Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés sur les protéines membranaires intégrales telles que l’état oligomérique, leur taille, leur forme globale et leur structure à basse résolution en solution. Les études de solution des protéines membranaires nécessitent la stabilisation de molécules comme les détergents. Cette technique a l’avantage de rendre les détergents invisibles et met en évidence le signal de la protéine membranaire.
Les implications de cette technique s’étendent à de nombreuses questions de recherche biologique et médicale parce que plus de 1/3 des protéines résident dans des membranes où elles remplissent de nombreuses fonctions cellulaires vitales. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes d’étiquetage du deutérium et de diffusion des neutrons sont difficiles à apprendre parce que très peu d’institutions offrent une formation sur ces techniques. Pour commencer, déterminez les densités de longueur de diffusion neutronique ou les MDS à l’aide de l’application Web MULCh, modules pour l’analyse des données de variation de contraste.
Ouvrez le module de contraste en cliquant sur le contraste situé dans le volet de navigation gauche. Fournissez du texte pour un titre de projet et entrez les détails ci-dessous pour deux composants comme sous-unité un et sous-unité deux. Entrez la formule moléculaire pour chaque composant dans la boîte de texte de formule.
Entrez ensuite le volume dans des angstroms cubiques pour chaque composant de la boîte en dessous du volume. Enfin, entrez les détails des composants tampons. Cliquez sur soumettre pour effectuer les calculs de contraste neutronique.
Une page de résultats est générée qui fournit un tableau de la densité de la longueur de diffusion et des points de correspondance de contraste ainsi que des formules pour déterminer ces paramètres à un pourcentage donné de D2O dans le tampon. Examinez les paramètres de diffusion avec une attention particulière aux points de correspondance de contraste des composants. Cultiver des cellules E.coli abritant un vecteur d’expression inductible pour la séquence protéique cible dans le milieu LB à une densité optique à 600 nanomètres ou OD 600 d’environ un.
Adapter les cellules E.coli au deutérium étiqueté moyen avant de passer à l’expression d’une protéine délétérée en diluant la culture LB d’un à 20 millilitres de milieu minimal. Après avoir augmenté à un OD 600 d’environ un, répéter l’une à 20 dilutions en utilisant un milieu minimal contenant 50, 75, et 100%D2O. Une fois adapté, continuer à cultiver la culture dans un bioréacteur pour augmenter le rendement de la masse cellulaire stérilisé.
À mesure que la teneur en D2O sera augmentée, les taux de croissance diminueront. Procéder à la récolte, la lyse et purifier les cellules comme décrit dans le protocole texte. Equilibrer ensuite une colonne d’exclusion de taille avec plus de deux volumes de colonne de tampon d’échange final à l’aide d’un système de chromatographie liquide protéique rapide.
Après l’injection de l’échantillon, exécutez la colonne en fractions d’isolement correspondant à la protéine d’intérêt. Réservez un aliquot de tampon assorti pour la diffusion neutronique à petit angle ou la soustraction sans fond. Pour recueillir des données SANS, chargez d’abord des échantillons et des tampons dans les cellules de quartz.
Après s’être assuré que l’obturateur du faisceau est fermé, approchez de la zone de l’environnement de l’échantillon et placez les cellules de quartz dans le changeur d’échantillon. Enregistrez la position de changeur d’échantillon pour chaque cellule d’échantillon. Vérifiez la zone et assurez-vous que le chemin du faisceau est exempt d’obstruction avant de quitter la zone de l’environnement de l’échantillon.
Ensuite, ouvrez l’obturateur de faisceau. Exécutez une analyse de table pour la collecte automatisée de données. Suivez les instructions pour le fonctionnement des instruments fournies par le scientifique de diffusion des neutrons.
Utilisez le logiciel Mantid Plot et le script Python pour réduire les données SANS d’une image 2D à une intrigue 1D. Pour ce faire, connectez-vous au cluster d’analyse à distance et exécutez le tracé Mantid à partir de la ligne de commande. Ouvrez ensuite le script de réduction utilisateur fourni et placez les numéros d’analyse ou l’identification correspondants pour l’échantillon en paires tampons dans la liste appropriée.
Exécutez le script pour générer des données réduites sous forme de fichier texte à quatre colonnes dans l’emplacement spécifié. Cliquez à droite sur l’espace de travail approprié et l’intrigue Mantid et sélectionnez l’intrigue avec des erreurs pour un examen initial des profils de diffusion. Téléchargez la suite logicielle ATSAS et utilisez PRIMUS pour la traçage des données, la mise à l’échelle tampon et la soustraction et l’analyse Guinier.
