Tri cellulaire magnétique (MACS) : isolement des lymphocytes T thymiques

Source: Meunier Sylvain^1,2,3, Perchet Thibaut^1,2,3, Sophie Novault⁴, Rachel Golub^1,2,3
1 Unité de lymphopoiesis, Département d'immunologie, Institut Pasteur, Paris, France
² INSERM U1223, Paris, France
³ Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Paris, France
⁴ Flow Cytometry Platfrom, Cytometry and Biomarkers UtechS, Center for Translational Science, Institut Pasteur, Paris, France

La défense contre les agents pathogènes dépend de la surveillance par le système immunitaire. Ce système est complexe et comprend de nombreux types de cellules, chacune ayant des fonctions spécifiques. Cette composition complexe permet des réponses immunitaires à une grande diversité d'agents pathogènes et de blessures. L'immunité adaptative permet des réponses spécifiques contre des agents pathogènes spécifiques. La majorité des cellules responsables de ce type d'immunité sont les lymphocytes (cellules B et lymphocytes T). Habituellement, les cellules B réagissent aux infections extracellulaires (comme les infections bactériennes), et les lymphocytes T réagissent aux infections intracellulaires (comme les infections virales). Les différents types de cellules dans les populations de lymphocytes peuvent être caractérisés par la combinaison de protéines de surface cellulaire qu'ils expriment et / ou par un panneau de cytokines sécrétées.

Le tri magnétique permet l'enrichissement des populations cellulaires ciblées à l'aide de propriétés magnétiques et l'expression d'une ou plusieurs protéines de surface cellulaire (1, 2). Cette technique se compose de trois étapes. Tout d'abord, les cellules sont incubées avec des perles magnétiques qui sont couplées avec un ou plusieurs anticorps monoclonaux spécifiques. Les cellules qui expriment les protéines de surface qui se lient à ces anticorps se fixent aux perles magnétiques. Ensuite, les populations cellulaires ciblées sont capturées avec un aimant. Pour finir, les cellules ciblées sont élifiées de l'aimant. À la fin, deux produits de tri sont obtenus, l'un contenant des cellules non étiquetées et l'autre contenant les cellules cibles couplées avec les perles magnétiques. Les colonnes peuvent être utilisées pour améliorer l'efficacité du tri magnétique. Dans la colonne, un élément non magnétique allonge le chemin de la cellule à travers la colonne. Par conséquent, le flux cellulaire est ralenti, facilitant la capture cellulaire par l'aimant.

Figure 1 : Représentation schématique de la séparation magnétique. Les leucocytes thymiques sont tachés d'anticorps biotinylated anti-CD3. Après le lavage, les perles couplées de streptavidin (SAV) fixent spécifiquement la biotine sur des anticorps anti-CD3. (1) Les cellules sont transférées dans une colonne. (2) L'aimant ne retient pas les cellules non étiquetées, tandis que les cellules CD3-positives restent dans la colonne. Enfin, la colonne est séparée de l'aimant et (3) les cellules CD3-positives sont élucées dans le milieu. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Il existe deux types de tri magnétique (3). Dans le tri positif, les cellules d'intérêt sont capturées avec les perles magnétiques. Dans le tri négatif, les cellules indésirables sont enlevées en capturant avec les perles magnétiques portant les anticorps appropriés. Cette technique MACS permet un bon enrichissement des cellules ciblées et améliore le pourcentage de cellules récupérées de 1-20% à 60-98% dans un organe. Après le tri, il est nécessaire de vérifier la pureté et le tri des cellules par différentes méthodes (par exemple, cytométrie du débit). La technique MACS est idéale pour enrichir une population cible pour d'autres expériences telles que la culture cellulaire ou l'analyse du cycle cellulaire.

Dans cet exercice de laboratoire, nous démontrons comment isoler les leucocytes thymiques et par la suite enrichir les cellules thymiques CD3-positives du mélange en utilisant la technique de tri de cellules magnétiques.

1. Préparation

1. Avant de commencer, enfilez des gants de laboratoire et des vêtements de protection appropriés.
2. Laver tous les outils de dissection, d'abord avec un détergent, puis avec 70% d'éthanol, puis les sécher avec un essuie-tout propre.
3. Préparer 200 ml de solution de sel équilibrée de Hank (HBSS) contenant 2 % de sérum fœtal de veau (FCS).

