Ce travail a été soutenu par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada Discovery Grant RGPIN36481-08 à William G. Bendena.

1. Préparation des organismes expérimentaux <ol><li> Choisissez 10 nématodes en phase L4 par souche 24 h avant de commencer l&#39;essai afin de s&#39;assurer que les organismes sont de jeunes adultes lorsqu&#39;ils sont testés. Pour chaque mutant ou nématode de contrôle testé, choisissez 10 L4 (10 pour le contrôle et 10 pour l&#39;essai). <ol><li> Maintenir les organismes L4 en utilisant des méthodes standard 26 , 27 pendant 24 h sur des plaques de gélose standard ensemencées avec OP50 Escherichia coli . Si des organismes sont perdus pendant les étapes de lavage suivantes, compensez en augmentant la taille de l&#39;échantillon de départ ( c.-à-d., Choisissez 20 vers plutôt que 10). Note: Le comportement est un phénotype indépendant. Effectuez la méthode en trois exemplaires pour chaque souche sur trois jours distincts. Inclure des souches de contrôle supplémentaires et des conditions pour de nouvelles souches, comme l&#39;a souligné la section de discussion. </li></ol></li><li> Immédiatement avant l&#39;analyse, transférer l&#39;orga expérimentaleÀ une plaque de gélose sans bactéries et permet aux nématodes de se déplacer librement pendant 1 min pour éliminer les excès de bactéries. <ol><li> Si les organismes expérimentaux ont subi des conditions de contamination pendant les 24 heures précédant l&#39;essai, les jeter. </li></ol></li><li> Pipetter 1 mL de M9 sur la plaque sans bactéries pour laver les vers dans un tube à microcentrifugeuse. </li><li> Centrifuger à 3 000 xg pendant 1 min. Les vers doivent former une pastille au bas du tube. Aspirer la solution M9 sans perturber la pastille de ver. Ajouter 1 mL de M9 à la pastille de ver, inverser le tube pour mélanger les vers avec la solution. </li><li> Répétez les étapes 1.4 trois fois de plus. <ol><li> Si l&#39;excès de bactéries a été initialement transféré avec les vers, répétez pour un total de 5 fois. Aucune bactérie ne doit être transférée aux plaques de cuisson de cuivre. Si les aliments sont transférés à la plaque de dosage, cela entravera la collecte précise des données. </li></ol></li><li> Après le lavage final, aspirer le surnageant jusqu&#39;à 10081; L de M9 et la boulette de ver est restée. Attention: les comportements liés à la famine deviennent évidents après 30 min. Par conséquent, les vers doivent être immédiatement transférés de la solution une fois que les étapes de lavage ont été achevées. </li></ol> 2. Préparation des plaques de dosage <ol><li> Préparer des plaques d&#39;agar NGM standard deux jours avant l&#39;essai. <ol><li> Si les plaques sont conservées dans un environnement humide, faire des plaques d&#39;agar 3 jours avant le dosage. Sinon, retirez le couvercle de la plaque pendant 3 à 6 h pour assurer une sécheresse adéquate (si dans un environnement stérile). </li></ol></li><li> Avec un marqueur permanent épais, faites une ligne sur la face inférieure de la plaque le long du bord extérieur et une autre pour former une barrière intermédiaire ( Figure 1 ). La barrière de ligne médiane doit être équidistante de chaque bord de la plaque. Utilisez une règle pour assurer des mesures précises. Ces lignes serviront de guide lors du transfert de bactéries et de la solution de cuivre. À condition queE. coli est transféré avant la solution de cuivre, ces lignes serviront d&#39;indicateurs. </li><li> Plaque de semence avec 50 μL d&#39;OP50 E. coli sur un seul côté de la barrière de cuivre pour créer une pelouse uniforme ( Figure 2 ). La concentration bactérienne devrait rester constante dans les dosages; Cependant, une faible variabilité a été observée en réponse à des différences légères de concentration. <ol><li> Utilisez les lignes marquées sur la partie inférieure de la plaque pour s&#39;assurer que les bactéries ne sont pas en contact avec la solution de cuivre. Pourvu que la solution de cuivre traverse le bord de la plaque et forme une barrière de ligne médiane, transférez les bactéries afin que la solution de cuivre ne soit pas en contact