Ce protocole permet l’auto-organisation spontanée des tactoïdes de microtubules à l’aide d’un réticulateur anti-parallèle, MAP65. Ce système peut nous aider à comprendre l’organisation des microtubules et les systèmes biologiques comme les fuseaux mitotiques. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’un système minimaliste capable de recréer des formes en forme de fuseau pour les microtubules, hautement reproductible et accessible à de nombreux laboratoires.
Cette méthode n’est pas seulement applicable aux systèmes cellulaires, mais peut également servir de modèle pour les études de cristaux liquides à l’échelle méso. Pour préparer la tubuline, sortez d’abord une aliquote de tubuline non étiquetée contenant un milligramme de tubuline lyophilisée du congélateur à moins 80 degrés Celsius et conservez-la sur de la glace. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de PEM-80 froid.
Pour dissoudre tout le lyophilate, gardez le tube sur de la glace pendant 10 minutes. Ensuite, sortez un tube de tubuline marquée à la rhodamine contenant 20 microgrammes de poudre de tubuline lyophilisée du congélateur à moins 80 degrés Celsius et conservez-le sur de la glace. Ensuite, ajoutez quatre microlitres de PEM-80 froid et gardez le tube sur la glace pendant 10 minutes pour dissoudre tout le lyophilate.
Une fois les tubulines lyophilisées dissoutes, ajouter 100 microlitres de la solution de tubuline non marquée remise en suspension à la solution de tubuline marquée à quatre microlitres de rhodamine. Ensuite, mélangez les solutions en tuyautant six à sept fois très lentement. Pour stocker les 100 microlitres restants de solution de tubuline non marquée, insérez d’abord le tube dans l’azote liquide pour congeler la solution, puis maintenez le tube à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation future.
Ensuite, répartissez le mélange de tubuline dans sept nouveaux tubes en ajoutant 15 microlitres dans chacun. Congelez les tubes dans de l’azote liquide comme démontré précédemment et stockez-les à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation future. Pour assembler des chambres d’écoulement pour effectuer des expériences, nettoyez d’abord une lame de verre avec de l’eau double distillée et séchez-la avec une lingette de laboratoire non pelucheuse.
Ensuite, nettoyez d’abord la lame avec de l’éthanol, puis de l’eau distillée en double. Pour créer un chemin d’écoulement, coupez un morceau de ruban adhésif double face de 40 à 50 millimètres de long. Ensuite, divisez-le entre les deux pour créer deux bandes de ruban plus minces et placez les deux bandes sur la glissière espacées de cinq à huit millimètres.
Ensuite, placez des glissières de couverture silanisées sur le dessus du chemin d’écoulement. Ensuite, scellez la glissière et le couvercle a glissé les bandes de ruban adhésif double face en appuyant doucement sur la zone de bande avec le dos d’un stylo. Si le joint est bien fait, le ruban doit passer de translucide à clair.
Pour retirer le ruban adhésif supplémentaire sur les bords, coupez le ruban avec une lame de rasoir, en ne laissant qu’un millimètre de l’entrée de la chambre d’écoulement. Ensuite, étiquetez la chambre avec les paramètres expérimentaux appropriés Pour effectuer les expériences tactoïdes, tout d’abord, décongelez tous les réactifs nécessaires sur la glace et stockez-les sur la glace pendant le travail. Ensuite, recouvrez la chambre d’écoulement de 20 microlitres de 5% de tensioactif copolymère séquencé non ionique dissous dans le PEM-80 avec de petites gouttes aux deux extrémités de la chambre pour empêcher la formation de bulles d’air à l’intérieur.
Ensuite, conservez la chambre d’écoulement dans une chambre humide en boîte de Pétri avec une lingette de laboratoire humide et non pelucheuse pendant au moins cinq à sept minutes. Ensuite, mélangez PEM-80, GMPPCPP, Pluronic F-127, dithiothréitol, glucose, polyéthylène glycol, le mélange de tubuline fabriqué plus tôt, et MAP65 avec GFP MAP65 pour la visualisation dans un tube stérile en pipetant cinq à six fois, en gardant le tube sur la glace. Ensuite, ajoutez un microlitre d’une solution prémélangée de glucose oxydase et de catalase dans le tube de mélange tubuline-MAP et mélangez à nouveau en tuyautant sept à huit fois.
