Surveillance multi-systèmes pour l’identification des crises, des arythmies et de l’apnée chez les lapins retenus conscients

Utilisant le vidéo-EEG-ECG-oximetry-capnography simultané, nous avons développé une méthodologie pour évaluer la susceptibilité des modèles de lapin pour développer des arythmies et des saisies provoquées. Ce nouveau système d’enregistrement établit une plate-forme pour tester l’efficacité et l’innocuité des traitements et peut capturer la cascade complexe d’événements multi-systèmes qui culminent dans la mort subite.

Les patients atteints de channelopathies ioniques sont à haut risque de développer des convulsions et des arythmies cardiaques mortelles. Il y a une prévalence plus élevée de maladies cardiaques et d’arythmies chez les personnes atteintes d’épilepsie (c.-à-d. cœur épileptique). En plus, des perturbations cardiaques et autonomes ont été rapportées entourant des saisies. 1:1.000 patients d’épilepsie/année meurent de la mort inattendue soudaine dans l’épilepsie (SUDEP). Les mécanismes du SUDEP restent mal compris. Les électroencéphalogrammes (EEG) et les électrocardiogrammes (ECG) sont deux techniques couramment utilisées dans le cadre clinique pour détecter et étudier les substrats/déclencheurs pour des saisies et des arythmies. Bien que de nombreuses études et descriptions de cette méthodologie soient chez les rongeurs, leur activité électrique cardiaque diffère considérablement de celle des humains. Cet article fournit une description d’une méthode non envahissante pour enregistrer le vidéo-EEG-ECG-oximetry-capnography simultané dans les lapins conscients. Comme la fonction électrique cardiaque est similaire chez le lapin et l’homme, le lapin fournit un excellent modèle d’études diagnostiques et thérapeutiques translationnelles. En plus de décrire la méthodologie pour l’acquisition de données, nous discutons les approches analytiques pour examiner la fonction électrique neuro-cardiaque et la pathologie chez les lapins. Ceci inclut la détection d’arythmie, l’analyse spectrale d’EEG et une échelle de saisie développée pour les lapins retenus.

L’électrocardiographie (ECG) est systématiquement utilisée dans le cadre clinique pour évaluer la dynamique de la conduction électrique cardiaque et le processus d’activation-récupération électrique. L’ECG est important pour détecter, localiser, et évaluer le risque d’arythmies, d’ischémie, et d’infarctus. Typiquement, des électrodes sont fixées à la poitrine, aux bras, et aux jambes du patient afin de fournir une vue tridimensionnelle du coeur. Une déviation positive est produite lorsque la direction de la dépolarisation myocardique est vers l’électrode et une déviation négative est produite lorsque la direction de la dépolarisation myocardique est éloignée de l’électrode. Les composants électrographiques du cycle cardiaque incluent la dépolarisation auriculaire (onde P), la conduction auriculaire-ventriculaire (intervalle P-R), l’excitation ventriculaire (complexe QRS), et la repolarisation ventriculaire (onde T). Il existe de grandes similitudes dans l’ECG et les mesures potentielles d’action chez de nombreux mammifères, y compris les humains, les lapins, les chiens, les cobayes, les porcs, les chèvres et les chevaux^1,2,3.

Les lapins sont un modèle idéal pour la recherche translationnelle cardiaque. Le cœur de lapin est similaire au cœur humain en termes de composition du canal ionique, et de propriétés potentielles d’action^2,4,5. Les lapins ont été utilisés pour la génération de modèles génétiques, acquis et induits par des médicaments de maladies cardiaques^2,4,6,7,8. Il existe de grandes similitudes dans l’ECG cardiaque et la réponse potentielle d’action aux médicaments chez l’homme et le lapin^7,10,11.

La fréquence cardiaque et le processus d’activation-récupération électrique cardiaque sont très différents chez les rongeurs, par rapport aux lapins, aux humains et à d’autres grands mammifères^12,13,14. Le cœur des rongeurs bat ~ 10 fois plus vite que les humains. En revanche, au segment ST iso-électrique chez les ÉC humains et les lapins, il n’y a pas de segment ST chez les rongeurs^14,15,16. En outre, les rongeurs ont une forme d’onde QRS-r ' avec une onde T inversée^14,15,16. Les mesures de l’intervalle QT sont très différentes chez les rongeurs par rapport aux humains et aux lapins^14,15,16. En outre, les valeurs normales d’ECG sont très différentes chez l’homme par rapport aux rongeurs^12,15,16. Ces différences dans les formes d’onde ECG peuvent être attribuées à des différences dans la morphologie du potentiel d’action et les canaux ioniques qui entraînent la repolarisation cardiaque^9,14. Alors que le courant transitoire de potassium vers l’extérieur est le courant de repolarisation majeur dans la morphologie potentielle d’action cardiaque courte (non dôme) chez les rongeurs, chez les humains et les lapins, il existe un grand dôme de phase 2 sur le potentiel d’action, et les courants de potassium redresseurs retardés (I_Kr et I_Ks)sont les principaux courants de repolarisation chez l’homme et le lapin^4,9,13,17. Il est important de faire remarquer que l’expression de I_Kr et I_Ks est absente/minime chez les rongeurs, et en raison de la cinétique d’activation temporelle de I_Kr et I_Ks, elle n’a pas de rôle dans la morphologie potentielle d’action cardiaque^9,13. Ainsi, les lapins fournissent un modèle plus translationnel pour évaluer les mécanismes des anomalies et des arythmies induites par les médicaments, acquises et héréditaires^{de l’ECG 4,7,13.} Ensuite, comme de nombreuses études ont montré la présence d’anomalies électriques neuronales et cardiaques dans les maladies cardiaques primaires (Syndrome du QT long^18,19,20)ou neuronales (épilepsie^21,22,23,24), il est important d’étudier les mécanismes sous-jacents dans un modèle animal qui reproduit étroitement la physiologie humaine. Bien que les rongeurs puissent suffire à modéliser le cerveau humain, les rongeurs ne sont pas un modèle idéal de la physiologie cardiaque humaine⁷.

L’électroencéphalographie (EEG) utilise des électrodes, généralement placées sur le cuir chevelu ou intracrânienne, pour enregistrer la fonction électrique corticale. Ces électrodes peuvent détecter des changements dans la vitesse de tir et la synchronicité de groupes de neurones pyramidaux proches dans le cortex cérébral²⁵. Cette information peut être utilisée pour évaluer la fonction cérébrale et l’état éveillé/de sommeil. De plus, les EEG sont utiles pour localiser l’activité épileptiforme et distinguer les crises d’épilepsie des événements non épileptiques (p. ex. activité non épileptiforme psychogène et événements cardiogéniques). Afin de diagnostiquer le type d’épilepsie, provoquant des facteurs, et l’origine de la saisie, des patients d’épilepsie sont soumis à de diverses manoeuvres qui peuvent apporter une saisie. Diverses méthodes incluent l’hyperventilation, la stimulation photique, et la privation de sommeil. Ce protocole démontre l’utilisation de la stimulation photique pour induire des aberrations et des convulsions d’EEG chez les lapins^26,27,28,29.

Des enregistrements vidéo-EEG-ECG simultanés ont été largement utilisés chez l’homme et les rongeurs pour évaluer l’activité comportementale, neuronale et cardiaque pendant les états pré-ictal, ictal et post-ictal^30. Alors que plusieurs études ont mené des enregistrements EEG et ECG séparément chez les lapins^4,31,32,33,un système d’acquisition et d’analyse simultanée de vidéo-EEG-ECG chez le lapin retenu conscient n’est pas bien établi³⁴. Cet article décrit la conception et la mise en œuvre d’un protocole qui peut enregistrer des données simultanées de vidéo-EEG-ECG - capnography-oxymétrie chez les lapins conscients afin d’évaluer la fonction électrique et respiratoire neuro-cardiaque. Les résultats recueillis à partir de cette méthode peuvent indiquer la susceptibilité, les déclencheurs, la dynamique et la concordance entre les arythmies, les convulsions, les troubles respiratoires et les manifestations physiques. Un avantage de notre système expérimental est que nous acquérons des enregistrements conscients sans avoir besoin d’un sédatif. Les lapins restent dans les contentions pendant ≥5 h, avec un mouvement minimal. Comme les anesthésiques perturbent la fonction neuronale, cardiaque, respiratoire et autonome, les enregistrements pendant l’état conscient fournissent les données les plus physiologiques.

Ce système d’enregistrement peut en fin de compte fournir des informations détaillées pour faire progresser la compréhension des mécanismes neurologiques, cardiaques et respiratoires de la mort subite inattendue dans l’épilepsie (SUDEP). En plus de la surveillance neurologique et cardiaque ci-dessus, des preuves récentes ont également soutenu le rôle de l’insuffisance respiratoire comme contribution potentielle à la mort subite après une crise^35,36. Pour surveiller l’état respiratoire des lapins, l’oxymétrie et la capnographie ont été mises en œuvre pour évaluer l’état du système respiratoire avant, pendant et après une crise. Le protocole présenté ici a été conçu dans le but d’évaluer le seuil pour pharmacologiquement et photic-stimulus a induit des saisies de lapin. Ce protocole peut détecter des anomalies subtiles d’EEG et d’ECG qui peuvent ne pas avoir comme conséquence des manifestations physiques. En outre, cette méthode peut être utilisée pour l’innocuité cardiaque et les tests d’efficacité anti-arythmique de nouveaux médicaments et dispositifs.

