بيولوجية صغيرة الزاوية الأشعة السينية التشتت يوفر قياسات هيكلية من مجمعات الجزيئات والجزيئات. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن تكون العينة التي يتعين قياسها أحادية. على الرغم من أن في بعض الحالات، لا يكفي استبعاد حجم CHROMATography SAXS لإنتاج أحادية، يمكن إجراء deconvolution المستندة إلى البرامج من بيانات SAXS لإنتاج منحنى SAXS مثالي.
بعد هذا البروتوكول، يمكن استخدام برنامج فك الفولتيون وبرنامج مبعثر سهل الاستخدام لتحليل فيروس Vaccinia DNA polymerase إكسومينوس المسوخ. لتنفيذ طرح خلفية لبيانات الكروماتوغرافيا استبعاد حجم، افتح برنامج 4 مبعثر المستندة إلى Java وفتح علامة التبويب SEC. سحب وإسقاط ملفات البيانات المخفضة في إسقاط البيانات أدناه النافذة وانقر فوق زر دليل الإخراج وفتح لتعيين الدليل الإخراج الذي سيتم حفظ البيانات.
أدخل اسم العينة في المربع حفظ كمربع ثم انقر فوق التتبع. انقر على زر تحرير التفاصيل لتحرير التفاصيل التجريبية وملء الحقول المناسبة. لتحديد إطارات المخزن المؤقت يدوياً، انقر فوق تعيين المخازن المؤقتة.
انقر بزر الماوس الأيمن واسحب لإعادة تحديد المخزن المؤقت كشقة على منحنى التتبع قبل وحدة التخزين الفراغية لعمود اللوني استبعاد حجم من 100 إطارات تقريباً وانقر فوق تعيين المخزن المؤقت والتحديث لإعادة حساب ملف SEC. انقر بزر الماوس الأيمن واسحب لتحديد منطقة ذات أهمية على الرسم إشارة وانقر على اليسار وانقر على سحب الشعر المتقاطع في مؤامرة خريطة الحرارة لتحديد التكبير و المجموعة الفرعية من الإطارات التي سيتم استخدامها لدمج. مع النقر على اليسار آخر، وتسليط الضوء على الإطارات في الخريطة الحرارية المقابلة للمنطقة من أسفل اليمين من الشعر.
من الناحية المثالية، يجب أن يسلط الإطار الضوء على منطقة ذات لون سماوي في الغالب ونصف قطر مستقر من اللولب. عندما تكون راضية عن الإطارات المحددة، انقر فوق دمج لدمج الإطارات المطروحة وانقر فوق علامة التبويب التحليل لعرض البيانات. لdevolution من البيانات، تحميل مجموعة البيانات في برنامج فك التشفير.
في لوحة التحكم ضمن الملفات، استخدم رمز المجلد لتحديد موقع البيانات و تمييز كافة ملفات DAT. سيتم رسم مؤامرة من كثافة متكاملة مقابل عدد الإطار في مؤامرة سلسلة. ضمن علامة تبويب السلسلة، انقر فوق لتظليل المنحنى وفتح نافذة التحليل LC المنبثقة.
لتحديد منطقة عازلة مناسبة، انقر فوق إضافة منطقة لتحديد منطقة قبل ذروة الكروماغرام واحد بعد الجبهة المذيبات وانقر فوق تعيين العازلة. سوف تشير الإطارات المنبثقة إلى أن الإطارات لم يتم تحديدها للخلفية. لبدء EFA، انقر بزر الماوس الأيمن على الملف المميز وحدد EFA من القائمة.
في النافذة المنبثقة، يجب ملاحظة تحليل القيمة المفردة لمجموعة البيانات. في مربع عناصر التحكم، تحقق من قيم مربع الإطارات المستخدمة للتأكد من أن منطقة الذروة بأكملها إلى deconvolute مغطاة في مخطط الكثافة. سوف تظهر مؤامرة القيم المفردة كثافة القيم المفردة فوق خط الأساس.
