Cette méthode décrit le chemin complet de la conception, l’assemblage et la caractérisation des micelles complexes polyelectrolyte qui sont des nanoparticules qui sont formées à partir de l’auto-assemblage de polymères chargés en face. Certains défis majeurs avec l’auto-assemblage polyélectrolyte sont d’éviter les pièges cinétiques et de caractériser les nanoparticules. La technique d’annelage du sel que nous décrivons permet l’assemblage reproductible de micelles avec une faible dispersion en taille et en forme et nous décrivons les méthodes de caractérisation, y compris la diffusion de la lumière, la diffusion de rayons X à petit angle et la microscopie électronique.
La livraison d’acides nucléiques thérapeutiques est un défi de longue date pour la nanomédecine. Ces micelles complexes polyelectrolyte profitent de la forte charge négative de l’acide nucléique pour les séquestrer au cœur de la micelle où la couronne neutre en polymère les protège des nucléases et de la réponse immunitaire. La méthode d’assemblage doit s’appliquer à tout type de polymères chargés.
Nous les avons testés avec plusieurs polyanions et polycations et la méthode de caractérisation devrait s’appliquer à toutes les nanoparticules auto-assemblées, y compris les nanoparticules surfactantes et d’autres systèmes hydrophobes. Commencez par couver la solution oligonucléotide à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après l’incubation, refroidir pendant 15 minutes à température ambiante pour anneal thermiquement les acides nucléiques, puis ajouter 40 microlitres de 20 millimolar charge de concentration diblock copolymer.
Vortex la solution immédiatement et l’incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Pour effectuer le sel anneal, ajouter la solution de chlorure de sodium à la solution oligonucléotide pour une concentration finale d’une molaire et vortex pendant 10 secondes à la vitesse maximale. Incuber le mélange pendant 10 minutes à température ambiante, puis procéder au chargement dans la cartouche de dialyse.
Avant le chargement, étiquetez les cartouches avec un marqueur permanent et trempez-les dans le tampon pendant au moins deux minutes pour hydrater les membranes. Retirez le bouchon en tordant dans le sens inverse des aiguilles d’une montre et chargez l’échantillon à l’aide d’une pointe de pipette de chargement de gel. Presser doucement la membrane pour enlever l’excès d’air et remplacer le bouchon.
Mettez les cartouches dans 1X PBS 0.5 molaire bain de dialyse au chlorure de sodium en s’assurant qu’ils flottent avec les deux membranes exposées au bain. Après 24 heures, transférer les cartouches dans 1X PBS et les tremper pendant 24 heures supplémentaires. Après la dialyse finale, récupérer l’échantillon en enlevant les cartouches du bain, en enlevant le bouchon et en enlevant l’échantillon avec une pointe de pipette de chargement de gel.
Placer l’échantillon dans un tube de microcentrifugeuse propre de 1,5 millilitre et réfrigérer jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi. Préparez l’échantillon dans l’instrument DLS selon les instructions manuscrites, puis obtenez des données pendant au moins une minute en vous assurant que le taux de comptation est constant pendant toute la durée de l’acquisition. Examinez les données d’autocorrépendation.
La ligne de base à long terme doit être plate et la courbe d’autocorrépendance doit être lisse avec un minimum de dispersion. Le bruit dans les données peut être amélioré en acquérant plus de données. Pour effectuer la réduction et l’analyse des données à l’aide d’Irena, commencez par importer de la micelle dans des ensembles de données de fond.
Tracez l’échantillon et l’arrière-plan ensemble sur une échelle journal-journal et calculez le rapport échantillon/arrière-plan et vérifiez l’asymptote Q élevé. Calculez le ratio moyen sur cette plage Q et utilisez la macro de manipulation des données pour mettre à l’échelle l’arrière-plan avec le ratio calculé. Ensuite, tracez le signal soustrait d’arrière-plan sur Q et enregistrez les données avec un nouveau nom en vous assurant de ne pas écraser les données d’origine.
