Tests pour identifier les aliments génétiquement modifiés

Source : Laboratoires de Margaret Workman et Kimberly Frye - Depaul University

La modification génétique des aliments a été une question controversée en raison des inquiétudes débattus sur la santé et la sécurité environnementale. Cette expérience montre la compréhension technique de comment la nourriture ADN est génétiquement identifié, permettant éduqué décision prise sur les dangers de sécurité et possibilité d’utiliser des organismes génétiquement modifiés (OGM) dans les denrées alimentaires.

Réaction en chaîne de la polymérase (PCR) est utilisée pour amplifier l’ADN de la nourriture pour tester la présence d’ADN génétiquement modifié dans les produits alimentaires. Présence de bandes d’ADN spécifiques est détectée par électrophorèse sur gel de tirer des extraits alimentaires ADN par un gel d’agarose à 3 %, une concentration suffisamment dense pour séparer les bandes d’ADN contenant l’ADN génétiquement modifié. Plusieurs contrôles sont utilisés dans la procédure de l’électrophorèse pour s’assurer que l’ADN est extrait avec succès d’aliments test (amorce de la plante), et pour fournir des exemples connus des deux organismes génétiquement modifiées ADN (ADN génétiquement modifié a acheté) et non génétiquement modifiées ADN (acheté le contrôle des denrées alimentaires certifiés sans OGM).

Réaction en chaîne de la polymérase (PCR) identifie les séquences d’ADN qui ont été insérés dans la plante génétiquement modifiée. Contrairement aux protéines, l’ADN est une molécule relativement stable, donc des fragments d’ADN peuvent être isolés des produits hautement transformés et sont suffisamment intacts à être amplifié par PCR. Ingénieurs en génétique seulement un petit nombre de séquences régulatrices (séquences promoteur et terminateur) pour contrôler l’expression des gènes insérés, et si ces séquences sont communs à la plupart des cultures génétiquement modifiées. Les deux séquences identifiées dans cette procédure sont deux des principales séquences régulatrices, gène promoteur 35 s du virus de mosaïque du chou-fleur (CaMV) et gène terminator nopaline synthase (NOS) d’Agrobacterium tumefaciens.

PCR consiste à cycles répétitifs, chacune constituée de dénaturation modèle primer recuit et extension de l’amorce recuite par Taq ADN polymérase. Une fois que l’ADN est extrait de la nourriture, un thermocycleur est utilisé pour manipuler rapidement la température, entraînant les étapes des cycles de PCR.

L’étape de dénaturation intervient lorsque des échantillons sont chauffés rapidement à 94 ° C, causant séparer les brins d’ADN. Refroidissement rapide à 59 ° C permet d’amorces recuire pour les brins d’ADN séparés, puis réchauffer à 72 ° C pendant la Taq DNA polymérase d’étendre les amorces, effectuant une copie complète de chaque brin d’ADN et de compléter un cycle thermique.

L’amplification de l’ADN peut alors être effectué par un gel d’agarose avec électrophorèse pour séparer l’ADN en bandes visibles pour l’identification du gène promoteur 35 s et le terminateur de NOS. Amplification de l’ADN est chargé dans le puits à une extrémité du gel, en utilisant un colorant de chargement achetés qui contribue à alourdir l’échantillon afin d’empêcher la dissolution dans la mémoire tampon environnante. La teinture de chargement fournit également un visuel, donc le mouvement de l’ADN peut être vu pendant l’électrophorèse dans le colorant « front ». Le processus d’électrophorèse fonctionne en utilisant un courant électrique séparé en bouts de cathode et l’anode. L’ADN est chargé dans le gel sur l’extrémité la plus rapprochée du côté de la cathode de la chambre, et la charge négative de l’ADN est attirée vers la fin de l’anode de la chambre et est aspirée dans l’agarose. Plus grandes séquences de l’ADN (augmentation du nombre de paires de bases) ne peut pas passer aussi facilement d’agarose et seront séparera au début, alors que les petites séquences peuvent se déplacer plus loin vers le bas le gel vers la fin de l’anode.

Un processus de coloration aide en se liant à l’ADN afin d’ajouter du contraste entre le gel de l’arrière-plan et les banques d’ADN pour une meilleure visualisation des résultats. À l’aide fournie emplacements connus pour les différentes tailles de séquences d’ADN que chaque gel de test peut être analysé pour la présence ou l’absence du promoteur 35 s et gènes terminator amendements.