إذا كانت المتجهات اليسرى والأيسر من غير متطابقتين، قم بتغيير رقم متجه المفرد الكبير إلى اثنين وتحريك الإطارات حتى تتشابه المتجهات المفردة اليسرى واليسرى. سيتم حساب EFA، وتوليد المؤامرات في الاتجاهات الأمامية والخلفية لكل متجه، والإشارة إلى متى تبدأ المكونات وتخرج من ملف تعريف الحل لبيانات SAXS SAXS استبعاد الحجم المحدد. سيحاول RAW تحديد النطاقات.
إذا لزم الأمر، استخدم الأسهم لتغيير النطاقات بحيث تكون كل دائرة هي بداية نقطة انقلاب، ترتفع من خط الأساس أو تسقط له وانقر على التالي. لتقليل أو إزالة المسامير، حدد الإطار الذي يتوافق تقريبًا مع الارتفاع باستخدام أسهم التحكم في النطاق لضبط عناصر تحكم نطاق المكون. عند تحقيق مربع تشي الحد الأدنى، انقر فوق مرة أخرى لإجراء التحقق من صحة.
إذا كانت المؤامرات EFA الأصلي لا تزال تبدو صالحة، انقر فوق التالي وحفظ بيانات التعليم للجميع لحفظ المؤامرات. ثم انقر فوق تم لإغلاق نافذة EFA. ثم في إطار RAW، افتح ملفات التعريف في لوحة المؤامرة لعرض المنحنيات.
في علامة التبويب التشكيلات الجانبية من لوحة التحكم، انقر بزر الماوس الأيمن لحفظ المنحنيات كملفات DAT. لتحديد SAXS، افتح علامة التبويب تحليل التشتت وحدد G لتحديد أداة التحليل Guinier اليدوية. في المؤامرة، إضافة أو إزالة نقاط بحيث لا يكون للمخلفات ابتسامة أو ميزة عبوس.
يجب ألا تتجاوز البيانات المحددة في ملاءمة Guinier الحد الأقصى لقائمة الانتظار مضروبة في نصف قطر حد ال gyration من 1.3. انقر فوق تطبيع Kratky. توفر المؤامرة الناتجة تقييمًا لحالة الجزيئات الكبيرة ، البيرمولية ، الأسطوانية ، المضطربة ، تطبيعها للكتلة ، والتركيز.
انقر فوق حجم الارتباط. سوف تظهر الكثافة الإجمالية المتناثرة ومنطقة متكاملة من الكثافة الإجمالية المتناثرة كدالة لمؤامرات Q كمرجع سريع للتحقق من جودة منحنى التشتت. لبدء تحليل المرونة، انقر فوق المرونة.
كل لوحة في نافذة منبثقة تظهر مؤامرة استغلال علاقة قانون السلطة التي توجد بين المدمجة و biopolymers مرنة ممدود. استخدم شريط التمرير الموجود في أسفل المربع لتغيير طريقة عرض البيانات حتى يتم الوصول إلى هضبة في أحد الأراضي. بعد إجراء تحليل المرونة مباشرة، انقر فوق وحدة التخزين.
سيتم إنشاء منبثقة من ثلاثة رسوم بيانية. مسار Porod-Debye حيث ترك شريط التمرير من مؤامرة المرونة ويظهر بيانات المنطقة الهضبة. لحساب حجم الجسيمات، قم بتحريك نقاط البداية والنهاية حتى يصبح الخط الأزرق على قطعة الأرض يناسب المنطقة الهضبة.
للحصول على نتيجة غير متحيزة، يجب أن تظهر البقايا في قانون القوة الأسي Porod-Debye تناسب أي نمط. تحت علامة التبويب P من R، يمكن ملاحظة توزيع المساحة الحقيقية ومنحنى التشتت للعينة. من الناحية المثالية، يجب أن يكون منحنى التوزيع سلسًا بدون موجات ويجب أن يلمس المحور x برفق.
انقر بزر الماوس الأيمن فوق اسم العينة وانقر فوق العثور على DMAX لفتح نافذة جديدة. حدود الحد الأقصى للبعد هي مسبقا مع الحد الأقصى المقترح مدى Q، ونقاط البيانات القصوى لاستخدامها في الحساب، والحد الأقصى الحد الأقصى للأبعاد السفلى والعليا، ودرج ألفا السفلى والعلوي. انقر فوق ابدأ.