Toutes les expériences ont été menées conformément aux directives des National Institutes of Health (NIH) et au Upstate Medical University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). En outre, un aperçu de ce protocole est fourni à la figure 1.

1. Préparation de l’appareil de contrôle

1. Connectez l’ordinateur à un amplificateur avec une boîte de tête à 64 broches.
   REMARQUE: Chaque animal a quatre électrodes sous-cutanées droites de goupille du cuir chevelu (7 ou 13 mm) pour les EEG des 4 quadrants de la tête, 3 électrodes de broche thoracique sous-cutanées pliées (13 mm, angle de 35°) pourl’ECG(triangle d ' Einthoven), 1 électrode de masse de broche sous-cutanée pliante sur la jambe droite, et 1 électrode de goupille sous-cutanée droite du cuir chevelu au centre de la tête sert de référence.
2. Pour faire de chaque 8^e broche sur la headbox une référence, mettez à jour les paramètres du logiciel d’acquisition, onglet acquisition, de sorte que l’électrode de référence soit "Indépendante" (c’est-à-dire en mode recherche).
   REMARQUE: Cela permet d’enregistrer jusqu’à 7 animaux simultanément, chacun avec 7 électrodes plus une électrode de référence dédiée et une électrode de masse, le tout via un amplificateur, un numériseur et un ordinateur. Toutes les électrodes sont acquises en tant que canaux unipolaires et comparées à la référence (centre de la tête.) Des configurations/montages de plomb bipolaires et augmentés supplémentaires peuvent être configurés pendant ou après l’enregistrement. Comme la configuration a la capacité d’enregistrer simultanément à partir de plusieurs animaux, une électrode de masse de chaque animal est connectée en parallèle à l’entrée de masse sur l’amplificateur(Figure 2).
3. Retirez les lapins de leur cage et pesez-les pour calculer la dose de médicament appropriée pour chaque animal. Placez les lapins dans un transporteur et amenez-les dans une pièce séparée afin de minimiser le stress pour les animaux non expérimentaux. Dans cette étude, des lapins blancs de Nouvelle-Zélande mâles et femelles et leur progéniture ultérieure ont été utilisés. Des expériences ont été réalisées sur des lapins > 1 mois. Au moment de l’expérience, ces lapins pesaient entre 0,47 et 5,00 kg.
   REMARQUE: Étant donné que les lapins doivent être dans la même pièce et en vue de la caméra, n’isolez pas complètement les lapins. Il existe un risque de manifestations visuelles et auditives d’un lapin stressant un autre lapin. Par conséquent, il est idéal d’avoir un lapin dans la pièce à la fois, ce qui est fait pour les expériences de stimulation photique. Pour toutes les autres expériences, les lapins sont espacés autant que possible, tout en les gardant tous sous la vue de la caméra vidéo. Idéalement, des barrières sont utilisées ou un seul animal est étudié à la fois. Ce n’était pas un facteur de confusion majeur car la fréquence cardiaquedes lapins est restée assez stable pendant les expériences et il y avait la présence fréquente de fuseaux de sommeil. Les enregistrements de plusieurs animaux garantissent simultanément que les données sur les animaux témoins et d’essai sont acquises dans les mêmes conditions environnementales.

2. Implantation d’électrodes EEG-ECG et fixation de moniteurs respiratoires

1. Retirez un lapin du transporteur et placez-le sur les genoux d’un enquêteur assis.
2. Tenez le lapin verticalement et gardez-le près du corpsde l’enquêteur.
3. Abaissez le lapin en décubitus dorsal, avec la têtedulapin aux genoux del’enquêteur,et la têtedulapin plus bas que le reste de son corps.
   REMARQUE: Cette manœuvre détend l’animal et minimise la probabilité qu’il essaie de se déplacer ou de s’échapper tout en plaçant les électrodes.
4. Maintenant que le lapin est fixé en décubitus dorsal, demandez à un deuxième investigateur de répandre la fourrure jusqu’à ce que la peau puisse être identifiée et isolée du tissu sous-jacent.
5. Insérer des électrodes pliée à 35° par voie subdermique dans chaque aisselle(figure 3A).
   REMARQUE: Les électrodes doivent être poussées à travers de sorte qu’elles soient solidement accrochées à la peau, mais ne pénètrent pas dans des structures plus profondes. Le fait que l’électrode entre puis sorte de la peau (à travers et à travers) réduit le risque que les fils se délogent lors du placement du lapin dans le dispositif de retenue ou s’il se déplace pendant l’expérience(figure 3B). Toutes les électrodes sont stérilisé avec de l’éthanol à 70% avant la mise en place.
6. Placer les fils sur la poitrine postérieure aux membres antérieurs droit et gauche et sur l’abdomen antérieur au membre postérieur gauche. Placer une électrode à goupille de masse antérieure au membre postérieur droit sur l’abdomen(figure 4A).
7. Une fois que tous les fils d’ECG sont correctement placés, ramenez le lapin en position couchée, les fils s’élevant d’un côté de l’abdomen du lapin, et transférez le lapin dans un dispositif de retenue de taille appropriée (p. ex. 6 po x 18 po x 6 po).  Lorsque vous placez le lapin dans le dispositif de retenue, tirez le fil lâche vers le haut pour empêcher le lapin de retirer les électrodes avec ses pattes. Collez les fils sur le côté du dispositif de retenue afin qu’ils ne soient pas pris sous le lapin pendant l’expérience(figure 4B).
8. Fixez le lapin dans le dispositif de retenue en abaissant le dispositif de retenue autour du cou et en le verrouillant en place. De plus, déplacez les membres postérieurs sous l’animal et fixez le dispositif de retenue arrière.
   REMARQUE: On devrait être capable d’installer 1-2 doigts dans l’espace sous le cou pour s’assurer qu’il n’est pas trop serré. En particulier lors d’expériences où il peut y avoir un mouvement moteur, il est important de resserrer la retenue pour minimiser les mouvements, les blessures potentielles à la colonne vertébrale, la luxation des membres et la capacité de chasser le dispositif de retenue arrière(figure 4B). Les lapins ont été maintenus dans le dispositif de retenue pendant environ 5 h sans aucun problème lié à un mouvement accru ou à des signes de déshydratation.
   1. Pour les petits lapins (p. ex., moins de 2 mois), placez un tampon d’appoint en caoutchouc sous l’animal pour élever le lapin, ce qui empêche le lapin de reposer son cou sur le bas de l’appuie-tête(figure 4C).
      REMARQUE: Une baisse soudaine de la fréquence respiratoire et cardiaque peut être secondaire à l’impact du cou. Si cela se produit, desserrez le dispositif de retenue du cou et soulevez la têtedulapin pour soulager toute compression du cou.
   2. Lorsque le dispositif de retenue arrière ne trace pas de près le dos ou la colonne vertébrale du lapin, placez une entretoise en PVC pour empêcher tout mouvement qui pourrait causer des lésions de la colonne vertébrale.
      REMARQUE: Par exemple, un tuyau en PVC d’environ 14 cm de long x 4 po de diamètre intérieur, avec les 25 à 33 % inférieurs enlevés, peut être placé sur le lapin avec de la mousse pour fournir une retenue appropriée(figure 4C).
9. Maintenant que le lapin est solidement placé dans le dispositif de retenue, insérez les électrodes droites sous-cutanées de 7 à 13 mm dans le cuir chevelu(figure 3A). En utilisant une approche d’angle d’entrée de 45°, exécutez les fils entre les oreilles et attachez lâchement les fils au dispositif de retenue derrière la tête pour maintenir le placement du plomb. Placez 5 pistes EEG dans les positions suivantes : antérieure droite, antérieure gauche, occipitale droite, occipitale gauche et une piste de référence centrale (Cz) au point entre les 4 autres pistes(figure 4D).
   REMARQUE: Les électrodes sont correctement placées lorsqu’elles sont positionnées dans le tissu sous-cutané contre le crâne. Ce placement minimise l’artefact du nez, des oreilles et d’autres muscles environnants. Certains artefacts du mouvement rythmique du nez sont inévitables. Les fils EEG antérieurs doivent être placés médial sur les yeux du lapin et pointés versl’avant. Les fils occipitaux doivent être placés antérieurement aux oreilles et pointeront dans la direction médiale. Cz est placé au centre du haut de la tête en un point qui se trouve entre les 4 électrodes (à mi-chemin entre Lambda et Bregma, le long de la ligne de suture). La broche de l’électrode Cz pointe vers l’avant.
   1. Passez les fils EEG entre les oreilles, pour éviter que le lapin n’essaie de mordre les fils.
10. Fixez le pléthysmographe de l’oxymètre de pouls à l’oreille du lapin sur la veine marginale de l’oreille.
    REMARQUE: Il peut être nécessaire de raser l’excès de cheveux de l’oreille pour améliorer le signal ou d’utiliser de la gaze pour maintenir le capteur en place.
    1. Assurez-vous que la fréquence cardiaque sur la pléthysmographie est en corrélation avec la fréquence cardiaque de l’ECG et que la saturation en oxygène est affichée(Figure 5C).
11. Placez délicatement le masque facial avec un tube de capnographie sur la bouche et le nez du lapin (Figure 4H). Fixez le masque facial avec une ficelle enroulée autour du masque et fixez les deux extrémités de la ficelle au dispositif de retenue. Fixez l’autre extrémité du tube de capnographie au moniteur des signes vitaux.
    REMARQUE: Il est important d’empêcher la ficelle de poser sur les yeux du lapin pendant l’expérience. Pour ce faire, collez la ficelle au milieu du dispositif de retenue entre les oreilles du lapin. Afin d’améliorer le signal de capnographie, créez une vanne à sens unique à l’aide de ruban adhésif et d’un mince morceau de nitrile qui permettra à l’oxygène de pénétrer dans la pièce en T et dirigera le CO2 expiré dans le tube de capnographie(figure 4I).