avec la source de nourriture. </li></ol></li><li> Marquez un deuxième ensemble de plaques et ne transférez pas de E. coli OP50 ( Figure 2 ). Ces plaques serviront à évaluer le contrôle négatif. Ces plaques devraient également avoir unMarquant sur une moitié de la plaque pour indiquer l&#39;origine initiale du transfert. </li><li> Permettre aux bactéries de sécher puis d&#39;incuber les plaques à 37 ° C pendant une nuit. Assurez-vous que les taches bactériennes ne sont pas perturbées lors du transfert vers un incubateur ou une pièce de 37 ° C. Une perturbation excessive pourrait altérer l&#39;emplacement ou la forme du patch alimentaire. </li></ol> 3. Test de chimiotaxie <ol><li> Préparer à nouveau une solution de sulfate de cuivre (II) 0,5 M avant l&#39;heure de début du dosage. Pourvu que 125 μL de la solution soit utilisé par plaque, augmenter ce volume en fonction du nombre de plaques de dosage utilisées ( par exemple, 5 plaques de dosage, 625 μL). </li><li> Pipetter 100 μL de la solution de sulfate de cuivre (II) sur le bord de la gélose pour créer une barrière extérieure en cuivre. Le dessous marqué de la plaque devrait servir de guide. </li><li> Pipettez 25 μL de la solution de sulfate de cuivre (II) pour créer une barrière de ligne médiane. <ol><li> Assurez-vous que la solution de sulfate de cuivre (II) neEs pas entrer en contact avec le patch bactérien. Utilisez une technique tachetée, car les rayures peuvent affecter la locomotion en raison des indentations / rayures sur la gélose. </li></ol></li><li> Laisser sécher la solution de cuivre sur la plaque. La période peut varier en fonction des conditions de la plaque et du laboratoire. Vérifier visuellement la sécheresse toutes les 5 minutes après le transfert. Remarque: La solution de cuivre présente une teinte bleuâtre et est facilement identifiable. Utilisez un mouchoir de laboratoire pour mouiller légèrement la solution près du bord de la plaque pour discerner la sécheresse. </li><li> Pipettez 20 μL de la pastille de ver du bas du tube sur la moitié libre de bactéries de la plaque de dosage. <ol><li> Assurez-vous que 10 vers sont transférés à la plaque de dosage. Si des vers supplémentaires ont été inclus accidentellement, retirez-les en choisissant avec de l&#39;huile d&#39;halocarbon pour s&#39;assurer qu&#39;aucune bactérie ne soit ajoutée à la plaque. Chaque dosage devrait avoir un nombre constant de nématodes pendant le dosage. REMARQUE: si trop peu de vers sont transfA commis une erreur lors des essais, l&#39;augmentation de la taille initiale de l&#39;échantillon permettra d&#39;atténuer les pertes potentielles lors des lavages et des transferts. </li></ol></li><li> Retirer l&#39;excès de M9 de la plaque avec un tissu de laboratoire. M9 ne devrait pas entrer en contact avec la solution de sulfate de cuivre (II). Attention: assurez-vous que les vers et la surface de la gélose ne sont pas affectés lors de cette étape. Si utilisé trop dur, le tissu de laboratoire peut créer des indentations sur la surface de gélose de la plaque et peut éliminer les vers. Les vers accidentellement éliminés via KimWipe doivent être éliminés. </li><li> Une fois que la solution M9 a été retirée et que tous les vers ont commencé des modèles de locomoteurs non liquides, démarrez le chronomètre d&#39;essai. <ol><li> Optimalement, retirer la solution M9 dans un min. Le paramètre essentiel est l&#39;identification de la locomotion sinusoïdale. Les vers englobent différemment, p . Ex. Battant plutôt que sinusoïdal, lorsqu&#39;ils sont liquides. Commencez le chronomètre d&#39;essai une fois que chaque organe expérimentalL&#39;iso ne cesse de se débattre. </li></ol></li><li> Vérifier les plaques d&#39;essai toutes les 30 min. <ol><li> Pour les plaques de dosage avec des taches bactériennes, on obtient des grappes positives s&#39;ils atteignent le patch alimentaire sur une période de 4 h. Pour les plaques de contrôle négatives, marquer positivement les organismes s&#39;ils ont traversé la barrière. </li></ol></li></ol>

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Nous n&#39;avons rien à divulguer.