2. Dissection

1. Épingler une souris euthanasiée sur une plaque de dissection en position de supine.
2. À l'aide de ciseaux et de forceps, effectuez une laparotomie longitudinale pour accéder à la cavité thoracique.
3. Retirez le cœur pour avoir accès au thymus, qui est situé au-dessus du cœur. Ensuite, identifier le thymus, qui est composé de deux lobes blancs et est situé dans la cavité thoracique au-dessus du cœur.
4. À l'aide de forceps, détachez soigneusement le thymus et placez-le sur le plat Petri avec 5 ml de HBSS 2% FCS.

3. Isolement des cellules immunitaires

1. Déposer le thymus sur une passoire cellulaire de 40 m sur le même plat Petri. Écraser le thymus avec un piston pour le dissocier dans le même plat.
2. Transférer le thymus dissocié et le liquide dans un tube centrifugeuse de 15 ml.
3. Laver le plat Petri avec 5 ml de HBSS 2% FCS et transférer le milieu lavé aussi dans le même tube de centrifugeuse.
4. Centrifuger le tube à 370 x g pendant 7 min à 20oC et jeter le supernatant en évitant la pastille.
5. Resuspendre la pastille dans 2 ml d'acétate de potassium pour lyser les érythrocytes. Attendez 2 min, puis faites le volume jusqu'à 14 ml à l'aide de HBSS 2% FCS.
6. Centrifuger le tube à nouveau à 370 x g pendant 7 min à 20oC. Jeter le supernatant et resuspendre la pastille dans 5 ml de HBSS 2% FCS.
7. Estimer la concentration cellulaire à l'aide de l'essai de coloration bleu trypan et ajuster la concentration cellulaire finale à 10⁷ cellules/mL en utilisant le volume approprié de HBSS 2% FCS.

4. Étiquetage magnétique des cellules immunitaires

1. Prenez deux tubes FACS. Étiqueter un tube, les « lymphocytes T non enrichis », et l'autre tube, les « lymphocytes T enrichis », qui seront séparés à l'aide de l'étiquetage magnétique.
2. Distribuer la solution cellulaire dans chacun des deux tubes FACS.
3. Centrifuger le tube des « lymphocytes T enrichis » à 370 x g pendant 3 min à 20 oC et jeter le supernatant en évitant la pastille.
4. Resuspendre la pastille dans 250 l de mélange d'anticorps biotinylated anti-CD3 (tableau 1, Mix 1).

Tableau 1 : Composition du mélange d'anticorps. Les mélanges 1 et 2 sont utilisés pour la séparation magnétique. Mix 3 est utilisé pour évaluer l'enrichissement cellulaire après la séparation magnétique.

5. Incuber le mélange suspension-anticorps cellulaire pendant 15 minutes à 4 oC dans l'obscurité.
6. Ajouter 3 ml de HBSS 2% FCS aux tubes et les centrifuger à nouveau à 370 x g pendant 3 min à 20oC.
7. Jeter le supernatant et resuspendre la pastille dans 250 perles couplées à la streptavidine (tableau 1, Mix 2).
8. Incuber le mélange cellulaire et les perles pendant 20 min sur la glace.
9. Ensuite, ajouter 3 ml de HBSS 2% FCS et bien mélanger et centrifuger à nouveau à 370 x g pendant 3 min à 20oC.
10. Resuspendre la pastille dans 2 ml de HBSS 2% FCS.

5. Séparation magnétique des cellules CD3-Positives

1. Placez la colonne sur l'aimant et ajoutez 3 ml de HBSS 2% FCS pour humidifier le système. Attendez 5 minutes.
2. Ensuite, pipet les cellules étiquetées dans la colonne.
3. Après que la suspension de cellule passe par la colonne, lavez la colonne X3 fois avec 3 ml de HBSS 2% FCS.
4. Ensuite, retirez la colonne de l'aimant et placez-la dans un tube de collecte de 15 ml.
5. Pour éliner les cellules cibles, ajouter 5 mL de HBSS 2% FCS à la colonne et rincer la colonne avec le piston.
6. Répétez l'étape d'élution avec un autre 5 ml de HBSS 2% FCS.

6. Évaluation de l'enrichissement cible-cellule par cytométrie de flux

1. Transférer 500 l de suspension de cellules élucées sur un tube FACS étiqueté « cellules T enrichies ». Transférer 200 l de suspension des « lymphocytes T non enrichis » à un deuxième FACS.
2. Ensuite, centrifuger les deux tubes à 370 x g pendant 7 min à 20oC.
3. Jeter le supernatant, puis ajouter 100 l d'anticorps fluorescents Mix 3 (voir tableau 1) aux deux tubes.
4. Incuber les deux tubes pendant 20 min à 4 oC dans l'obscurité.
5. Ensuite, ajouter 3 ml de HBSS 2% FCS aux tubes et les centrifuger à 370 x g pendant 3 min à 20oC.
6. Jeter le supernatant, puis resuspendre chaque tube dans 250 L de HBSS 2% FCS.
7. Maintenant, évaluez le taux d'enrichissement cellulaire CD3-positif par cytométrie de flux.