3. Enregistrement de la vidéo-EEG-ECG

1. Effectuez un enregistrement vidéo-EEG-ECG à l’aide d’un logiciel EEG disponible dans le commerce.
   REMARQUE: Les fils biopotentiels et la vidéo sont verrouillés dans le temps pour corréler plus tard les signaux électriques et vidéo (par exemple, le pic EEG avec une secousse myoclonique).
2. Confirmez une connectivité optimale, sans dérive de base, sans bruit électrique de 60 Hz et avec un rapport signal/bruit élevé. Plus précisément, assurez-vous que chaque phase de la forme d’onde cardiaque peut être visualisée sur l’ECG et que les ondes delta, thêta et alpha ne sont pas visuellement obscurcies par le bruit à haute fréquence sur l’EEG.
   1. Si toutes les électrodes produisent des quantités excessives de bruit, ajustez le fil de référence central. Si une seule électrode est excessivement bruyante, poussez cette électrode plus profondément dans la peau ou repositionnez-la jusqu’à ce qu’il n’y ait pas de métal exposé.
3. Ajustez la vidéo afin que tous les lapins puissent être vus simultanément, ce qui permet la corrélation de l’activité motrice avec les résultats de l’EEG (Figure 5A).
   REMARQUE: Le système prend en charge les enregistrements simultanés EEG / ECG / oxymétrie / capnographie de jusqu’à 7 lapins.
4. Commencez l’enregistrement de base de chaque animal pendant un minimum de 10-20 min ou jusqu’à ce que la fréquence cardiaque se stabilise à un état calme et détendu (200-250 bpm) et que les lapins ne présentent pas de grands mouvements pendant au moins 5 min. Acquérir des données électrographiques à bande passante complète sans aucun filtre. Afin de mieux visualiser les données, définissez le filtre basse fréquence (= filtre passe-haut) à 1 Hz et le filtre haute fréquence (= filtre passe-bas) à 59 Hz.
   REMARQUE: Un autre signe que le lapin est détendu est l’apparition des fuseaux de sommeil EEG (discuté plus tard).
5. Ajouter des notes verrouillées pendant l’expérience en temps réel pour indiquer le moment des interventions (p. ex. administration de médicaments) et des événements neuro-cardiaques (p. ex. pic d’EEG, convulsions motrices, battements ectopiques et arythmies), ainsi que des artefacts moteurs/investigateurs.
   NOTA : En raison de la fréquence à laquelle l’investigateur doit appliquer une intervention (p. ex. stimulation photique, administration de médicaments), afin de minimiser le stress d’un investigateur entrant et sortant de la pièce et ouvrant/fermant la porte, l’investigateur reste du côté opposé de la pièce tout au long de l’expérience. L’enquêteur s’assoit le plus loin possible de l’animal et reste immobile et silencieux afin de minimiser les risques de dérangement des animaux.

4. Protocoles expérimentaux

REMARQUE : Chacune des expériences suivantes est effectuée à des jours distincts si elle est effectuée sur le même animal. Il y a un délai de 2 semaines entre les études de médicaments composés de tests oraux et l’étude de médicaments proconvulsants terminaux aigus. Si nécessaire, l’expérience de stimulation photique est réalisée, suivie d’une attente de 30 minutes, puis de l’étude du médicament PTZ.

1. Pour permettre aux lapins de s’acclimater dans les soigneurs et pour que l’investigateur confirme objectivement la stabilisation des taux cardiorespiratoires, instrumentez tous les lapins avec les capteurs cardiorespiratoires et neuronaux et effectuez une surveillance vidéo continue pendant > 1 heure, 1 à 3 fois par animal.
2. Expérience de stimulation photique
   1. En plus de la méthode décrite ci-dessus, placez une source lumineuse avec un réflecteur circulaire de 30 cm devant le lapin au niveau des yeux, avec l’intensité du flash réglée au maximum (16 candela)²⁹. La source lumineuse est indiquée par un point blanc à la figure 4E.
      REMARQUE: Une pièce faiblement éclairée doit être utilisée pour obtenir la réponse photosensible³⁷.
   2. Comme les yeuxdulapin sont sur le côté de la tête au lieu de l’avant de sa tête (comme chezl’homme),placez 2 miroirs de chaque côté du lapin, et 1 derrière le lapin afin que la lumière pénètre dans les yeux du lapin.
      REMARQUE: Un miroir plat de ≥ 20 cm de haut,d'≥120 cm de long crée une enceinte triangulaire autour du lapin pour s’assurer que la lumière clignotante pénètre dans les yeux du lapin, comme on le voit à la figure 4E.
   3. Connectez la source lumineuse à un contrôleur qui a une vitesse, une intensité et une durée réglables.
   4. Enregistrez des vidéos à l’aide d’une caméra avec une lumière rouge et des capacités d’enregistrement infrarouge.
   5. Exposer les lapins à chaque fréquence pendant 30 s avec leurs yeux ouverts, puis 30 s de plus avec un masque chirurgical couvrant leur visage pour simuler ou provoquer la fermeture des yeux à chaque fréquence.
      REMARQUE: Des études antérieures ont montré que la fermeture des yeux est la manœuvre la plus provocante pour obtenir la photosensibilité à la saisie^29. De plus, 10% des patients photosensibles ne présentent que des signes électroencéphalographiques alors que leurs yeux sont fermés²⁹. Une saisie peut être identifiée médicalement en observant la présence des secousses myocloniques de tête et de corps entier, du clonus, ou d’un état tonique. L’enregistrement d’EEG est plus complètement analysé pour la corrélation electroencephalographic (par exemple, pointes, poly-pointes, et décharges rythmiques) avec des manifestations de moteur pour un diagnostic définitif d’activité de saisie. Des mouvements dans lesquels l’EEG est obscurci par l’objet façonné de muscle ou les vagues de l’epileptogenicity indéterminant devraient être passés en revue par un épileptologue pour la confirmation.
   6. Augmentez la fréquence du stimulateur photique de 1 Hz à 25 Hz par incréments de 2 Hz. Ensuite, effectuez le même protocole de photostimulation, mais diminuez cette fois la fréquence de 60 Hz à 25 Hz par incréments de 5 Hz.
      REMARQUE: Si un lapin a une crise, l’expérience doit être arrêtée. Continuez à surveiller le lapin pendant 30 min. Ensuite, retournez le lapin dans la salle de logement et surveillez toutes les 1 h pendant 3 h pour une récupération complète. Cependant, si la stimulation photique induit une réponse photoparoxysmale, alors le reste des fréquences ascendantes sont sautées et la série est recommencée en descendant de 60 Hz jusqu’à ce qu’une autre réponse photoparoxysmale se produise. Cela permettra de déterminer les seuils supérieurs et inférieurs de stimulation photique. Aucun délai n’est nécessaire car la réponse photoparoxysmale cessera après l’arrêt de la stimulation photique. S’il n’est pas clair si une réponse photoparoxystique s’est produite, la fréquence est répétée après un retard de 10 s³⁸.
   7. Une fois l’expérience terminée, retirez les fils eEG et ECG du lapin et retournez-le dans sa cage d’origine pour des soins de routine par le personnel d’élevage.
3. Administration orale de médicaments
   1. Comme de nombreux médicaments sont pris par voie orale, préparez des composés oraux en les mélangeant avec de la sauce aux pommes de qualité alimentaire. Mélanger 0,3 mg/kg d’E-4031 dans 3 mL de sauce aux pommes et charger dans une seringue orale/d’irrigation de 3 mL sans aiguille.
      REMARQUE: Plusieurs médicaments peuvent être administrés de cette manière, y compris les composés d’essai, les médicaments connus pour modifier la durée du QT (moxifloxacine ou E-4031), et un témoin ou un véhicule négatif. Certains médicaments ne sont pas disponibles dans une formulation intraveineuse. De plus, de nombreux médicaments sont prescrits dans une formulation orale et, par conséquent, une administration intraveineuse peut avoir moins de pertinence clinique.
   2. Soulevez les lèvres supérieures et glissez le bout de la seringue buccale sur le côté de la bouche du lapin, quin’estpas obstrué par les dents du lapin, et injectez tous les médicaments et la sauce aux pommes dans la bouchedulapin.
   3. Continuez l’enregistrement vidéo-EEG-ECG pendant 2 h, puis retournez l’animal dans sa cage d’origine pour des soins de routine.
   4. Le jour expérimental 2 et 3, connectez le lapin à la vidéo-EEG-ECG, enregistrez 10-20 minutes de ligne de base, puis injectez le même médicament et enregistrez pendant 2 h.
   5. Après 1 semaine d’affouillement, effectuez 10-20 minutes de ligne de base, puis donnez à chaque lapin une dose unique de placebo pendant 3 jours consécutifs et enregistrez pendant 2 h.
      REMARQUE : L’administration de médicaments oraux peut être conçue comme une étude croisée, dans laquelle le placebo est administré au cours de la semaine 1 et le médicament au cours de la semaine 2.
4. Expérience médicamenteuse intraveineuse (Pentylenetetrazol, PTZ)
   1. Afin de visualiser la veine marginale de l’oreille, rasez la surface postérieure del’oreilledu lapin. Utilisez une lingette à l’éthanol à 70 % pour désinfecter le site et dilater la veine marginale de l’oreille. Ceci est indiqué par l’ovale pointillé noir de la figure 4F.
   2. À ce stade, demandez à un expérimentateurdecouvrir le visage du lapin avec sa main afin de diminuer le stress de la procédure pour le lapin. Un deuxième expérimentateur canule soigneusement la veine marginale d’oreille avec un angiocathéter stérile de 25 G.
   3. Une fois que le cathéter est dans la veine, placez un bouchon d’injection stérile à l’extrémité du cathéter afin qu’une aiguille puisse introduire des médicaments par voie intraveineuse. L’emplacement du bouchon d’injection est indiqué par un cercle bleu sur la figure 4G.
   4. Faites une attelle en enveloppant de la gaze de 4 x 4 pouces avec du ruban adhésif afin qu’elle forme une forme de tube et en la plaçant à l’intérieur del’oreilledu lapin. Ensuite, collez l’attelle sur l’oreille afin que le cathéter soit fixé en place et reste debout, comme l’oreille non cathétérisée.
   5. Injecter 1 mL de 10 unités USP par mL de solution saline héparinisée.
      REMARQUE: Le cathéter et le vaisseau doivent être visiblement débr omgés de l’air et rester brevetés. Si le cathéter n’est pas dans le vaisseau, la seringue ne poussera pas facilement et il y aura une accumulation de solution saline dans le tissu sous-cutané.
   6. Donnez aux lapins des doses supplémentaires de PTZ par voie intraveineuse de 1 mg/kg à 10 mg/kg par incréments de 1 mg/kg toutes les 10 minutes. Prenez note au début de chaque dose pour indiquer quel animal est injecté et la concentration du médicament.
      NOTA : Cela permet d’évaluer les effets aigus et additifs de l’administration de PTZ. Alternativement, pour évaluer davantage les effets chroniques de la faible dose de PTZ, le lapin reçoit des doses répétées à chaque faible concentration, 7 doses à 2 mg/kg, 3 doses à 5 mg/kg, puis 3 doses à 10 mg/kg, chaque dose est séparée par 10 min.
   7. Après chaque dose, surveillez attentivement la vidéo-EEG-ECG-capnographie-oxymétrie pour toute anomalie électrique et respiratoire neuro-cardiaque et preuve visuelle de l’activité épileptiforme. Notez ces changements en temps réel et pendant la post-analyse.
      REMARQUE: L’activité de saisie commence souvent dans les 60 s suivant l’administration de PTZ.