Cette conception de dosage modifie l&#39;essai de course alimentaire 24 pour inclure une solution de cuivre pour créer une barrière de ligne médiane aversive et autour du bord de la plaque pour empêcher une perte de nématodes. Les organismes sont testés pour leur capacité à traverser la barrière aversive et à atteindre un patch alimentaire sur une période de 4 h. Dans le contexte de npr-9 (GF) , nous avons utilisé ce dosage pour évaluer comment les conditions de famine pourraient affecter les réponses aversives et la détection des aliments. Pourvu que nous ayons précédemment caractérisé npr-9 (GF) comme défectueux pour la réactivité à la nourriture et les indices aversifs, nous avons combiné plusieurs indices environnementaux avec l&#39;état nutritionnel pour évaluer si la famine pouvait moduler les comportements défectueux npr-9 (GF) . Ce dosage repose sur la capacité d&#39;un ver à détecter et à répondre aux stimuli chimiques et aux signaux alimentaires 3 , 4 . Compte tenu des diverses variables analysées, les conditions de l&#39;exLes organismes expérimentaux doivent être contrôlés méticuleusement pour éliminer les facteurs de confusion. Pour les mutants non caractérisés, c&#39;est -à- dire ceux qui présentent une aversive inconnue ou une réactivité alimentaire, des souches de contrôle supplémentaires devraient être utilisées. Les souches défavorisées avides, p.ex. che-2 ou odr-3 28 , et les mutants qui ne modifient pas les modèles de locomotricité hors des aliments, p . Ex. Tph-1 29 , devraient également être évalués en parallèle pour s&#39;assurer que le cuivre et les conditions de famine sont correctement contrôlés. En outre, pour mettre plus directement en évidence la contribution de la famine au comportement évalué, des conditions de dosage distinctes peuvent également être développées pour des contrôles supplémentaires. Par exemple, les nématodes peuvent être affamés immédiatement avant le dosage et transférés dans la plaque de dosage (avec des aliments) afin d&#39;identifier à quelle vitesse un organisme dans un état affamé réagira au cuivre et atteindra le patch alimentaire. Notre analyse actuelle souligne avErsive réponses que les organismes expérimentaux progressent d&#39;un bien alimenté à l&#39;état affamé. Notre dosage est une modification du test de chimiotaxie C. elegans couramment utilisé 4 dans lequel un stimulus plus fort ( c. -à-d. Une concentration élevée) a été incorporé afin d&#39;évaluer les comportements sur une période plus longue. Plutôt que d&#39;évaluer des réponses instantanées, ce dosage peut être utilisé pour mesurer les changements dans les réponses aversives à mesure que les organismes progressent vers un état affamé (si les contrôles nécessaires sont inclus). Des évaluations similaires ont été utilisées en l&#39;absence de cuivre afin d&#39;évaluer les réponses au retrait de l&#39;éthanol, c&#39;est-à - dire les nématodes qui localisent les aliments au fil du temps 24 . Comme c&#39;est le cas avec un dosage comportemental chez C. elegans, le contrôle des variables environnementales est essentiel pour assurer des résultats constamment reproductibles. Les organismes doivent tous être de la même agE, étant donné que les réponses comportementales peuvent varier selon l&#39;âge. En outre, la variabilité de l&#39;état nutritionnel des vers peut modifier l&#39;acclimatation dans les conditions de famine. Par conséquent, les vers expérimentaux ne devraient pas subir de famine à aucun point avant ce protocole. L&#39;expérience de la génération de parents par la famine peut également influencer le comportement de la progéniture 30 ; Par conséquent, il est conseillé de s&#39;assurer que les organismes expérimentaux sont bien alimentés pendant au moins deux générations. De plus, le