur le bouton modifier les détails pour modifier les détails expérimentaux et remplir les champs appropriés. Pour sélectionner manuellement les cadres tampons, cliquez sur définir les tampons.
Cliquez à gauche et faites glisser pour resélectionner le tampon comme un plat sur la courbe de trace avant le volume vide de la colonne chromatographie d’exclusion de taille d’environ 100 images et cliquez sur définir tampon et mise à jour pour recalculer le fichier SEC. Cliquez à gauche et faites glisser pour sélectionner une région d’intérêt sur l’intrigue du signal et cliquez à gauche et faites glisser les poils croisés dans l’intrigue de la carte thermique pour sélectionner le zoom et le sous-ensemble des cadres qui seront utilisés pour la fusion. Avec un autre clic gauche, mettez en surbrillance les cadres de la carte thermique correspondant à la zone du bas à droite des poils croisés.
Idéalement, le cadre doit mettre en évidence une région avec une couleur principalement cyan et un rayon stable de gyration. Lorsque vous êtes satisfait des images sélectionnées, cliquez sur fusionner pour fusionner les images soustraites et cliquez sur l’onglet analyse pour afficher les données. Pour la déconvolution des données, chargez l’ensemble de données dans le programme de déconvolution.
Dans le panneau de contrôle sous les fichiers, utilisez le symbole du dossier pour localiser les données et mettre en surbrillance tous les fichiers DAT. Une intrigue d’intensité intégrée par rapport au nombre d’images sera dessinée dans l’intrigue de la série. Sous l’onglet série, cliquez pour mettre en évidence la courbe et pour ouvrir la fenêtre popup d’analyse LC.
Pour sélectionner une région tampon appropriée, cliquez sur ajouter la région pour sélectionner une zone avant le pic du chromatogramme et une zone après le front solvant et cliquez sur définir le tampon. Les fenêtres popup indiqueront que les cadres n’ont pas été sélectionnés pour l’arrière-plan. Pour démarrer l’EPT, cliquez à droite sur le fichier surligné et sélectionnez EPT dans le menu.
Dans la fenêtre popup, la décomposition de la valeur unique de l’ensemble de données doit être observée. Dans la boîte de contrôle, cochez les valeurs de la boîte d’images d’utilisation pour confirmer que toute la zone de pointe à déconsvolue est couverte dans la parcelle d’intensité. L’intrigue des valeurs singulières montrera l’intensité des valeurs singulières au-dessus de la ligne de base.
Si les vecteurs simples gauche et droit ne correspondent pas, changez le nombre unique significatif de vecteurs à deux et déplacez les cadres jusqu’à ce que les vecteurs singuliers gauche et droit soient similaires. L’EPT sera calculé, générant des parcelles dans les directions avant et arrière pour chaque vecteur et indiquant quand les composants démarrent et sortent du profil de solution pour les données SAXS de chromatographie d’exclusion de taille sélectionnées. RAW tentera d’identifier les plages.
Si nécessaire, utilisez les flèches pour modifier les plages de sorte que chaque cercle est le début d’un point d’inflexion, se levant ou tombant à la ligne de base et cliquez ensuite. Pour réduire ou éliminer les pointes, identifiez approximativement quel cadre correspond à la pointe à l’aide des flèches de commande de portée pour ajuster les commandes de plage des composants. Lorsqu’un carré Chi minimum a été atteint, cliquez en arrière pour effectuer une vérification de validation.
Si les parcelles ept d’origine semblent toujours valides, cliquez ensuite et enregistrez les données de l’EPT pour enregistrer les parcelles. Cliquez ensuite pour fermer la fenêtre EPT. Puis dans la fenêtre RAW, ouvrir les profils dans le panneau de tracé pour afficher les courbes.
Dans l’onglet profils du panneau de commande, cliquez à droite pour enregistrer les courbes sous forme de fichiers DAT. Pour la détermination SAXS, ouvrez l’onglet analyse scatter et sélectionnez G pour sélectionner l’outil manuel d’analyse Guinier. Dans l’intrigue, ajouter ou supprimer des points de sorte que les résidus n’ont pas un sourire ou froncer les sourcils fonctionnalité.
Les données sélectionnées dans l’ajustement Guinier ne doivent pas dépasser la file d’attente maximale multipliée par un rayon de limite de gyration de 1,3. Cliquez sur Kratky normalisé. La parcelle résultante fournit une évaluation de l’état structurel de la macromolécule, globulaire, cylindrique, désordonnée, normalisée pour la masse, et la concentration.
Cliquez sur le volume de corrélation. L’intensité totale dispersée et une zone intégrée de l’intensité totale dispersée en fonction des parcelles Q apparaîtront comme une référence rapide pour valider la qualité de la courbe de diffusion. Pour commencer l’analyse de flexibilité, cliquez sur flexibilité.