5.Conclusion des expériences de non-survie.

1. Si le lapin n’a pas connu de mort subite au cours de l’expérience PTZ, administrer 1 ml de 390 mg/mL de pentobarbital de sodium pour chaque 4,54 kg de poids corporel (ou 1,5 mL à tous les lapins), suivi d’une chasse d’eau saline normale de 1 mL. Surveillez l’ECG pour vous assurer que le lapin subit un arrêt cardiaque.
2. Une fois que le lapin subit un arrêt cardiaque, effectuez rapidement une nécropsie pour isoler fraîchement divers organes, y compris le cœur, les poumons, le foie, le cerveau, le muscle squelettique et tout autre tissu nécessaire aux analyses moléculaires / biochimiques ultérieures.
3. Disposer du lapin selon les politiques institutionnelles.

6. Analyse de l’ECG

1. Utiliser un logiciel d’analyse d’ECG disponible dans le commerce pour inspecter visuellement l’ECG et pour identifier les périodes de tachycardie, de bradycardie, de battements ectopiques et d’autres arythmies (Figure 6). Pour réduire la quantité de données à examiner, créez un tachygraphe, qui augmentera la facilité avec laquelle les périodes de tachycardie, de bradycardie ou d’irrégularités de l’intervalle RR peuvent être identifiées.
   REMARQUE : Les anomalies de l’ECG (p. ex., prolongation de l’intervalle QT_c) et les arythmies sont identifiées manuellement en examinant l’ECG pour les anomalies du taux (p. ex., brady-/tachy-arythmies), du rythme (p. ex., complexes auriculaires/ventriculaires prématurés), de la conduction (p. ex., bloc atrio-ventriculaire) et de la forme d’onde (p. ex., tachycardie auriculaire/ventriculaire non sinusale et fibrillation).) Les arythmies peuvent être détectées en examinant le tachygraphe pour des irrégularités dans l’intervalle RR. La tachycardie peut être identifiée par des sections du tachygraphe dans lesquelles la fréquence cardiaque est supérieure à 300 battements par minute. La bradycardie est identifiée lorsque la fréquence cardiaque est inférieure à 120 battements par minute sur le tachygraphe.
2. À l’aide d’un logiciel d’analyse d’ECG disponible dans le commerce, effectuer des mesures d’ECG standard (fréquence cardiaque, intervalles de cycle cardiaque) au départ et lors de la provocation (p. ex. manipulation de l’animal par l’enquêteur, administration d’agents d’essai et changements d’ECG induits par les crises).

7. Analyse de la vidéo-EEG

1. Faites défiler visuellement la vidéo et le traçage EEG à l’aide d’un logiciel disponible dans le commerce pour identifier le signal de base(Figure 7)et la présence de décharges EEG attendues telles que des fuseaux de sommeil(Figure 8)et des ondes de sommet(Figure 9).
   REMARQUE: Bien que les données électrographiques à bande passante complète soient acquises sans aucun filtre, les données doivent être affichées avec le filtre basse fréquence (c’est-à-dire le filtre passe-haut) réglé à 1 Hz, et basé sur le théorèmedeNyquist, le filtre haute fréquence (c’est-à-dire le filtre passe-bas) est réglé à 120 Hz pour éviter de manquer tout signal. Les filtres peuvent être ajustés pour permettre une meilleure visualisation et une meilleure réduction du bruit (p. ex., 1-59 Hz) lors de l’examen de l’activité EEG de fréquence inférieure (<25 Hz).
2. En plus des formes d’onde de capnographie, utilisez l’artefact de mouvement du nez sur l’EEG pour déterminer la présence par rapport à l’absence de respiration. Cela peut également être corrélé avec les mouvements du nez vus sur l’enregistrement vidéo.
3. Faites défiler visuellement la vidéo et le traçage EEG à l’aide d’un logiciel disponible dans le commerce pour distinguer les mouvements épileptiques des mouvements non épileptiques (p. ex. conscients) pendant au moins 1 minute après chaque dose de PTZ(figure 10). Scan pour les décharges épileptiques interictal et pour des changements d’EEG avant, pendant, et après des saisies. Une saisie peut être identifiée médicalement en observant la présence des secousses myocloniques de tête et de corps entier, du clonus, ou d’un état tonique avec un corrélat d’EEG. Les changements d’EEG peuvent inclure des pointes d’EEG, des poly-pointes, et des décharges rythmiques.
   REMARQUE: Les mouvements dans lesquels l’EEG est obscurci par l’artefact de muscle ou les vagues de l’epileptogenicity indéterminant devraient être passés en revue par un neurologue pour confirmation. Il peut être avantageux de concentrer la vidéo sur un lapin pour voir de plus près son comportement, ainsi que ses enregistrements EEG et ECG (Figure 5B).
4. Noter le video-EEG pour les crises en fonction du type et de la gravité des manifestations motrices, qui se produisent généralement dans les 1 min suivant l’injection de PTZ(tableau 1).
5. Après une expérience de stimulation photique, analyser les fils occipitaux de l’EEG pour la présence et l’absence du rythme de conduite occipital en créant un tracé d’analyse spectrale dans le logiciel d’analyse EEG disponible dans le commerce. Le rythme de conduite occipital va créer un pic dans l’analyse spectrale qui correspond à la fréquence du stimulateur photique (Figure 11).
   REMARQUE: La stimulation photique peut produire des pics de fréquence harmonique en plus du pic de la fréquence fondamentale.