nombre d&#39;organismes transférés dans les plaques de dosage devrait rester constant étant donné que la densité de la population locale peut influencer les taux de dispersion 31 . Une fois que les vers ont été transférés sur les plaques, il est essentiel d&#39;éliminer l&#39;excès de solution M9 avec un tissu de laboratoire sans endommager la surface de la gélose. L&#39;altération de la surface peut entraver les phénomènes spontanés de localisation. L&#39;excès de solution doit être supprimé de manière appropriée avant de commencer le début officiel deLe dosage pour s&#39;assurer que le comportement de dérapage, c&#39;est-à - dire un modèle de locomotorie des nématodes observé dans le liquide, n&#39;est pas présent. Un indicateur clair est de rechercher un comportement de rampement. Les plaques d&#39;essai doivent être contrôlées de sorte que la sécheresse des plaques et des bactéries soit cohérente. Les plaques excessivement fraîches peuvent causer des défauts de locomotrie et peuvent également interférer avec la détection des stimuli environnementaux 6 . L&#39;application des solutions de cuivre doit être aussi cohérente que possible afin que les barrières aversives soient convenablement épaisses et qu&#39;elles ne soient pas en contact avec la source alimentaire. L&#39;application d&#39;une très faible solution de cuivre pourrait diminuer le temps de réponse aversif de type sauvage, alors que trop pourrait se révéler létale pour les nématodes. Viser une épaisseur uniforme de la solution de cuivre donne les meilleurs résultats. Si des indentations sont créées dans l&#39;agar pendant l&#39;application de la solution de cuivre, la plaque d&#39;essai doit être jetée. Des vers peuvent se creuser à travers de tels trous 32, Surtout lorsqu&#39;ils sont confrontés à une substance aversive ou à une famine. Pour assurer l&#39;uniformité des plaques entre les échantillons, des populations mixtes de vers ( c&#39;est-à - dire un type mutant et sauvage) pourraient être mesurées sur la même plaque si elles étaient distinctement marquées ( p. Ex. Via GFP). Bien que ce dosage ait été effectué sur des plaques d&#39;agar de taille standard, des plaques plus grandes peuvent être utilisées ( par exemple, un diamètre de 100 mm). Dans ce scénario, la durée de l&#39;analyse devrait être prolongée jusqu&#39;à 6 h pour fournir suffisamment de temps pour le mouvement du ver. Des plaques plus grandes pourraient permettre de tester de plus grandes populations et pourraient être utilisées pour étudier comment la densité de la population affecte les réponses aversives pendant de longues périodes de temps. Des procédures techniquement plus avancées pourraient également être incorporées avec l&#39;utilisation d&#39;équipements de suivi de vis couplés à un étage mobile 33 . Le suivi des vers permettait des mesures plus précises et permettrait la collecte de variables supplémentaires ( p. Ex. </Em&gt; fréquence de rotation, fréquence d&#39;inversion). En outre, la collecte des données serait enregistrée en permanence au cours de la période de 4 h pour donner un calendrier plus précis des comportements induits par la famine. Le dosage peut être facilement adapté pour permettre la mesure de phénotypes alternatifs. L&#39;âge du ver peut être varié pour permettre des mesures sur les changements aversifs induits par la famine liés à l&#39;âge. En outre, les variations de l&#39;état nutritionnel des vers expérimentaux pourraient également permettre d&#39;analyser l&#39;habitude de la famine dans le contexte de l&#39;aversion alimentaire et chimique. Tant que les protocoles sont cohérents entre les ensembles de données comparables, presque tout pré-conditionnement des organismes expérimentaux pourrait être évalué via le test de chimiotaxis.