7. Analyse des données

1. Ouvrez l'icône 'FlowJo' et faites glisser les fichiers pour chaque tube dans la fenêtre "All Sample".
2. Double clic sur le fichier "cellules T enrichies" pour afficher l'intrigue de point affichant la diffusion vers l'avant (FSC-A) sur l'axe X et la diffusion latérale (SSC-A) sur l'axe Y.
3. Cliquez sur "Polygone" pour faire le tour des populations de lymphocytes.
4. Ensuite, double clic sur la population encerclée pour créer une nouvelle fenêtre.
5. Sélectionnez "FSC-W" sur l'axe Y et "FSC-A" sur l'axe X, et encerclez les cellules négatives FSA-W. Dans la fenêtre "Inpopulation identification", nommez la population cellulaire "cellules uniques".
6. Double clic sur la population encerclée pour créer une nouvelle fenêtre. Sélectionnez «CD3» sur l'axe Y et encerclez les cellules CD3-positives. Dans la fenêtre "Sous-population d'identification" nom de votre population cellulaire "cellules T".
7. Répétez l'opération avec les « lymphocytes T non enrichis ».
8. Pour visualiser la population cellulaire, cliquez sur "Layout editor" et faites glisser la population de "lymphocytes T" des fichiers " cellules T enrichies " et " cellules T non enrichies " dans l'onglet.
9. Des parcelles de points représentant les lymphocytes CD3MD apparaîtront. Les cellules CD3MD ne devraient apparaître que dans la population d'intérêt dans le tube enrichi CD3MD.
10. Pour évaluer l'enrichissement des lymphocytes CD3MD dans les cellules triées, cliquez sur « Éditeur detable», puis faites glisser la population de « lymphocytes T » à partir de fichiers « cellules T enrichies » et « cellules T non enrichies » dans le tableau.
11. Sur le menu "Statistique", sélectionnez "Fréquence des lymphocytes" cellules pour vérifier le pourcentage de cellules CD3 dans tous les lymphocytes, puis cliquez sur "Create table".
12. Les valeurs de paramètres apparaîtront dans un nouveau tableau. Pour les « lymphocytes T enrichis », la fréquence des cellules CD3 MD devrait être d'environ 80 %.

Dans ce protocole, des cellules CD3-positives ont été enrichies des leucocytes thymiques utilisant le tri de cellules magnétiques (figure 1). Avant l'enrichissement des cellules magnétiques, les cellules CD3-positives représentaient 53,6 % du total des cellules thymiques (figure 2, panneaux supérieurs). Après l'enrichissement des cellules magnétiques, le pourcentage de cellules CD3-positives a augmenté à 95% (figure 2, panneaux inférieurs). Ainsi, MACS est une technique simple, rapide et efficace d'enrichissement cellulaire pour enrichir les populations cellulaires désirées à partir d'un mélange de suspension cellulaire.

Figure 2 : Stratégie de gating et tri des tests de pureté. Les cellules sont d'abord fermées en fonction de leur morphologie (à gauche : FSC-A, SSC-A), puis les cellules sont tracées contre CD3 (à droite : CD3, SSC-A). Le panneau supérieur représente la suspension de cellules de thymus avant l'enrichissement cellulaire. Le panneau inférieur représente la suspension de cellules de thymus après tri de cellules magnétiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

La technologie de séparation magnétique est une méthode courante pour trier facilement et rapidement une population de cellules cibles. En utilisant des anticorps spécifiques aux lymphocytes T et des perles magnétiques, nous avons enrichi la fréquence des lymphocytes T dans notre échantillon. Le taux de pureté à la fin de l'expérience dépend du pourcentage de cellules cibles dans la suspension cellulaire initiale. Les cellules obtenues après le tri des cellules magnétiques peuvent être utilisées à diverses fins telles que le transfert cellulaire ou l'analyse du cycle cellulaire. Une autre méthode de tri, utilisant la cytométrie de flux, peut être utilisée pour enrichir les cellules. Cette technique donne un taux de pureté très élevé après le tri cellulaire mais il faut plus d'étapes et prend plus de temps.