Chaque panneau de la fenêtre popup montrera un complot exploitant un rapport de force qui existe entre le compact et les biopolymères flexibles allongés. Utilisez le curseur en bas de la boîte pour modifier la vue des données jusqu’à ce qu’un plateau dans l’une des parcelles soit atteint. Immédiatement après avoir effectué une analyse de flexibilité, cliquez sur le volume.
Un popup de trois graphiques sera généré. L’intrigue Porod-Debye suit l’endroit où le curseur de la parcelle de flexibilité a été laissé et montre les données de zone plafonnées. Pour calculer le volume de la particule, déplacez les points de départ et d’extrémité jusqu’à ce que la ligne bleue de la parcelle corresponde à la région plafonnée.
Pour un résultat impartial, les résidus de la loi sur le pouvoir représentant Porod-Debye ne devraient montrer aucun modèle. Sous l’onglet P de R, la distribution réelle de l’espace et la courbe de diffusion de l’échantillon peuvent être observées. Idéalement, la courbe de distribution doit être lisse sans vagues et doit simplement toucher doucement l’axe x.
Cliquez à droite sur le nom de l’échantillon et cliquez sur trouver DMAX pour ouvrir une nouvelle fenêtre. Les limites de la dimension maximale sont prédéfinises avec la plage Q maximale suggérée, les points de données maximaux à utiliser pour le calcul, les limites de dimension maximale inférieures et supérieures, et un score alpha inférieur et supérieur. Cliquez sur démarrer.
Une distribution composite sera créée avec une dimension maximale suggérée et un niveau alpha. Si ces données sont acceptables, fermez la fenêtre pour revenir à l’onglet P de R où la parcelle d’espace réciproque sera désormais recadrée pour correspondre à la plage Q maximale suggérée. Sélectionnez le modèle plus et cliquez sur l’arrière-plan pour définir le niveau alpha et la dimension maximale aux valeurs suggérées à partir de la boîte popup.
Cliquez sur affiner. Un tracé de validation croisée s’ouvrira, montrant si des points devaient être rejetés comme indiqué en rouge. S’il n’y a que quelques points rejetés et que la distribution semble bonne, alors le modèle est bon.
Vous imprimerez un rapport dans l’onglet analyse. Cliquez à gauche pour mettre en surbrillance l’échantillon et cliquez à droite sur le nom de l’échantillon. Sélectionnez créer un rapport à partir de l’ensemble de données unique.
Une boîte de texte s’ouvrira pour permettre les commentaires et un document PDF sera produit montrant tous les chiffres et valeurs générés. Dans cette analyse représentative, l’exonucléase de polymésase d’ADN e9 moins mutant était lié à l’ADN et exécuté utilisant la diffusion de rayon X à petit angle d’exclusion de taille. Deux pics ont été observés.
Le premier grand pic représente l’exonucléase de polymése d’ADN E9 moins complexe mutant d’ADN. Et le second indique l’état non lié. Bien que l’approche classique de sélection des images offre un rayon stable de gyration du complexe dans le premier pic, le deuxième pic est clairement fusionné et le rayon de gyration à travers la parcelle montre que le deuxième pic d’intérêt n’a pas un rayon stable de gyration en raison de la contamination croisée.
Dans cette analyse, seulement cinq images ont pu être utilisées qui ont montré un rayon semi-stable de gyration. Une fois soustraits, ils ont donné un rayon de gyration de 36,3 angstroms. Lorsque les pics ont été décontvolutés à l’aide de l’EPT, la courbe correspondante du deuxième pic a été superposée à l’original, montrant une nette diminution du signal au bruit et un rayon inférieur de gyration de 34,1 angstroms.
Une parcelle kratky des données révèle que le complexe avec le pic alambiqué est plus globulaire comme confirmé par la courbe pr qui donne une dimension maximale de 108,5 angstroms pour la courbe décontvolutée. Les données non décontaminées pour cette analyse sont plus allongées avec une dimension maximale de 120 angstroms, probablement en raison de l’hétérogénéité résultant de la polymése E9 non lié moins le mutant d’exonuclease. Les étapes les plus critiques sont dans le choix des valeurs singulières et la gamme de données utilisées car celles-ci affectent grandement l’exactitude de la déconvolution.
Les résultats ne doivent pas être pris par eux-mêmes, mais évalués en utilisant des techniques supplémentaires telles que la centrifugation analytique ou la diffusion de la lumière laser à angle multiples pour permettre leur interprétation biologique. SAXS couplé à la colonne en ligne en combinaison avec la déconvolution et une interface conviviale comme le programme scatter fournit est un paquet puissant pour fournir des données structurelles significatives, même à partir de systèmes intrinsèquement difficiles.