7. Analyse de la fonction respiratoire

1. Passez en revue les résultats du moniteur des signes vitaux (Figure 4I) et exportez le signal pour une analyse plus approfondie.
2. Notez le changement de schéma respiratoire pendant une crise et après une crise, en particulier le point de temps où l’apnée commence.

La méthode décrite ci-dessus est capable de détecter des anomalies dans le système de conduction électrique du cerveau et du cœur ainsi que des troubles respiratoires. Un logiciel d’acquisition de données est utilisé pour évaluer la morphologie de l’ECG et détecter toute fréquence cardiaque anormale, perturbation de conduction ou rythmes de l’ECG (battements ectopiques auriculaires/ventriculaires et arythmies brady/tachy) (Figure 6). En plus de visualiser la morphologie d’ECG, les traces sont analysées pour quantifier l’intervalle RR, la fréquence cardiaque, l’intervalle de PR, la durée de P, l’intervalle qrs, l’intervalle de QT, le QTc, l’intervalle de JT, et_{l’intervalle de crête} de T à_fin de T. L’analyse de ces données prouve que tachy-/brady-arythmies sont aisément détectées.

En plus d’analyser les données ECG, les données EEG sont également analysées. L’EEG de base a été recueilli et analysé à l’aide d’une analyse spectrale(figure 7). Ces données montrent que les fils occipitaux ont une amplitude plus élevée que les fils frontaux et que la fréquence dominante dans tous les fils est dans la plage delta. Il est important de pouvoir enregistrer les EEG de lapins avec un rapport signal/bruit élevé pour détecter les décharges épileptiformes et effectuer une analyse plus approfondie de l’enregistrement. Les ondes qui ont une morphologie et une fréquence similaires aux fuseaux de sommeil humains sont représentées à la figure 8. Les ondes de sommet provenant du centre de la tête sont représentées à la figure 9. En plus des changements normaux de l’EEG, divers mouvements conscients non épileptiques du lapin au cours des enregistrements de base sont également notés afin de les distinguer des décharges épileptiformes (Figure 10). Des enregistrements vidéo-EEG des mouvements montrés, ainsi que d’autres, sont disponibles dans le film supplémentaire 1-11.

Plusieurs méthodes ont été mises en application pour tenter d’induire des saisies. La première méthode utilisait une stimulation photique à 1-60 Hz avec les yeux ouverts et fermés(figure 4E). Parce que la position des yeux sur le lapin est latérale plutôt qu’antérieure comme les humains, des miroirs sont utilisés pour diriger la lumière dans les yeux du lapin à l’aide d’une seule source de lumière. L’analyse de l’EEG de l’expérience de stimulation photique à 3 Hz montre une forte réponse de conduite occipitale à la fréquence attendue de 3 Hz (Figure 11). En plus de la stimulation photique, les lapins reçoivent une injection de pentylenetetrazole (PTZ, bloqueur de GABA_A) via un cathéter dans la veine marginale de l’oreille gauche (Figure 4G). L’injection de PTZ cause des divers degrés d’activité de saisie dans un délai de 1 minute et est associée aux formes d’onde distinctes d’EEG. Quelques formes d’onde représentatives, qui comprennent des sursauts thêta, des sursauts thêta de grande amplitude, des ondes polyspike, des ondes polyspike basse tension, des sursauts gamma rythmiques et un silence électrocérébral (ECS) sont représentées à la figure 12, à la figure 13, à la figure 14, à la figure 15, à la figure 16, à la figure 17.

Afin d’identifier une saisie, plusieurs critères sont utilisés. Le vidéo est passé en revue pour identifier toutes les manifestations possibles de moteur de saisie. Puis pour confirmer que l’activité motrice était le résultat de l’activité épileptique, le signal d’EEG est évalué pour une pointe temporellement corrélée d’EEG, un polyspike, une onde pointue, ou une décharge rythmique. En cas de doute, le video-EEG est passé en revue par un deuxième investigateur et/ou un épileptologue pour la vérification. Le début de saisie sont définis comme le premier exemple des décharges rythmiques d’EEG (début de saisie d’EEG) et de l’activité motrice (début clinique de saisie). On observe l’EEG et la saisie clinique lorsque l’on observe le cessation des pointes rythmiques d’EEG et de l’activité motrice. En plus de diverses morphologies de vague d’EEG, les lapins ont progressé par des saisies de moteur de plus en plus généralisées et de plus en plus prolongées. Une échelle de saisie a été créée parce que ni l’échelle de saisie racine, ni ses versions modifiées, n’étaient applicables aux lapins retenus(tableau 1). Des vidéos de l’activité de saisie motrice représentative sont montrées dans le film supplémentaire 17, le film supplémentaire 18, le film supplémentaire 19, le film supplémentaire 20, le film supplémentaire 21, le film supplémentaire 22.

La méthode présentée ici est également capable de déterminer la cascade multi-systèmes d’événements qui précèdent la mort subite médiée par la crise (Figure 18). Diverses pathologies comprennent: silence électrocérébral (ECS), arrêt respiratoire (apnée), brady-/tachy-arythmies, et arrêt cardiaque (asystolie.) Pendant les expériences, un lapin a éprouvé la mort subite après avoir eu une saisie pharmacologiquement induite. Chez ce lapin, il y avait une séquence qui a commencé par l’arrêt respiratoire, puis l’ECS, le bloc auriculo-ventriculaire, plusieurs tachyarythmies non soutenues, la bradycardie, et finalement l’asystolie.