Caenorhabditis elegans a été utilisé comme modèle pour l&#39;étude de la neurobiologie pendant des décennies en raison de la facilité relative dans l&#39;analyse des circuits d&#39;un système nerveux composé de seulement 302 neurones 1 . Pourvu que l&#39;organisme dépend de la réponse aux signaux environnementaux, une grande partie du système nerveux est dédié à la régulation de l&#39;intégration des signaux environnementaux 2 . Malgré la simplicité de son système nerveux, C. elegans peut détecter et répondre à divers signaux environnementaux, y compris les répulsifs 3 , les attractifs 4 , la température 5 et même l&#39;humidité 6 . Un échec à intégrer correctement les signaux environnementaux a été lié à un certain nombre de troubles du comportement et des états neurodégénératifs dans les systèmes modèles de mammifères 7 à 9 . Avec une gamme de modèles disponibles de maladies neurales<html> 10 dans C. elegans et le développement des écrans pharmaceutiques de nématodes 11 , cet organisme s&#39;est avéré être un système utile pour l&#39;étude de la neurobiologie. Compte tenu de la disponibilité d&#39;un connecteur 1 de nématode cartographique et de mutations de presque tous les gènes du génome 12 du nématode, notre compréhension du système nerveux des nématodes et, par extension, est partiellement limitée par la conception d&#39;essais créatifs appropriés. Un certain nombre de tests de chimiotaxis ont été développés au cours des 40 dernières années pour évaluer la réactivité des nématodes à divers stimuli aversifs 3 , 4 , 13 , 14 , 15 . L&#39;expérimentation initiale impliquait l&#39;introduction d&#39;une stimulation environnementale aiguë tandis qu&#39;un seul ver gremed sur une plaque d&#39;agar= &quot;Xref&quot;&gt; 3 , 14 , 16 . Les modifications immédiates apportées aux réponses locomotrices ont été enregistrées. Par exemple, l&#39;octanol odorant volatil peut être appliqué sur un cheveu et flanqué devant le nez d&#39;un nématode pour stimuler l&#39;initiation de la locomotion vers l&#39;arrière dans les vers sauvages 17 . Des tests plus complexes ont également été développés pour incorporer de multiples variables comme moyen d&#39;évaluer le choix du comportement 18 . Une variation de ce dosage implique l&#39;utilisation d&#39;une solution de cuivre pour créer une barrière de ligne médiane aversive 4 . Un attirant, à savoir le diacétyle, a été placé d&#39;un côté de la barrière chimique avec des vers transférés à l&#39;écart de la source de diacétyle. Les vers défectueux pour les réponses aversives au cuivre ont immédiatement traversé la barrière pour atteindre le diacétyle, tandis que les vers de type sauvage ont d&#39;abord été repoussés par la barrière. Les réponses ont été marquées lorsque les vers se sont approchés de la barrière de cuivreSans observations à long terme. Lorsque les vers sont évalués après avoir subi des conditions de famine, leur sensibilité aux stimuli environnementaux diminue 19 . Lorsque l&#39;octanol chimique aversif est flotté devant le nez des nématodes, les organismes de type sauvage stimulent le mouvement vers l&#39;arrière en 3 à 5 s lorsqu&#39;ils sont alimentés. Après que ces organismes ont été retirés des aliments pendant 10 min, ils présentent une réponse retardée de 8 à 10 s 20 . Ainsi, avec une famine accrue, les nématodes affichent une diminution de la réponse aversive aux signaux environnementaux nuisibles car la recherche d&#39;aliments devient plus essentielle à la survie. À l&#39;inverse, les nématodes qui exagèrent le récepteur neuropéptidique 9 ( npr-9) ne répondent pas à l&#39;octanol sur ou hors de l&#39;alimentation et présentent une incapacité à répondre à un certain nombre de stimulants aversifs 21 . Ces organismes npr-9 (GF) ne modulent pas non plus leur fréquence d&#39;inversion en présence d&#39;aliments, mais peuventInversée en réponse à des stimulations tactiles sévères indiquant qu&#39;elles sont capables de se déplacer vers l&#39;arrière 21 . Nous avons également évalué les mutants npr-9 (LF) étant donné qu&#39;ils présentent une fréquence d&#39;inversion anormalement diminuée des aliments, mais peuvent moduler leur comportement en présence de nourriture 21 . Le couplage de l&#39;état nutritionnel du ver avec l&#39;introduction de stimuli externes aiguë a aidé à élucider les mécanismes par lesquels une voie alimentaire peut moduler largement les voies de signalisation sensorielle 22 , 23 . La présence d&#39;aliments dans l&#39;environnement des nématodes a également été utilisée pour évaluer les réponses au retrait de l&#39;éthanol 24 . Dans cette expérience, les vers ont été incubés à différentes concentrations d&#39;éthanol, puis ont été placés sur une plaque d&#39;agar avec un morceau de nourriture connu sous le nom de &quot;test de race alimentaire&quot;. Le patch alimentaire a été placé sur un bord de la plaque alors que les nématodes wÉtaient séparés de la source de nourriture. Le retrait de l&#39;éthanol a été évalué en mesurant la durée de temps nécessaire pour que les vers atteignent le morceau de nourriture. Ce test d&#39;aversion en cuivre à base de nutriments s&#39;appuie sur l&#39;analyse alimentaire pour intégrer d&#39;autres variables environnementales, à savoir l&#39;alimentation et le cuivre, tout en évaluant les changements de comportement dans le temps. Il s&#39;agit d&#39;une adaptation d&#39;un protocole communément utilisé dans la communauté de C. elegans 4 . Ce protocole a été utilisé pour évaluer les réponses aversives et la détection des aliments sur une période de quatre heures 21 . Étant donné que les comportements de famine de l&#39;exposition de ver après 30 minutes de privation de nourriture 25 , nous sommes également en mesure d&#39;évaluer comment les changements d&#39;état nutritionnel peuvent influencer les réponses environnementales. Les conditions de ce dosage mesurent la façon dont les organismes expérimentaux changent de réactivité aux stimuli aversifs au fil du temps, ce qui évalue les changements de comportement commeLes organismes progressent vers un état affamé (et des mesures continues de la famine prolongée). Étant donné que les animaux npr-9 (GF) ne modifient pas leur comportement en réponse à de la nourriture ou de nombreux indices aversifs, nous avons cherché à identifier si ces déficits comportementaux persisteraient dans le contexte de la famine. En fin de compte, cette conception de dosage a été formulée pour évaluer spécifiquement les mutants npr-9 (GF) mais peut être davantage adaptée pour caractériser également de nouvelles souches.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="689">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:332px;">M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.]</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Produced in lab</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:332px;">Cupric Sulfate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C-1297</td>
			<td style="width:167px;">Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a caenorhabditis elegans nutritional-status based copper aversion assay