Ouvrez la macro de modélisation, puis chargez et tracez les données soustraites en arrière-plan. Pour trouver un modèle approximatif pour la surface externe de la micelle complexe polyélectrolyte, ou PCM, sélectionnez le flux à la plage Q modérée dans les contrôles de données en s’assurant d’inclure des oscillations si elles sont présentes. Dans les contrôles de modèle, sélectionnez la première population de diffusion et assurez-vous qu’elle est la seule en cours d’utilisation.
Sélectionnez la distribution de taille pour le modèle, choisissez le type de distribution désiré et sélectionnez le facteur de formulaire. Cet exemple est pour un cylindre flexible qui doit être ajouté manuellement sous le facteur de forme utilisateur. Téléchargez et ajoutez le facteur de forme du cylindre flexible, puis entrez les noms de fonction et les valeurs initiales pour les paramètres un et deux qui correspondent respectivement à la longueur du cylindre et à la longueur kuhn.
Ces cylindres sont plus longs que ce qui peut être résolu par SAXS de sorte que le paramètre de longueur du cylindre est fixé à une grande valeur. Définissez les paramètres initiaux de la recherche en entrant des valeurs dans l’échelle, la taille moyenne et les champs de largeur. Cliquez ensuite sur calculer le modèle pour dessiner le facteur de forme résultant.
Une fois que des paramètres raisonnables ont été trouvés, cliquez sur le modèle d’ajustement pour effectuer un moins de carrés non ligneux adaptés aux données. Ensuite, modéliser la diffusion des polymères individuels dans le noyau PCM. Ajustez les commandes de données pour sélectionner la plage Q où se produit une dispersion excessive qui se trouve généralement dans la plage modérée à élevée.
Ajoutez une deuxième population de dispersion et assurez-vous qu’elle est la seule en service. Sélectionnez le niveau unifié pour le modèle, ajustez les facteurs G et RG de GDA pour vous assurer que le modèle ne prédit pas une diffusion excessive à faible Q et utilisez le PB d’ajustement entre les curseurs macro pour obtenir une estimation initiale de ces paramètres. En ce qui concerne le facteur de forme, effectuer un ajustement non lignel pour le modèle de niveau unifié.
Si un pic de diffraction est présent, ajoutez un troisième modèle pour le pic de diffraction dans la gamme Q d’intérêt. Une fois que les valeurs approximatives d’ajustement sont obtenues pour les populations de dispersion individuelles, allumez les trois ensemble et optimisez l’ajustement combiné. Enfin, vérifiez que chaque valeur reste physiquement raisonnable et enregistrez l’ajustement en sélectionnant le magasin dans le dossier.
Le résultat de cette procédure devrait être un modèle composite qui décrit les données de diffusion de rayons X à petit angle bien au-dessus d’une grande gamme d’échelles de taille. Ce protocole a été utilisé pour concevoir, assembler et caractériser des micelles complexes en polyélectrolyte nucléique ou PCMs. La taille du noyau micelle est principalement entraînée par la longueur du bloc chargé du copolymère de bloc et est largement indépendante de la longueur de l’homopolymère.
Des données dynamiques de diffusion de lumière ont été acquises pour des PCMs sphériques formés à partir de copolymères de bloc relativement longs dans de courts oligonucléotides monoblocèdes. La fonction d’autocorréation s’est dégradée à une valeur plate avec l’échelle de temps unique ayant pour résultat le pic de taille unique dans la distribution de taille repIS. La diffusion complexe de petites rayons X d’ange ou les spectres d’intensité DE SAXS peuvent être exactement adaptés en combinant des modèles pour les corrélations spatiales multiples qui sont présentes et la diffusion de lumière de multiangle peut être employée pour étendre des mesures de diffusion aux échelles plus longues de longueur.
Les PCM de morphologie variable peuvent également être photographiés à l’aide d’une microscopie électronique pour vérifier que le radii et la forme du noyau sont compatibles avec les valeurs obtenues à partir des données SAXS. Lors de l’ajustement des données SAXS, il est important de rendre compte de chaque fonctionnalité de diffusion et d’utiliser des méthodes complémentaires comme TEM pour s’assurer que vous utilisez le facteur de forme correct.