Figure 1: Vue d’ensemble du protocole expérimental. Afin de fournir une vue d’ensemble des principales étapes de ce protocole, une figure a été créée. Cette figure indique que l’appareil de contrôle doit être préparé, puis connecté l’appareil au lapin et garantissant l’observation d’un signal de haute qualité. Après cette étape, l’expérience prévue peut être réalisée, des organes peuvent être obtenus et les données vidéo-EEG-ECG-capnographie-oxymétrie peuvent être analysées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: Equipement expérimental. Schéma de la configuration expérimentale, qui comprend un ordinateur, une lumière infrarouge, un microphone, une caméra vidéo, un moniteur de signes vitaux, une boîte de tête à 64 broches, un amplificateur, un numériseur, 8 électrodes (5 EEG, 3 ECG) + terre pour chaque animal connecté à la boîte à tête. Les fils sont codés par couleur selon les éléments suivants: 4 EEG bleu, 1 référence EEG noire, 3 ECG rouge, 1 sol vert. La boîte de contention qui contient les lapins n’est pas montrée. Cette configuration permet d’enregistrer jusqu’à 7 lapins simultanément. La ligne jaune représente le tube de capnographie et relie le masque facial au moniteur des signes vitaux. La ligne bleue représente le fil d’oxymétrie qui est connecté au moniteur des signes vitaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: Image des électrodes EEG et ECG. (A)Électrodes ECG pliants et électrodes EEG droites. (B) Comment accrocher l’électrode ECG dans le tissu sous-cutané du lapin, de sorte qu’il soit à travers et à travers. Abréviations (LL: Membre gauche, RA: Bras droit, RL: Membre droit, LA: Bras gauche, RF: Frontal droit, LF: Frontal gauche, Cz: Centre, RO: Occipital droit, LO: Occipital gauche). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4: Lapin connecté à l’équipement. (A)Emplacement des électrodes ECG, bras gauche est indiqué par un point jaune. Le bras droit est indiqué par un point blanc. La jambe gauche est indiquée par un point rouge. Le sol antérieur à la jambe droite est indiqué par un point vert. (B) Lapin en retenue avec électrodes ECG et EEG attachées. (C) Lapin juvénile dans un dispositif de contention avec les modifications appropriées pour accueillir un lapin plus petit, y compris un booster sous le lapin, de la mousse de cou et un tuyau en PVC coupé. (D) Lapin en retenue avec emplacement des électrodes EEG. Frontal droit est indiqué par un point orange. Frontal gauche est indiqué par un point rouge. Occipital droit est indiqué par un point jaune. Occipital gauche est indiqué par un point bleu. La référence est indiquée par un point noir. (E) Lapin en restrainer avec stimulateur photique et configuration de cabine miroir. La source lumineuse est indiquée par un point blanc. (F) Veine marginale de l’oreille après que l’oreille du lapin a été rasée et essuyée avec de l’alcool. (G) Lapin avec angiocathéter solidement collé dans la veine marginale gauche de l’oreille. Le site du bouchon d’injection est indiqué par un point bleu. (H) Lapin avec masque facial fixé au tube de capnographie par un T-piece qui contient une valve unidirectionnelle. (I) Schéma du masque facial et de la pièce en T reliés au tube de capnographie. Pendant l’inspiration, l’air de la pièce est capable d’entrer dans le T-piece par une vanne à sens unique (flèche verte). Pendant l’expiration, le CO₂ quitte la pièce en T en entrant dans le tube de capnographie (flèche jaune). En raison de la faible quantité d’espace mort, très peu de CO₂ est retenu dans la pièce en T et est généralement inférieur à 5 mmHg. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5: Vidéo-EEG-ECG-Capnographie-Oxymétrie simultanéede lapin. (A)Enregistrement vidéo-EEG-ECG simultané de 3 lapins. (B) Zoom en vue de l’enregistrement vidéo-EEG-ECG simultané de Rabbit #2. (LL : Membre gauche, RA : Bras droit, LA : Bras gauche) (C) Enregistrement simultané de la capnographie (jaune) et de la pléthysmographie (bleu). Des mesures montrant le CO 2 inspiré, le CO₂de marée_finale,la fréquence respiratoire, la fréquence du pouls et l’oxymétrie de pouls sont incluses dans la figure. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6: ECG de lapin. (A) ECG de base. Les fils sont montrés dans la configuration de plomb du membre plan frontal bipolaire standard et dans la configuration unipolaire (RA: bras droit, LL: membre gauche, LA: bras gauche) avec le plomb Cz sur la tête comme référence. (B) Complexes ventriculaires prématurés. (C) Bradycardie sinusale. (D) Tachycardie sinusale. (E) Traçage ECG de lapin de base avec début d’onde P, pic d’onde P, fin d’onde P, début d’onde QRS, pic d’onde QRS, fin d’onde QRS, hauteur du segment ST, pic d’onde T, extrémité d’onde T étiquetée. (F) mesures ECG. Toutes les mesures sont en millisecondes, à l’exception de la fréquence cardiaque, qui est en battements par minute. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7: EEG de base et analyse spectrale. (A)Traçage EEG au cours de l’enregistrement de base. (B) L’analyse spectrale de l’EEG montre que l’activité des ondes delta est la fréquence dominante dans tous les fils. Delta (δ: jusqu’à 4 Hz) Ondes thêta (θ: 4-8 Hz) Ondes Alpha (α: 8 -15 Hz) Ondes bêta (β: 15-32 Hz) ondes Gamma (γ: ≥ 32 Hz). L’axe Y est log power spectral density 10*log₁₀(μV²/Hz). Les données électrographiques à bande passante complète ont été acquises sans aucun filtre, mais les données ont été affichées avec un filtre basse fréquence (= filtre passe-haut) réglé à 1 Hz et un filtre haute fréquence (= filtre passe-bas) réglé à 120 Hz. Les enregistrements vidéo-EEG-ECG sont présentés dans les films supplémentaires 1 et 2. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 8: Traçage EEG de la broche de sommeil et analyse spectrale. (A) Traçage de l’EEG pendant les fuseaux de sommeil. (B) L’analyse spectrale de l’EEG montre la présence d’une onde supplémentaire à 12-15 Hz, qui est similaire à la fréquence associée aux fuseaux de sommeil chez l’homme. Delta (δ: jusqu’à 4 Hz) Ondes thêta (θ: 4-8 Hz) Ondes Alpha (α: 8 -15 Hz) Ondes bêta (β: 15-32 Hz) ondes Gamma (γ: ≥ 32 Hz). L’axe Y est log power spectral density 10*log₁₀(μV²/Hz). (C) Les montages multiples d’EEG d’un fuseau de sommeil démontrent qu’ils résultent du centre de la tête (Cz), qui est compatible avec des résultats humains. Les données électrographiques à bande passante complète ont été acquises sans aucun filtre, mais les données ont été affichées avec un filtre basse fréquence (= filtre passe-haut) réglé à 1 Hz et un filtre haute fréquence (= filtre passe-bas) réglé à 59 Hz.Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 9: Traçage d’ondes de sommet et analyse spectrale. (A)Traçage EEG d’ondes de sommets multiples. (B) L’analyse spectrale des ondes de sommet ne montre pas de différence appréciable dans la fréquence des ondes de sommet. Bien que cela soit attendu parce que visuellement la fréquence est inférieure à 1 Hz. (C) Plusieurs montages EEG d’ondes de sommet montrent qu’ils résultent du centre de la tête, ce qui est compatible avec les résultats humains. Les données électrographiques à bande passante complète ont été acquises sans aucun filtre, mais les données ont été affichées avec un filtre basse fréquence (= filtre passe-haut) réglé à 1 Hz et un filtre haute fréquence (= filtre passe-bas) réglé à 59 Hz. L’axe Y est log power spectral density 10*log₁₀(μV²/Hz). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 10: Artefacts EEG causés par le mouvement du lapin. (A)EEG pendant la saccade de l’œil droit. (B) EEG pendant un clignotement de l’oeil gauche. (C) EEG pendant le mouvement rythmique du nez qui est associé à la présence de la respiration. (D) EEG pendant le mouvement de léchage. (E) EEG lors d’un épisode du lapin étendant la tête vers le bas. (F) EEG lors de mouvements conscients complexes de l’ensemble du corps. Vidéo-EEG de ces mouvements sont disponibles dans les films supplémentaires 3-11. Les données électrographiques à bande passante complète ont été acquises sans aucun filtre, mais les données ont été affichées avec un filtre basse fréquence (= filtre passe-haut) réglé à 1 Hz et un filtre haute fréquence (= filtre passe-bas) réglé à 59 Hz.Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 11: EEG lors de la stimulation photique. (A)Traçage de l’EEG lors d’une stimulation photique de 3 Hz avec les yeux ouverts du lapin. (B) Analyse spectrale de la stimulation photique de 3 Hz avec des pics à 3 Hz vus dans les fils occipitaux, mais pas les fils frontaux. Les données électrographiques à bande passante complète ont été acquises sans aucun filtre, mais les données ont été affichées avec un filtre basse fréquence (= filtre passe-haut) réglé à 1 Hz et un filtre haute fréquence (= filtre passe-bas) réglé à 59 Hz. L’axe Y est log power spectral density 10*log₁₀(μV²/Hz). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 12: Traçage EEG et analyse spectrale des sursauts thêta. Des rafales de thêta sont par intermittence vues dans toutes les pistes D’EEG. La fréquence de ces ondes est d’environ 4-6 Hz. Delta (δ: jusqu’à 4 Hz) Thêta (θ: 4-8 Hz) ondes Alpha (α: 8-15 Hz) ondes Bêta (β: 15-32 Hz) ondes Gamma (γ: ≥ 32 Hz) ondes. L’axe Y est log power spectral density 10*log₁₀(μV²/Hz). Les données électrographiques à bande passante complète ont été acquises sans aucun filtre, mais les données ont été affichées avec un filtre basse fréquence (= filtre passe-haut) réglé à 1 Hz et un filtre haute fréquence (= filtre passe-bas) réglé à 59 Hz. L’axe Y est log power spectral density 10*log₁₀(μV²/Hz). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 13: Traçage EEG et analyse spectrale des sursauts thêta de grande amplitude. Les sursauts thêta de grande amplitude sont similaires en apparence et en fréquence aux ondes thêta, mais avec une amplitude plus grande. Le changement rapide d’amplitude rend certaines de ces ondes plus nettes. Delta (δ: jusqu’à 4 Hz) Ondes thêta (θ: 4-8 Hz) Ondes Alpha (α: 8 -15 Hz) Ondes bêta (β: 15-32 Hz) ondes Gamma (γ: ≥ 32 Hz). L’axe Y est log power spectral density 10*log₁₀(μV²/Hz). Les données électrographiques à bande passante complète ont été acquises sans aucun filtre, mais les données ont été affichées avec un filtre basse fréquence (= filtre passe-haut) réglé à 1 Hz et un filtre haute fréquence (= filtre passe-bas) réglé à 59 Hz. L’axe Y est log power spectral density 10*log₁₀(μV²/Hz). L’enregistrement vidéo-EEG-ECG est montré dans le film supplémentaire 12. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 14: Traçage EEG et analyse spectrale des ondes polyspike. Les ondes polyspike sont observées par intermittence et simultanément dans tous les fils. Sur l’analyse spectrale, il existe plusieurs pics harmoniques avec une fréquence fondamentale autour de 6 Hz. Delta (δ: jusqu’à 4 Hz) Thêta (θ: 4-8 Hz) ondes Alpha (α: 8 -15 Hz) ondes Beta (β: 15-32 Hz) ondes Gamma (γ: ≥ 32 Hz) ondes. L’axe Y est log power spectral density 10*log₁₀(μV²/Hz). Les données électrographiques à bande passante complète ont été acquises sans aucun filtre, mais les données ont été affichées avec un filtre basse fréquence (= filtre passe-haut) réglé à 1 Hz et un filtre haute fréquence (= filtre passe-bas) réglé à 59 Hz. L’axe Y est log power spectral density 10*log₁₀(μV²/Hz). L’enregistrement vidéo-EEG-ECG est montré dans le film supplémentaire 13. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 15: Traçage EEG et analyse spectrale des ondes polyspike basse tension. Les ondes polyspike basse tension sont similaires aux ondes polyspike, mais ont une amplitude plus faible. L’analyse spectrale est similaire à celle des polyspikes. Delta (δ: jusqu’à 4 Hz) Ondes thêta (θ: 4-8 Hz) Ondes Alpha (α: 8 -15 Hz) Ondes bêta (β: 15-32 Hz) ondes Gamma (γ: ≥ 32 Hz). L’axe Y est log power spectral density 10*log₁₀(μV²/Hz). Les données électrographiques à bande passante complète ont été acquises sans aucun filtre, mais les données ont été affichées avec un filtre basse fréquence (= filtre passe-haut) réglé à 1 Hz et un filtre haute fréquence (= filtre passe-bas) réglé à 59 Hz. L’axe Y est log power spectral density 10*log₁₀(μV²/Hz). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 16: Traçage EEG et analyse spectrale des sursauts gamma rythmiques. Des sursauts gamma rythmiques dans un modèle de rafale sont vus le plus clairement dans les fils antérieurs. Sur l’analyse de fréquence il y a un pic supplémentaire vu autour de 50-55 Hz dans les fils antérieurs. Delta (δ: jusqu’à 4 Hz) Ondes thêta (θ: 4-8 Hz) Ondes Alpha (α: 8 -15 Hz) Ondes bêta (β: 15-32 Hz) ondes Gamma (γ: ≥ 32 Hz). L’axe Y est log power spectral density 10*log₁₀(μV²/Hz). Les données électrographiques à bande passante complète ont été acquises sans aucun filtre, mais ont été affichées avec un filtre basse fréquence (= filtre passe-haut) réglé à 1 Hz et un filtre haute fréquence (= filtre passe-bas) réglé à 120 Hz. L’enregistrement vidéo-EEG-ECG est montré dans le film supplémentaire 14. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 17: Traçage de l’EEG et analyse spectrale de la suppression postictale généralisée de l’EEG. Suppression généralisée postictal d’EEG avec l’histogramme correspondant de fréquence. Delta (δ: jusqu’à 4 Hz) Ondes thêta (θ: 4-8 Hz) Ondes Alpha (α: 8 -15 Hz) Ondes bêta (β: 15-32 Hz) ondes Gamma (γ: ≥ 32 Hz). L’axe Y est log power spectral density 10*log₁₀(μV²/Hz). Les données électrographiques à bande passante complète ont été acquises sans aucun filtre, mais les données ont été affichées avec un filtre basse fréquence (= filtre passe-haut) réglé à 1 Hz et un filtre haute fréquence (= filtre passe-bas) réglé à 59 Hz. L’axe Y est log power spectral density 10*log₁₀(μV²/Hz). L’enregistrement vidéo-EEG-ECG est montré dans le film supplémentaire 15. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 18: Séquence de la mort subite après la crise. Un lapin a connu la mort subite pendant le protocole PTZ et la séquence de la mort est détaillée. Les manifestations électroencéphalographiques sont indiquées en vert. Le temps zéro est la fin clinique de la crise. Ceci est suivi par le silence électrocérébral post-ictal (ECS.) Les données respiratoires sont indiquées en rouge et notent l’apparition de l’apnée. Les informations électrocardiographiques sont présentées dans des tons de bleu. Ce lapin a connu un bloc cardiaque, de multiples tachyarythmies, une bradycardie et, finalement, une asystolie, ce qui est indiqué par l’étoile noire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1 : Échelle de saisie pour les lapins retenus. La sévérité croissante de saisie est associée à l’activité motrice épileptique de plus en plus soutenue et plus généralisée. Des exemples vidéo sont disponibles dans Films supplémentaires 17-22. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Film supplémentaire 1: Enregistrement vidéo-EEG-ECG de lapin de base avec des lumières allumées. Une fois que le lapin est placé dans le dispositif de contention, le lapin devient plus détendu et des enregistrements de base peuvent être effectués. La vidéo montre que le lapin ne bouge pas pendant cet enregistrement. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce film.