Pour assurer la survie, les organismes doivent être capables d&#39;éviter des habitats défavorables tout en assurant une source alimentaire constante. Caenorhabditis elegans modifie ses caractéristiques locomotrices lors de la détection de divers stimuli environnementaux et peut moduler leur suite de réponses comportementales en réponse à des conditions de famine. Les nématodes présentent généralement une diminution de la réponse aversive lorsqu&#39;ils sont éliminés d&#39;une source alimentaire pendant plus de 30 minutes. L&#39;observation des changements comportementaux en réponse à un état nutritionnel changeant peut donner un aperçu des mécanismes qui régulent la transition d&#39;un état bien nourri à un état affamé. Nous avons développé un dosage qui mesure la capacité d&#39;un nématode à traverser une barrière aversive ( c.-à-d. Le cuivre) puis atteindre une source alimentaire pendant une période prolongée. Ce protocole s&#39;appuie sur les travaux antérieurs en intégrant plusieurs variables d&#39;une manière qui permet une collecte continue de données lorsque les organismes se déplacent vers unN condition de plus en plus affamé. En outre, ce dosage permet une augmentation de la taille de l&#39;échantillon afin que les populations de nématodes plus grandes puissent être évaluées simultanément. Les organismes défectueux pour détecter ou répondre au cuivre traversent immédiatement la barrière chimique, alors que les nématodes de type sauvage sont initialement repoussés. Comme les vers de type sauvage sont de plus en plus affamés, ils commencent à traverser la barrière et à atteindre la source de nourriture. Nous avons conçu ce dosage pour évaluer un mutant incapable de répondre à des indices environnementaux divers, y compris la sensation alimentaire ou la détection de produits chimiques aversifs. Lorsqu&#39;ils ont été évalués via ce protocole, les organismes défectueux ont immédiatement traversé la barrière, mais ont également été incapables de détecter une source de nourriture. Par conséquent, ces mutants traversent à plusieurs reprises la barrière chimique malgré une entrée temporaire d&#39;une source alimentaire. Ce test permet de tester directement les populations de vers afin d&#39;évaluer les défauts potentiels liés à l&#39;aversion et à la famine.