Lancez l’application d’analyse de données ATSAS, SAS et chargez les fichiers de données réduits correspondant à la paire d’échantillons et de tampons. Pour bien mettre à l’échelle le tampon, sélectionnez la plage de données à Q élevé où les deux profils sont similaires en plat et cliquez sur le bouton échelle situé sous l’onglet opérations. Augmentez la plage de données pour afficher tous les points, cliquez sur soustraire pour effectuer cette opération.
Effectuer une analyse Guinier des données de l’échantillon soustrait tampon à l’aide de l’onglet analyse de l’application d’analyse de données SAS. Assurez-vous que le fichier approprié est sélectionné dans la liste et cliquez sur le rayon de gyration. Une tentative automatisée d’effectuer un ajustement Guinier sera fournie en cliquant sur le bouton RG automatique.
Élargissez la gamme de données utilisées pour inclure toutes les données Q faibles et commencez à réduire la plage de données en en prenant des points Q élevés jusqu’à ce que la limite de Q max times RG soit inférieure à 1,3. Utilisez la parcelle de résidus pour vérifier que les données sont linéaires dans la plage d’ajustement. Faites de petits ajustements à la région d’ajustement et surveillez la sensibilité de ces valeurs à la gamme de données utilisées dans l’ajustement.
Obtenez la fonction de distribution de probabilité P de R dans le gnome. Maintenant, démarrez l’assistant de distribution à distance dans l’onglet analyse. L’obtention d’un bon ajustement aux données est essentielle à l’obtention d’un modèle de qualité.
Déterminer Dmax, la distance interatomique maximale à l’intérieur de la molécule. Estimez une valeur pour Dmax en décochant la boîte pour forcer Rmax égale zéro et en entrant une grande valeur pour Dmax. La première interception X dans la parcelle de P de R donne cette estimation.
Apporter des modifications incrémentielles à cette valeur Dmax ainsi qu’à la gamme de données utilisées pour le nombre de points utilisés pour optimiser l’ajustement du gnome aux données et à la courbe P de R qui en résulte. Démarrez l’assistant de forme PRIMUS à partir du bouton dammif sur l’onglet analyse de l’analyse des données SAS et utilisez une sélection manuelle des paramètres. Définissez la gamme Guinier de l’ajustement et passez à l’étape suivante à l’aide des boutons de navigation.
Définissez les valeurs d’ajustement de la parcelle P de R et passez à l’étape suivante. Fournir des paramètres pour le processus de modélisation ab initio. Lancez ensuite le processus à l’aide du bouton commit.
Superposez et superposez l’enveloppe finale sans avec un modèle haute résolution connexe à l’aide de supcomb dans ATSAS. Placez une copie du modèle PDB haute résolution pour être adapté à l’enveloppe SANS dans l’annuaire de travail. Exécutez ensuite supcomb à partir de la ligne de commande en utilisant les noms de fichiers PDB comme deux arguments avec la structure de modèle énumérée en premier.
Enfin visualiser les résultats du modèle ab initio à l’aide de PyMOL, un programme de visualisation graphique moléculaire 3D. Une fois que l’enveloppe SANS et la structure haute résolution ont été superposées, ces modèles peuvent être visualisés à l’aide de n’importe quel programme de visualisation graphique moléculaire. Un aperçu du processus de visualisation PyMOL est affiché.
Une fois que les fichiers de structure PDB ont été ouverts dans PyMOL, les modèles doivent être visibles dans la fenêtre de visionneuse PyMOL. Les représentations de chaque modèle peuvent être modifiées à l’aide du bouton S à côté de chaque nom de fichier. Ici, une représentation de surface est utilisée pour l’enveloppe SANS et une représentation de dessin animé est utilisée pour l’épine dorsale protéique du modèle haute résolution.
Un schéma de couleurs approprié peut être sélectionné parmi les options disponibles sous le bouton C. Pour les chaînes protéiques, une coloration à arc à chaîne fournit un gradient de couleur du terminus N à C pour faciliter l’interprétation. La transparence est appliquée à la représentation de surface pour permettre une meilleure visualisation de la structure protéique dans l’enveloppe.
Pour les images de publication, un fond blanc est recommandé. Une fois que ces repères de visualisation ont été appliqués, les structures 3D peuvent être examinées en cliquant et en faisant glisser la structure. Des manipulations de la perspective et de la rotation et de la traduction des molécules peuvent être effectuées.
Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de faire correspondre avec précision le contraste neutronique de la tête de détergent et les groupes de queue avec le solvant D2O H2O. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à l’exploration de la structure des protéases asparto intramembranes. Ces protéines sont impliquées dans la réponse immunitaire, l’hépatite C et la maladie d’Alzheimer.
N’oubliez pas que travailler dans des laboratoires biochimiques et dans des installations à faisceaux de neutrons peut être dangereux. Des précautions telles que le port d’équipement de protection individuelle et le suivi de toutes les règles de sécurité et des affichages radiologiques des installations sont obligatoires lors de l’exécution de cette procédure.