Diviser le volume total de la solution en deux portions à utiliser dans des chambres séparées. Pendant ce temps, le liquide ajouté plus tôt à la chambre d’écoulement doit être éliminé par action capillaire en utilisant une lingette de laboratoire non pelucheuse à l’autre extrémité de la chambre, ainsi que l’ajout du mélange tubuline-MAP à la chambre d’écoulement. Une fois que l’échantillon est complètement à l’intérieur de la chambre, scellez les deux extrémités de la chambre à l’aide d’époxy de cinq minutes et maintenez-le à 37 degrés Celsius pendant environ 30 minutes pour nucléer et développer des tactoïdes de microtubules.
Pour l’imagerie des tactoïdes par microscopie à fluorescence, utilisez des objectifs avec une ouverture numérique de 1,2 ou plus en grossissement de 60X ou plus pour recueillir suffisamment de lumière en fluorescence. Enregistrez les images avec un semi-conducteur à oxyde métallique gratuit ou une caméra à dispositif à couplage de charge. Pour maintenir l’échantillon, conservez-le dans une chambre environnementale fixée à 37 degrés Celsius.
Alternativement, d’autres réchauffeurs de scène, y compris des réchauffeurs de scène à air chaud et des colliers objectifs à température contrôlée avec circulation d’eau chaude, peuvent être utilisés à cette fin. Comme les sources d’excitation appropriées sont essentielles pour la fluorescence correcte de la tubuline de rhodamine, utilisez un laser de 561 nanomètres avec au moins un milliwatt de puissance à l’échantillon pour des images de bonne qualité. Cependant, pour GFP MAP65, remplacez la source d’excitation par un laser de 488 nanomètres.
Si vous utilisez la microscopie à épifluorescence à grand champ, utilisez un cube filtrant en rhodamine avec une excitation de 540 12,5 nanomètres, dichroïque de 545 nanomètres 12,5 nanomètres et une émission de 575 nanomètres de long passage. Pour GFP MAP, utilisez un cube de filtre GFP avec une excitation de 480 à 15 nanomètres, un dichroïque de 505 nanomètres coupé à 15 nanomètres et une émission de 515 nanomètres de long passage. Après vous être assuré que la puissance d’éclairage et les temps d’exposition sont tels que l’échelle d’intensité de l’appareil photo n’est pas saturée, prenez au moins 10 images de différentes zones pour imager plus de 100 tactoïdes dans les canaux rouge et vert, et enregistrez-les en tant qu’images TIFF 16 bits pour analyse.
En utilisant ce protocole, les tactoïdes de microtubules dont la formation est terminée en 30 minutes peuvent être directement visualisés au microscope. Les tactoïdes sont visibles à la fois avec un laser de 561 nanomètres dans le canal de la tubuline et un laser de 488 nanomètres dans le canal MAP65. Les images se chevauchent également parfaitement les unes avec les autres.
Dans cette méthode, la longueur et la largeur des tactoïdes ont également pu être mesurées. Le profil d’intensité d’un tactoïde varie en fonction de sa largeur. De plus, la nature immobile des tactoïdes des microtubules a été démontrée par la récupération de fluorescence après photo-blanchiment ou expériences FRAP, qui n’ont montré aucune récupération de fluorescence après le photo-blanchiment.
D’autre part, les expériences FRAP ont révélé une nature mobile de MAP65, pour laquelle une récupération progressive et une fluorescence ont pu être observées après photo-blanchiment. Cette récupération de fluorescence par MAP65 peut être adaptée à une désintégration exponentielle croissante pour trouver l’amplitude et l’échelle de temps de récupération. La partie de l’expérience tactoïde doit être terminée dans les 10 à 12 minutes, car la tubuline peut se détériorer rapidement sur la glace, ce qui peut nuire à la nucléation des tactoïdes.
Les travaux futurs avec différentes protéines de réticulation de microtubules et de protéines motrices de réticulation, des enzymes capables de déplacer des microtubules, continueront d’exposer de nouvelles informations sur l’auto-organisation du fuseau mitotique.