Film supplémentaire 2: Enregistrement vidéo-EEG-ECG de lapin de base avec les lumières éteintes. Pour que l’expérience de stimulation photique soit effectuée, les lumières de la pièce doivent être éteintes. Éteindre les lumières dans la pièce n’affecte pas de manière significative l’enregistrement EEG ou ECG. Il est important de noter que la caméra vidéo dispose d’une lumière infrarouge afin que le lapin puisse être vu dans l’obscurité. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce film.

Film supplémentaire 3: Artefact musculaire du mouvement de l’œil gauche. La méthode décrite en ce document peut discerner entre l’objet façonné de muscle et les décharges épileptiformes. Bien que cette vague périodique de grande amplitude ait pu être confondue avec une saisie, elle se produit simultanément avec le mouvement de l’oeil gauche et est donc plus susceptible d’être provoquée par l’activité de muscle. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce film.

Film supplémentaire 4: Artefact musculaire d’un clin d’œil gauche. L’enregistrement vidéo-EEG est capable de détecter un clignotement oculaire sur EEG et également de déterminer qu’il se produit simultanément avec le clignotement oculaire vu sur la vidéo. Le clignement des yeux est latéralisé vers les fils EEG du côté gauche. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce film.

Film supplémentaire 5: Artefact musculaire du muscle de la mâchoire. Le video-EEG est capable de détecter le mouvement des petits muscles de la tête et du cou. La vidéo est inestimable pour déterminer que ce mouvement est dû au muscle au lieu des décharges épileptiques du cerveau. Comme prévu, le signal associé à ce mouvement provient des fils occipitaux. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce film.

Film supplémentaire 6: Artefact musculaire du léchage. Le tracé d’EEG montre de grandes vagues pointues rythmiques qui pourraient être compatibles à l’activité de saisie. La vidéo démontre que ces ondes sont causées par des mouvements de la langue et ne sont pas des décharges épileptiques. Comme prévu, le signal associé à ce mouvement provient des fils occipitaux. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce film.

Film supplémentaire 7: Artefact musculaire du mouvement de la bouche. Les nouvelles vagues observées dans la gamme delta sont associées au mouvement de la bouche. Il est important de distinguer ceci du ralentissement intermittent secondaire à l’encéphalopathie par visualisation du mouvement de bouche quand les vagues de thêta apparaissent. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce film.

Film supplémentaire 8: Artefact musculaire du tour de la tête. Une diminution importante, lente et transitoire de l’amplitude observée dans les fils frontaux est associée à un retournement de la tête du lapin. Il est important de noter qu’il n’y a pas de décharges épileptiques précédant le mouvement. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce film.

Film supplémentaire 9: Artefact musculaire de l’extension de la tête. Une augmentation importante, lente et transitoire de l’amplitude est observée dans toutes les pistes lorsque le lapin lève la tête. Il n’y a pas de décharges épileptiques précédant le mouvement. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce film.

Film supplémentaire 10: Artefact musculaire de la flexion de la tête. Une très grande diminution de l’amplitude dans tous les fils est observée lorsque le lapin étend la tête vers le bas. Il n’y a pas de décharges épileptiques précédant le mouvement. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce film.

Film supplémentaire 11: Artefact musculaire de mouvement complexe. Alors qu’il est dans le dispositif de retenue, le lapin fait un mouvement complexe impliquant sa tête et tout son corps. Ceci s’est produit pendant l’enregistrement de ligne de base, avant que tous les médicaments saisie-induisants aient été donnés. Ce mouvement de se produisant rapidement a été enregistré comme sursaut d’amplitude élevée et de haute fréquence sur l’EEG. De plus, les ondes aiguës rythmiques observées dans les fils frontaux sont dues au mouvement du nez, qui peut être vu comme synchrone avec les ondes sur la vidéo. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce film.

Film supplémentaire 12: Vidéo-EEG de grandes rafales de thêta de grande amplitude. Après l’injection de PTZ quelques lapins ont montré un ralentissement intermittent de l’EEG dans toutes les pistes. Ces vagues anormales n’étaient pas habituellement associées au mouvement. Bien que ces éclats d’ondes dans la gamme de thêta ne soient pas typiques de l’activité de saisie, ils sont associés à l’encéphalopathie chez l’homme. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce film.

Film supplémentaire 13: Vidéo-EEG de polyspikes. Des ondes fortes peuvent être observées immédiatement après l’injection, lors d’une crise ou pendant la période postictale. Ces résultats sont semblables à ceux trouvés chez l’homme et sont associés à l’activité de saisie. Pendant les polyspikes, l’oreille droite est également remarquée comme se crispant, une manifestation physique de la crise. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce film.

Film supplémentaire 14: Vidéo-EEG de sursaut gamma rythmique. Les sursauts à haute fréquence, comme ceux montrés dans la vidéo, se produisent souvent dans la période postictal et parfois après des doses de PTZ sous-seuil. La cause physiologique de ces sursauts gamma à haute fréquence est inconnue. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce film.

Film supplémentaire 15: Vidéo-EEG de suppression généralisée postictal d’EEG. Dans la période postictal, particulièrement après une saisie tonico-clonique généralisée, il y a souvent suppression de l’EEG dans tous les fils. De grandes déviations d’amplitude au cours de la période postictal sont montrées pour être provoquées par l’artefact de muscle des secousses myocloniques. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce film.