سيتم إنشاء توزيع مركب مع البعد الأقصى المقترح ومستوى ألفا. إذا كانت هذه البيانات مقبولة، أغلق النافذة للرجوع إلى علامة التبويب P من R حيث سيتم اقتصاص قطعة المساحة المتبادلة الآن لتتناسب مع الحد الأقصى المقترح لنطاق Q. حدد النموذج أكثر وانقر فوق الخلفية لتعيين مستوى ألفا والحد الأقصى للبعد إلى القيم المقترحة من مربع المنبثقة.
انقر فوق تحسين. سيتم فتح مخطط التحقق من صحة الـ Cross- validation، يوضح ما إذا كان يجب رفض أي نقاط كما هو موضح باللون الأحمر. إذا كان هناك فقط عدد قليل من النقاط المرفوضة والتوزيع تبدو جيدة، ثم نموذج جيد.
ستقوم بطباعة تقرير في علامة التبويب التحليل. انقر بزر الماوس الأيمن لتمييز النموذج وانقر بزر الماوس الأيمن فوق اسم النموذج. حدد إنشاء تقرير من مجموعة البيانات الفردية.
سيتم فتح مربع نص للسماح بالتعليقات وسيتم إنتاج وثيقة PDF تظهر جميع الأرقام والقيم التي تم إنشاؤها. في هذا التحليل التمثيلي ، E9 DNA polymerase exonuclease ناقص متحولة كان منضما إلى الحمض النووي وتشغيل باستخدام حجم استبعاد الكروماتوغرافيا الصغيرة زاوية الأشعة السينية التشتت. ولوحظت قمتان.
أول قمة كبيرة تمثل البوليميراز الحمض النووي E9 exonuclease ناقص مركب الحمض النووي متحولة. والثاني يشير إلى الحالة غير منضمة. في حين أن النهج الكلاسيكي لاختيار الإطارات يوفر نصف قطر مستقر من gyration المجمع في الذروة الأولى، يتم دمج الذروة الثانية بوضوح ونصف قطر ال gyration عبر المؤامرة يبين أن ذروة الاهتمام الثانية ليس لديها دائرة نصف قطرها مستقرة من الزى بسبب التلوث عبر الذروة.
في هذا التحليل، يمكن استخدام خمسة إطارات فقط التي أظهرت نصف قطر شبه مستقر من الزى. عندما طرح، أعطوا نصف قطرها من gyration من 36.3 angstroms. وعندما تم إلغاء حجم القمم باستخدام التعليم للجميع، كان المنحنى المقابل للقمة الثانية متراكباً مع الأصل، مما يظهر انخفاضاً واضحاً في الإشارة إلى الضوضاء ونصف قطرها السفلي من 34.1 angstroms.
مؤامرة Kratky من البيانات يكشف عن أن مجمع مع ذروة معقدة هو أكثر كروية كما أكد منحنى العلاقات العامة الذي يعطي البعد الأقصى من 108.5 angstroms للمنحنى deconuted. البيانات غير deconvoluted لهذا التحليل هو أكثر ممدود مع أقصى بعد 120 angstroms، على الأرجح بسبب عدم تجانس الناشئة عن البوليميراز E9 غير منضم ناقص متحولة exonuclease. والخطوات الأكثر أهمية هي في اختيار القيم المفردة ونطاق البيانات المستخدمة حيث أن هذه تؤثر بشكل كبير على دقة deconvolution.
ولا ينبغي أن تؤخذ النتائج بمفردها، بل ينبغي تقييمها باستخدام تقنيات إضافية مثل الطرد المركزي التحليلي أو تشتت ضوء الليزر المتعدد الزوايا للسماح بتفسيرها البيولوجي. في خط العمود مقرونة SAXS في تركيبة مع deconvolution واجهة سهلة الاستخدام مثل برنامج مبعثر يوفر هو حزمة قوية لتوفير بيانات هيكلية ذات مغزى حتى من أنظمة صعبة في جوهرها.