Les contrôles servent à assurer que correctement l’ADN est extrait et de fournir une comparaison avec les échantillons de nourriture. Apprêt plant acheté est ajouté à chaque échantillon d’acides nucléiques communs à toutes les plantes. Cela permet un contrôle de qualité sur le processus d’extraction de l’ADN, parce que tout ADN végétal extrait devrait être prolongée avec cette amorce pendant l’ACP et doit aussi être vu sur le gel après que électrophorèse est terminée. Apprêt acheté pour le 35 s et des gènes de NOS sont utilisés comme témoin positif pour fournir des bandes d’ADN sur le gel pour la modification génétique. Si le contrôle de modèle positif OGM ne pas amplifier, il y a un problème avec la réaction de PCR et un résultat négatif OGM de la nourriture de test n’est pas fiable. Un aliment non-OGM certifié est également acheté et utilisé comme contrôle négatif pour montrer ce que la séparation d’ADN ressemble lorsque aucun matériel génétiquement modifié n’est présent.

1. extraction de l’ADN d’échantillons de denrées alimentaires

1. Ajouter 500 µL de matrice de mélange acheté PCR à chacun des 2 tubes à bouchon vissé à l’aide d’une pipette de transfert ou d’une micropipette µL de réglage du volume 200-1 000. Pipetter en haut et en bas avec la pipette entre chaque aliquote de mélanger uniformément la matrice de la PCR.
2. Tube avec bouchon à vis une étiquette « sans OGM » et l’autre « test ».
3. Peser avec 0,5 g d’aliments certifiés sans OGM et mettez-la dans le mortier.
4. Ajouter 2,5 mL d’eau distillée et broyer avec un pilon pendant 2 min former une boue.
5. Ajouter un autre 2,5 mL d’eau distillée et continuer à broyer avec un pilon jusqu'à ce que le coulis devient assez lisse à la pipette.
6. Pipetter 50 µL de lisier au sol pour le tube avec bouchon à vis contenant 500 µL de prémélange PCR étiqueté « sans OGM » à l’aide de la marque 50 µL sur une pipette jaugée. Reboucher le tube.
7. Répétez les étapes 1,3 et 1,6 pour préparer l’échantillon alimentaire.
8. Pipetter 50 µL de sol test alimentaire boue pour le tube avec bouchon à vis marqué « test ». Reboucher le tube.
9. Vortex du non-OGM alimentaires et test PCR tubes pour tubes de 1 min et place au bain-marie à 95 ° C pendant 5 min. Si aucun vortex n’est disponible, mettez le tube plusieurs fois à mélanger avant de mettre dans le bain d’eau.
10. Placer les tubes dans une centrifugeuse pendant 5 min. Une pastille solide devrait former au fond du tube. Si le pellet n’est pas formé après 5 min, centrifuger à nouveau pendant 2 min d’intervalle jusqu’en formes de granulés.
11. Tubes peuvent être utilisés immédiatement pour PCR ou conservés au réfrigérateur pendant 1 semaine.

2. mise en place des réactions de PCR

1. Numéro tubes PCR 1 – 6 et leur initiale. Les numéros doivent correspondre au contenu tube suivants énuméré au tableau 1.
2. Placer chaque tube PCR identifié dans un microtube porte caps ouverts.
3. Avec une pointe fraîche pour chaque ajout, ajouter 20 µL de l’apprêt indiquée sur le tableau 1 dans chaque tube PCR. Tubes de Cap.
4. Avec une pointe fraîche pour chaque tube, ajouter 20 µL de l’échantillon d’ADN indiquée sur le tableau 1 dans chaque tube PCR, en veillant à ne Pipeter qu’à partir du surnageant et évitant le culot solid au fond des tubes.
5. Après que chaque échantillon d’ADN est reversé dans le tube PCR correspondant, utilisez la pipette pour mélanger l’ADN et l’amorce de pipetage doucement de haut en bas ; Reboucher les tubes.
6. Placer les tubes PCR dans le thermocycleur et programmer le cycler pour :
   Dénaturation initiale : 1 cycle à 94 ° C pendant 2 min.
   Amplification : 40 cycles à 94 ° C pendant 1 min (dénaturer), 59 ° C pendant 1 min (recuit) et 72 ° C pendant 2 min (extension).
   Dernière Extension : 1 cycle à 72 ° C pendant 10 min.
   Tenez : 4 ° C indéfiniment.