Film supplémentaire 16: Vidéo-EEG du silence électrocérébral. Cette vidéo illustre le rapport signal/bruit élevé de cette méthode. Avec une activité EEG minimale, il n’y a pas de signal d’appréciation de l’EEG. Cette spécificité est importante pour déterminer le moment de la mort cérébrale. En outre, il convient de noter qu’il y a souvent une fonction cardiaque résiduelle après la mort cérébrale. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce film.

Film supplémentaire 17: Vidéo-EEG de l’échelle de saisie étape 0. L’échelle des crises est conçue pour noter la gravité des crises motrices en déterminant la propagation et la durée de la crise. À l’étape 0, il n’y a aucune activité évidente de saisie, bien qu’il puisse y avoir des décharges épileptiques vues sur EEG. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce film.

Film supplémentaire 18: Vidéo-EEG de l’échelle de saisie étape 1. Le stade 1 de l’échelle des crises est identifié par la présence d’une brève crise partielle. Généralement, les crises partielles sont limitées à la tête, plutôt qu’à toute autre partie du corps. Ceci peut se manifester par des secousses de tête simples, des contractions simples d’oreille ou toute autre activité motrice brève et non-rythmique liée aux décharges épileptiques sur EEG. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce film.

Film supplémentaire 19: Vidéo-EEG de l’échelle de saisie étape 2. Le stade 2 de l’échelle des crises est identifié par une crise généralisée non soutenue. Souvent, tout le corps subira une secousse myoclonique. Cela se distingue des stades ultérieurs par un manque de rythmicité. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce film.

Film supplémentaire 20: Vidéo-EEG de l’échelle de saisie étape 3. Le stade 3 de l’échelle des crises est identifié par une crise soutenue et rythmique qui se limite à la tête en termes de manifestations motrices. Le lapin montré a des contractions rythmiques des oreilles et des paupières. Le lapin éprouve une brève secousse myoclonique du corps entier, mais ne progresse pas vers une secousse rythmique du corps entier. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce film.

Film supplémentaire 21: Vidéo-EEG de l’échelle de saisie étape 4. Le stade 4 de l’échelle des crises est identifié par une crise soutenue et rythmique qui impliquait tout le corps. Comme on peut le voir dans la vidéo, le corps du lapin est impliqué dans myoclonie alors qu’il y a relativement peu de mouvement des oreilles, des yeux et de la tête. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce film.

Film supplémentaire 22: Vidéo-EEG de l’échelle de saisie étape 5. L’étape finale de l’échelle de saisie si identifié par la présence des phases tonique et clonique de la crise. Au départ, il y a un mouvement désorganisé de tout le corps. Ceci est suivi par le stade tonique, puis par le stade clonique de la crise jusqu’à ce que la crise se résolve. Parfois, les lapins connaissent une mort subite après ce stade, mais ils meurent rarement à la suite d’une crise d’une gravité moindre. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce film.

Cette configuration expérimentale facilite les enregistrements et analyses vidéo-EEG-ECG-oxymétrie-capnographie simultanés détaillés chez le lapin, en particulier dans les modèles de maladies cardiaques et/ou neuronales. Les résultats de cet article montrent que cette méthode est capable de détecter des saisies et des arythmies et de les différencier des objets façonné électrographiques. Les résultats attendus ont été obtenus en donnant aux lapins un proconvulsivant, ce qui a induit des convulsions. Les données obtenues à partir des enregistrements de vidéo-EEG ont pu être plus loin analysées pour différencier des mouvements volontaires contre la sévérité croissante des saisies de moteur et des anomalies électroencéphalographiques, y compris la réponse photique de conduite, l’encéphalopathie et les décharges épileptiformes. De divers types de décharges épileptiformes ont été encore caractérisés et corrélés avec l’activité motrice. L’analyse de l’ECG a démontré une méthode qui a produit un rapport signal-bruit élevé et a permis l’identification et la quantification de chaque corrélation électrique du cycle cardiaque. Cette méthode a également pu détecter la présence d’anomalies cardiaques, y compris des complexes ventriculaires prématurés, une bradycardie, un bloc cardiaque, une tachycardie, des tachythmies et une asystolie. Le développement d’une méthode robuste pour étudier plus en détail les interactions neuro-cardiaques des maladies multi-systèmes fournit une avancée technologique importante qui est nécessaire afin de mieux comprendre ces maladies. De plus, la surveillance de la fonction respiratoire au fil du temps facilite une meilleure compréhension de l’insuffisance respiratoire après les crises et de sa contribution à la mort subite.

Cette configuration fournit également un système robuste pour les études de médicaments, telles que les tests d’innocuité cardiaque. Les projets de recherche qui emploient ces techniques sont capables d’étudier l’interaction entre les manifestations neuronales, cardiaques et respiratoires en temps réel. Bien que de nombreuses études aient été menées sur des cœurs de rongeurs, les résultats dans le cœur de lapin sont meilleurs pour les études translationnelles, car l’expression du canal ionique, les propriétés potentielles d’action et les mesures d’ECG sont similaires à celles des humains. Comme il s’agit d’une configuration vidéo-EEG-ECG cliniquement utilisée, à l’avenir, la même conception pourra être appliquée aux grands mammifères, tels que les porcs, les chiens ou les moutons. En plus, cette configuration d’enregistrement peut être employée pour la surveillance intra-crânienne d’EEG dans le lapin librement en mouvement, qui permet des enregistrements plus étendus à de divers états physiologiques, entourant des événements neuro-cardiaques spontanés, et la mort subite précédente. Ces méthodes seront inestimables pour élucider le mécanisme du SUDEP et pour trouver de nouvelles thérapies visant à traiter les maladies du cerveau et du cœur.

Le protocole présenté dans cet article comporte de nombreuses étapes critiques qui doivent être suivies pour produire des données avec un rapport signal/bruit élevé. Il est important de noter qu’avant le début de l’expérience, le lapin doit être fixé dans le dispositif de retenue pour limiter les grands mouvements du corps qui pourraient entraîner des lésions de la colonne vertébrale. La qualité du signal de toutes les électrodes est vérifiée. Si toutes les électrodes sont bruyantes, l’électrode de référence peut être remplacée pour améliorer le signal. Si les électrodes simples sont bruyantes, alors cette électrode doit être poussée plus profondément dans la peau ou retirée et réimplantée. Au cours de l’expérience, le mouvement des lapins peut provoquer le déplacement des électrodes. Dès que possible, essayez de remplacer les électrodes sans obstruer la vue de la caméra afin que les données puissent toujours être collectées à partir de l’expérience.

L’un des avantages de la méthodologie décrite dans cette étude est qu’elle facilite le dépistage d’un grand nombre d’animaux par l’investigateur et qu’elle est rentable. Ce protocole présente des limites. Bien que peu d’études aient été réalisées pour étudier spécifiquement l’impact physiologique de la contention sur les lapins, nous avons constaté que les lapins toléraient extrêmement bien la contention. De nombreuses études du système auditif ont été réalisées sur des lapins éveillés dans des contentions légères. Dans ces conditions, les lapins restent assis tranquillement pendant des heures sans aucun signe de stress ou d’inconfort³⁹. Après avoir été placés dans le dispositif de retenue, les lapins tentent rarement d’échapper au dispositif de retenue. Ils présentent une fréquence cardiaque proche de la ligne de base et s’endorment souvent, comme le note la présence de fuseaux de sommeil sur l’EEG. Les lapins ne présentent pas de manifestations visuelles, cardiaques ou autres pour suggérer qu’ils sont stressés.

Une orientation future est de développer un système d’enregistrement télémétrique EEG et ECG. Ceci permettrait une analyse plus détaillée pendant de divers états physiologiques, la détection des saisies spontanées, et la cascade des changements neuro-cardiaques précédant la mort inattendue soudaine dans l’épilepsie (SUDEP.) En raison de contraintes technologiques et d’un manque relatif de littérature sur l’EEG chez le lapin, la méthode présentée a été développée en premier. Afin d’adapter cette méthode aux lapins en mouvement libre, elle nécessiterait une surveillance vidéo continue, des implants EEG intracrâniens et des électrodes d’ECG sous-cutanées. Pourtant, la capnographie respiratoire chronique ne serait pas faisable. En raison de la réglementation institutionnelle (IACUC), la méthodologie est pour les enregistrements de ≤5 heures dans le dispositif de retenue. Chez les rongeurs, il est courant d’évaluer le seuil, la dynamique et les types de crises à l’aide de mesures provocatrices, telles que fébrile, auditive, électrochoc maximale, hyperventilation, privation de sommeil et crises induites par la drogue^{16,40,41,42,43.} Ce protocole permettrait de tester l’une quelconque des mesures provocatrices mentionnées précédemment.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les auteurs reconnaissent que cette étude a été soutenue par des subventions de l’American Heart Association, de l’American Epilepsy Society et du suny upstate department of pharmacology.