Nous avons utilisé une souche de surexpression de type sauvage (N2), npr-9 (tm1652) et npr-9 , c&#39;est -à- dire npr-9 (GF) (IC836 - npr-9 :: npr-9; sur-5 :: gfp; odr -1 :: rfp), pour évaluer les réponses à la famine et à l&#39;aversion au cuivre. Les organismes de type sauvage sont capables de détecter et de répondre à la barrière de cuivre aversive, tandis que les mutants npr-9 (GF) n&#39;initialisent pas une réponse aversive au cuivre au cours du test de 4 h 21 . Après 30 minutes de famine, environ 50 à 60% des organismes de type sauvage (N2) traversent la barrière de cuivre et atteignent le patch alimentaire. À la marque de 2 h, 75% des nématodes de type sauvage atteignent la source de nourriture. À la fin de l&#39;analyse, 100% des organismes N2 se sont déplacés vers la source alimentaire. En revanche, la majorité des organismes npr-9 (GF) ne modulent pas les caractéristiques locomotrices en réponse à la nourriture et continueront à traverser la barrière aversive même après avoir pris contact avec un alimentla source. Les vers Npr-9 (GF) ne modifient pas continuellement leur locomotion en réponse aux aliments pendant le dosage de 4 h et seulement 30% des organismes d&#39;essai se trouvent sur les aliments à un moment donné. Les animaux npr-9 (LF) ne fonctionnent pas aussi bien que les organismes N2, mais modulent leurs modèles de locomotrie à mesure que la famine augmente pour atteindre le patch alimentaire ( Figure 3 ). Lorsque les organismes N2 ou npr-9 (LF) sont évalués via ce dosage sans nourriture, ils traversent rarement la barrière du cuivre. Les mutants npr-9 (GF) traversent à plusieurs reprises la barrière d&#39;avant en arrière ( Figure 4 ). <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55939/55939fig1.jpg" /> Figure 1 : Une représentation visuelle des marques pour indiquer le placement de la solution de cuivre sur le dessous d&#39;une plaque de Petri de 5 cm. Ces indications servent à assurer queLes sections de la plaque ont été mesurées de manière appropriée et servent de guide pour transférer le patch bactérien et ensuite la solution de cuivre sur la surface de la gélose. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55939/55939fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55939/55939fig2.jpg" /> Figure 2 : La plaque de Petri de 5 cm est divisée en deux sections pour les plaques de dosage alimentaire et la pelouse bactérienne est formée dans le centre de l&#39;une de ces sections pour la plaque sur place. Le patch alimentaire ne doit pas entrer en contact avec le composé d&#39;essai qui traverse les bords de la plaque et forme une barrière de la ligne médiane. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55939/55939fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> &lt;P class = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55939/55939fig3.jpg" /> Figure 3 : Pourcentage de vers N2, npr-9 (tm1652) et npr-9 (GF) qui atteignent la source alimentaire au cours d&#39;une période de quatre heures en réponse à l&#39;essai d&#39;aversion en cuivre à base d&#39;état nutritionnel. Les points de données sont des moyennes d&#39;au moins trois expériences (n&gt; 30 vers) effectuées sur des jours distincts pour les deux souches. Les données sont présentées en moyenne ± erreur standard et analysées avec une ANOVA à deux sens répétée. ** p &lt;0,01, significativement différent des animaux N2 dans des conditions identiques. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55939/55939fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55939/55939fig4.jpg" /> Figure 4 : Pourcentage de N2, npr-9 (tm1652) et npr-9 (GF) W orms qui traversent la barrière de cuivre sans source alimentaire sur un essai de quatre heures. Les souches précitées ont été évaluées pour l&#39;aversion en cuivre en l&#39;absence de nourriture. Les réponses positives sont notées comme traversant la barrière de cuivre et restant sur la moitié non-originale de la plaque. Les points de données sont des moyennes d&#39;au moins trois expériences (n&gt; 30 vers) effectuées sur des jours distincts pour les deux souches. Les données sont présentées sous la forme moyenne ± SE et au moins 10 animaux ont été testés dans trois expériences indépendantes analysées avec une ANOVA à deux voies à répétition. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55939/55939fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