3. préparation du Gel d’Agarose à 3 %

1. À l’aide de laboratoire ou ruban adhésif, solidement ruban l’extrémité ouverte du bac gel. S’assurer que le ruban est scellé sur les bords du plateau pour empêcher la fuite d’agarose fondu.
2. Peser avec 3 g d’agarose dans un erlenmeyer de 250 mL ou plu.
3. Ajouter 100 mL de tampon de x TAE 1 (acheté ou préparé à partir de concentré).
4. Utiliser une plaque magnétique avec une barre de remuer, chauffer le bol jusqu'à ce que le gel d’agarose est complètement dissous dans la mémoire tampon et la solution est en ébullition et se transforme en claire. Alternativement, un four à micro-ondes permet de placer le bécher au four et chauffage pour les intervalles de 30 s, en utilisant une tige d’agitation à mélanger toutes les 10 s, répéter jusqu'à ce que le mélange est en ébullition et tours clairs.
5. Inverser une fiole d’Erlenmeyer de 50 mL dans l’ouverture du flacon 250 mL d’agir comme un reflux, empêchant d’agarose solution de s’évaporer.
6. Permettre d’agarose solution refroidir jusqu'à 60 ° C et verser de 30 à 50 mL dans chaque bac gel collées.
7. Placer un peigne de gel dans la première paire des encoches pour créer les puits du gel.
8. Laisser refroidir complètement avant d’enlever le ruban adhésif et un peigne. Gel va se solidifier et le tourner de clair à nuageux, quand prêt, environ 10-20 min.

4. électrophorèse des produits PCR

1. Placer un gel d’agarose pré-faites de 3 % sur un plateau de gel ou utiliser un plateau de gel qui a été utilisé pour monter un gel d’agarose coulé de 3 %.
2. Glisser le plateau de gel dans la chambre d’électrophorèse avec les puits le plus proche de l’extrémité de la cathode (noir).
3. Versez 1 tampon de x TAE dans la chambre, assez d’avoir 2 mm de tampon au-dessus de la barre d’État gel.
4. Obtenir les tubes PCR du thermocycleur et dans porte-microtube.
5. En utilisant un embout de la pipette frais chaque fois, ajouter 10 µL d’acheté Orange G colorant (LD) pour chaque échantillon de chargement et bien mélanger.
6. Charge 20 µl de la règle du poids moléculaire et 20 µL de chaque échantillon dans le gel dans l’ordre indiquent (tableau 2).
7. Électrophorèse en exécution pendant 30 min à 100 V.
8. Retirer bac gel gel chambre et faites-le glisser pour retirer du plateau. Placer le gel dans un bac de coloration.
9. Immerger le gel dans la tache de gel ADN acheté pendant 5 min, secouant délicatement plateau pour aider à distribuer la tache dans le gel.
10. Transférer le gel dans un récipient de laver et rincer avec de l’eau du robinet (40-55 ° C) pendant environ 10 s.
11. Décolorer en lavant x 3 dans l’eau chaude du robinet pendant 6 min chaque avec agitant doucement pour de meilleurs résultats. Si nécessaire, continuer de décoloration à l’eau tiède jusqu'à ce que le contraste souhaité est atteint.

Le tableau 1. Liste des numéros de tube approprié, amorces et des échantillons d’ADN.

Le tableau 2. L’ordre approprié pour charger 20 µL de la règle du poids moléculaire et 20 µL de chaque échantillon dans le gel.

Après décoloration, gels peuvent être analysés en regardant les ruelles de nourriture de test (tableau 3) pour déterminer si les bandes d’ADN pour le promoteur 35 s et des gènes terminator amendements sont présents dans les endroits connus sur le gel. Placer le gel sur une boite à lumière UV peut aider à fournir un contraste accru (Figure 1). Alternativement, les gels peuvent être placés sur du papier blanc ou jaune pour fournir un fond de couleur contrastante pour mettre en évidence des bandes d’ADN (Figure 2).

Figure 1. Un gel destained liste séparée des bandes d’ADN. Gel d’agarose après électrophorèse sur gel d’agarose sur boite à lumière UV.

Figure 2. Schéma des emplacements connus pour le promoteur 35 s et terminator NOS ADN. La présence ou l’absence d’une bande de 200 bp en voie 5 indique si oui ou non le test alimentaire contenant des OGM.

Tableau 3. Tailles de bande d’échantillon de PCR (paires de bases (bp)).

Réaction en chaîne de la polymérase (PCR) est utilisée pour amplifier l’ADN, permettant une large gamme d’ADN tests en laboratoire. Une zone d’essai maintenant possible avec PCR consiste à identifier les OGM en testant pour la présence ou absence de l’ADN des séquences utilisées dans la modification génétique des cultures vivrières. En règle générale, une culture est génétiquement modifiée pour conférer un avantage contre les répulsifs naturels à rendements idéales, par exemple les parasites (Figure 3), maladies, conditions de sécheresse (Figure 4), etc.. Parce que l’avantage est obtenu en insérant le matériel génétique d’une espèce différente dans l’ADN de la plante de culture, les potentiels pour la santé humain et les risques environnementaux ont été identifiés avec l’utilisation des OGM. Une préoccupation environnementale est la capacité de l’ADN génétiquement modifié doivent être échangées involontairement par des processus de pollinisation, qui pourraient conduire à l’ADN génétiquement modifiés entrant dans que les génomes de cultures destinés à être vendus comme non-OGM.

La figure 3. Larves de doryphore, dévorant les feuilles de la pomme de terre.

La figure 4. Maïs détruit par la sécheresse.