UNE<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Ensemble d&#39;aversion en cuivre à base d&#39;état nutritionnel

Ici, nous présentons un dosage spécifique de Caenorhabditis elegans conçu pour évaluer les changements dans le comportement d&#39;aversion au cuivre et la capacité de localiser une source alimentaire commune, à mesure que l&#39;organisme progresse d&#39;un état nutritionnel nourri à un affamé.

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

a-caenorhabditis-elegans-nutritional-status-based-copper-aversion

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

6.4K vues.  Queen's University.  Ici, nous présentons un dosage spécifique de Caenorhabditis elegans conçu pour évaluer les changements dans le comportement d'aversion au cuivre et la capacité de localiser une source alimentaire commune, à mesure que l'organisme progresse d'un état nutritionnel nourri à un affamé. 

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Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

Quantification automatisée de la fluorescence dans Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

Recherche

Neurosciences

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Système modèle pour l&#39;étude de Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C. elegans genome includes potential antipsychotic drug (APD) targets conserved in humans, including genes encoding proteins required for neurotransmitter synthesis and for synaptic structure and function. APD exposure produces developmental delay and/or lethality in nematodes in a concentration-dependent manner. These phenotypes are caused, in part, by APD-induced inhibition of pharyngeal pumping1,2. Thus, the developmental phenotype has a neuromuscular basis, making it useful for pharmacogenetic studies of neuroleptics. Here we demonstrate detailed procedures for testing APD effects on nematode development and pharyngeal pumping. For the developmental assay, synchronized embryos are placed on nematode growth medium (NGM) plates containing APDs, and the stages of developing animals are then scored daily. For the pharyngeal pumping rate assay, staged young adult animals are tested on NGM plates containing APDs. The number of pharyngeal pumps per unit time is recorded, and the pumping rate is calculated. These assays can be used for studying many other types of small molecules or even large molecules.

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approaches for testing the effects of antipsychotic drugs (APDs) in Caenorhabditis elegans are demonstrated. Assays are described for testing drug effects on development and viability and on pharyngeal pumping rate. These methods are also applicable for pharmacogenetic experiments with drug classes other than APDs.

Méthodes pour étudier les mécanismes d&#39;action des antipsychotiques dans<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Un test pour mesurer les effets de l&#39;éthanol sur la vitesse de Locomotion<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambres agarose à long terme de l&#39;imagerie calcique<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

A Behavioral Essai pour mécanosensibilité de marcm-fondé clones dans<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.

Novel Metrics à Caractériser Embryonic Allongement du nématode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc superoxide dismutase 1 (SOD1). The structural instability of SOD1 and the detection of SOD1-positive inclusions in familial-ALS patients supports a potential causal role for misfolded and/or aggregated SOD1 in ALS pathology. In this study, we describe the development of a cell-based assay designed to quantify the dynamics of SOD1 aggregation in living cells by high content screening approaches. Using lentiviral vectors, we generated stable cell lines expressing wild-type and mutant A4V SOD1 tagged with yellow fluorescent protein and found that both proteins were expressed in the cytosol without any sign of aggregation. Interestingly, only SOD1 A4V stably expressed in HEK-293, but not in U2OS or SH-SY5Y cell lines, formed aggregates upon proteasome inhibitor treatment. We show that it is possible to quantify aggregation based on dose-response analysis of various proteasome inhibitors, and to track aggregate-formation kinetics by time-lapse microscopy. Our approach introduces the possibility of quantifying the effect of ALS mutations on the role of SOD1 in aggregate formation as well as screening for small molecules that prevent SOD1 A4V aggregation.

We describe a method to quantify the aggregation of misfolded proteins. Our protocol details lentiviral induced stable cell line generation, automated confocal imaging, and image analysis of protein aggregates. As an illustrative application, we studied the effect of small molecules in promoting SOD1 aggregation in a time- and dose-dependent manner.

Développement de dosage pour une Quantification contenue élevée de Formation globale de protéine mutante Sod1 dans les cellules vivantes

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Imagerie ratiométrique Calcium des neurones individuels en comportement Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic spines have been described for DD GABAergic neurons as the input sites from presynaptic cholinergic neurons in the motor circuit of Caenorhabditis elegans. This synaptic circuit can now serve as a powerful new in vivo model of spine morphogenesis and function that exploits the facile genetics and ready accessibility of C. elegans to live-cell imaging. 
This protocol describes experimental strategies for assessing DD spine structure and function. In this approach, a super-resolution imaging strategy is used to visualize the intricate shapes of actin-rich dendritic spines. To evaluate the DD spine function, the light-activated opsin, Chrimson, stimulates the presynaptic cholinergic neurons, and the calcium indicator, GCaMP, reports the evoked calcium transients in postsynaptic DD spines. Together, these methods comprise powerful approaches for identifying genetic determinants of dendritic spines in C. elegans that could also direct spine morphogenesis and function in the brain.

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are important cellular features of the nervous system. Here live imaging methods are described for assessing the structure and function of dendritic spines in C. elegans.&#160;These approaches support the development of mutant screens for genes that define dendritic spine shape or function.

Imagerie des épines dendritiques chez Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic ...