意识约束兔子中癫痫发作、心律失常和呼吸暂停的多系统监测

我们利用同时进行的视频-EEG-ECG-氧化-量谱-封盖术，开发了一种评估兔子模型易感性的方法，以开发引起心律失常和癫痫发作。这种新型记录系统建立了一个平台，以测试治疗的功效和安全性，并可以捕捉复杂的多系统事件级联，最终导致突然死亡。

离子通道病患者有发生癫痫发作和致命心律失常的高风险。癫痫患者（即癫痫心脏）的心脏病和心律失常患病率较高。此外，心脏和自主障碍已报告围绕癫痫发作。1:1，000 癫痫患者/年死于癫痫突发死亡 （SUDEP）。苏迪普的机制仍然不完全了解。脑电图 （EEG） 和心电图 （ECG） 是临床环境中经常使用的两种技术，用于检测和研究癫痫发作和心律失常的基板/触发器。虽然许多研究和描述这种方法是在啮齿动物，他们的心脏电活动与人类显著不同。本文描述了一种非侵入性方法，用于记录有意识的兔子同时录制视频-EEG-ECG-氧化术- capns。由于心脏电功能在兔子和人类中相似，兔子提供了一个很好的转化诊断和治疗研究模型。除了概述数据采集的方法外，我们还讨论了研究兔子神经-心脏电功能和病理学的分析方法。这包括心律失常检测、脑电表光谱分析以及为受约束的兔子开发的癫痫发作量表。

心电图 （ECG） 经常用于临床设置，以评估心脏导电和电激活恢复过程的动态。心电图对于检测、本地化和评估心律失常、缺血和梗塞的风险非常重要。通常，电极贴在患者的胸部、手臂和腿部，以便提供心脏的三维视图。当心肌去极化的方向朝向电极时产生正偏转，当心肌去极化方向远离电极时产生负偏转。心脏周期的电图成分包括心房去极化（P波）、心房-心室传导（P-R间隔）、心室兴奋（QRS复合体）和心室再极化（T波）。在心电图和行动潜力措施方面，许多哺乳动物，包括人类，兔子，狗，豚鼠，猪，山羊和马^1，2，3有很大的相似之处。

兔子是心脏转化研究的理想模式。兔子心脏在离子通道组成方面与人的心脏相似，其作用潜力属性^{为2、4、5。}兔子已经用于生成遗传，获得和药物诱导的心脏病模型^{2，4，6，7，8。}在心脏心电图和行动的潜在反应药物在人类和兔子^7，10，11有很大的相似之处。

与兔子、人类和其他大型哺乳动物^12、13、14相比，啮齿动物的心率和心脏电激活恢复过程大不相同。啮齿动物的心脏跳动速度是人类的10倍。相比之下，与人类和兔子心电图中的等离子电ST段相比，啮齿动物^14、15、16没有ST段。此外，啮齿动物有一个QRS-r'波形与倒T波14，15，16。QT间隔的测量结果与^14、15、16的啮齿动物与人和兔子的QT间隔非常不同。此外，正常的心电图值在人类与啮齿动物^12，15，16有很大的不同。心电图波形的这些差异可归因于作用潜在形态和离子通道的差异，驱动心脏再极化^9，14。虽然瞬态向外钾电流是啮齿动物短（非圆顶）心脏运动潜在形态的主要再极化电流，但在人类和兔子中，在行动潜力上有一个大的相-2圆顶，而延迟的整流器钾电流（I_Kr和I_Ks）是人类和兔子^{4、9、13、17}的主要再极化电流。重要的是，I_Kr和I_Ks在啮齿动物中是不存在/最小表达的，由于I_Kr和I_Ks的时态激活动力学，它在心脏作用潜在形态^9，13中没有作用。因此，兔子提供了一个更转化的模型，以评估药物诱导，获得和遗传心电图异常和心律失常^4，7，13的机制。其次，由于许多研究表明，在原发性心脏（长QT综合征^{18、19、20）}或神经元疾病（癫痫^{21、22、23、24）}中都存在神经元和心脏电异常，因此研究动物模型中密切再现人类生理学的基本机制非常重要。虽然啮齿动物可能足以模拟人脑，但啮齿动物并不是人类^{心脏生理学}的理想模型。

脑电图 （EEG） 使用电极（通常放置在头皮上或颅内）来记录皮质电功能。这些电极可以检测大脑皮层²⁵中附近金字塔神经元群的发射速率和同步性的变化。这些信息可用于评估大脑功能和清醒/睡眠状态。此外，EEG有助于定位癫痫活性，并区分癫痫发作与非癫痫事件（例如，心理非癫痫活性和心性事件）。为了诊断癫痫类型、发人深省因素和癫痫发作的来源，癫痫患者受到各种可能带来癫痫发作的动作。各种方法包括过度通风、色情刺激和睡眠不足。该协议表明，使用色情刺激诱导EEG畸变和癫痫发作的兔子26，27，28，29。

同时视频-EEG-ECG录音已广泛用于人类和啮齿动物，以评估行为，神经元和心脏活动在前，ictal，和后ictal状态^30。虽然多项研究已分别在^{兔子4、31、32、33}中进行电子EG和心电图录音，但一个在有意识的克制兔子中获取和分析同步视频EEG-ECG的系统尚未建立^。本文描述了一个协议的设计和实施，该协议可以同时记录有意识兔子的视频-EEG-ECG-capn1x-氧化测量数据，以评估神经-心脏电和呼吸功能。从这种方法中收集的结果可以表明心律失常、癫痫发作、呼吸障碍和身体表现之间的易感性、触发因素、动力学和和谐。我们的实验系统的一个优点是，我们获得有意识的录音，而无需镇静剂。兔子在约束器中停留≥5小时，移动最少。麻醉师干扰神经元、心脏、呼吸和自主功能，意识状态下的录音提供最多的生理数据。

此记录系统可能最终提供详细的见解，以增进对癫痫突发意外死亡的神经、心脏和呼吸机制的理解（SUDEP）。除了上述神经和心脏监测外，最近的证据也支持了呼吸衰竭^作为癫痫发作后突然死亡的潜在贡献^的作用。为了监测兔子的呼吸状况，在癫痫发作前、发作期间和发作后进行了牛科和角图测量，以评估呼吸系统的状况。这里提出的协议旨在评估药理学和磷刺激诱发兔子发作的阈值。此协议可以检测可能导致物理表现的细微的 EEG 和 ECG 异常。此外，该方法还可用于新型药物和器械的心脏安全和抗心律失常功效测试。

所有实验都是按照国家卫生研究院（NIH）指南和上州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）进行的。此外，本议定书的大纲在 图1中提供。

1. 准备录音设备

1. 将计算机连接到带有 64 针头箱的放大器。
   注意:每只动物有四个直皮下头皮销电极（7或13毫米），用于头部4个象限的EEG， ECG（埃因托芬三角形）3个弯曲的皮下胸针电极（13毫米，35°角），右腿1个弯曲皮下针地面电极，头部中央1个直皮下皮销电极作为参考。
2. 要使头箱上的每^{8 个} 引脚成为参考，请更新采集软件设置、获取选项卡，因此参考电极为 "独立"（ 即研究模式）。
   注:这可同时从多达 7 种动物中进行记录，每个动物配有 7 个电极以及专用参考电极和地面电极，全部通过一个放大器、数字化器和计算机进行。所有电极均以单极通道获得，与参考（头部中心）进行比较。在录制期间或录制后，可以设置额外的双极性和增强的铅配置/蒙太奇。由于设置能够同时记录来自多个动物的地面电极，因此每个动物的地面电极与放大器上的地面输入平行连接（图 2）。
3. 将兔子从笼子里取出，并称它们为每只动物计算适当的药物剂量。将兔子放在运输架中，并把它们带到一个单独的房间，以尽量减少对非实验性动物的压力。在这项研究中，使用了新西兰白兔的雄性和雌性，以及它们随后的后代。在兔子>1个月大时进行了实验。在实验时，这些兔子的体重在0.47-5.00公斤之间。
   注意:由于兔子需要在同一个房间，并看到相机，不要完全隔离兔子。一只兔子强调另一只兔子可能会有视觉和听觉表现。因此，最好一次在房间里放一只兔子，这是为刺激性实验而做的。对于所有其他实验，兔子被尽可能多地隔开，同时将它们全部放在摄像机的视野之内。理想情况下，使用屏障或一次只研究一种动物。这不是一个主要的混淆，因为兔子的心 率在实验期间保持相当稳定，并且经常出现睡眠主轴。同时从多种动物的录音可以确保在相同的环境条件下获得控制和测试动物数据。

2. 植入EEG-ECG电极并安装呼吸监测器

1. 从运输车厢中取出一只兔子，放在坐着的调查员的腿上。
2. 垂直抱住兔子，让它靠近调查员的身体。
3. 把兔子放在一个超平的位置，兔子的头在调查员的膝盖上，兔子的头比它身体的其他部位低。
   注意:此操作放松动物，并最大限度地降低它试图移动或逃脱，同时放置电极的可能性。
4. 现在，兔子被固定在一个超平的位置，请第二个调查员传播毛皮，直到皮肤可以识别和隔离从底层组织。
5. 在每个轴皮中下皮插入 35°弯曲的电极（图 3A）。
   注意:电极应通过，以便它们安全地钩入皮肤，但不要穿透更深的结构。让电极进入，然后退出皮肤（通过和通过）减少铅被移开的机会时，把兔子在约束器或如果它在实验期间移动（图3B）。所有电极在放置前均使用 70% 乙醇进行灭菌。
6. 胸部后部向右和左前肢和腹部前部左后肢的引线。将地面针电极前肢放在腹部右后肢（图4A）。
7. 一旦所有心电图引线都正确放置，将兔子返回到易感位置，导线向上运行到兔子腹部的一侧，并将兔子转移到一个适当大小的约束器（例如，6" x 18" x 6"）。 将兔子放入约束器时，向上拉松动的电线，以尽量减少兔子用腿拉出电极。将电线贴在约束器的侧面，这样它们就不会在实验中被抓到兔子下面（图4B）。
8. 通过降低颈部周围的约束并将其锁定到位，将兔子固定在约束器中。此外，将后肢移到动物下面，并固定后部约束。
   注意:一个人应该能够在颈部下部的空间内安装1-2个手指，以确保它不是太紧。特别是在可能有运动运动的实验中，必须加强约束，以尽量减少运动、潜在的脊柱损伤、肢体脱位和踢出后部约束的能力（图4B）。兔子在约束器中保持约5小时，没有任何与运动增加或脱水迹象有关的问题。
   1. 对于小兔子（例如，不到2个月）在动物下面放置一个橡胶助推器垫，以将兔子抬起来，防止兔子将脖子放在头部底部约束处（图4C）。
      注:呼吸和心率的突然下降可能是颈部撞击的次要因素。如果发生这种情况，放松颈部约束器，抬起兔子的头，以减轻任何颈部压缩。
   2. 当后部约束不密切跟踪兔子的背部/脊椎时，放置一个PVC垫片以防止任何可能导致脊柱损伤的运动。
      注:例如，~14厘米长×4"内径PVC管，下部25-33%的去除可以放置在兔子与泡沫提供适当的约束（图4C）。
9. 现在，兔子被安全地放入约束器中，将 7-13 mm 的皮下直销电极插入头皮（图 3A）。使用45° 角度的进入方法，将电线向上运行到耳朵之间，并松散地将电线系在头部后面的约束器上，以保持铅的位置。将 5 EEG 引线放置在以下位置:右前、左前、右前、左腹和中央参考 （Cz） 引线位于其他 4 个引线（图 4D）之间的点。
   注意:电极被放置在对头骨的皮下组织中时，会正确放置。此位置最大限度地减少了鼻子、耳朵和其他周围肌肉的神器。有节奏的鼻子运动的一些神器是不可避免的。前EEG引线应该放在兔子的眼睛和前点中间。眼线应放在耳朵前部，并指向中间方向。Cz 位于头部顶部的中心，位于所有 4 个电极之间（沿缝合线在兰姆达和布雷格马之间半途而至）。Cz电极的引脚前指向。
   1. 将 EEG 电线传到耳朵之间，避免兔子试图咬电线。
10. 将脉冲氧计丛仪连接到兔子的耳朵上，在边缘的耳静脉上。
    注意:可能需要从耳朵上剃掉多余的头发以改善信号或使用纱布来保持传感器到位。
    1. 确保胸腔造影的心率与心电图的心率相关，并显示氧饱和度（图5C）。
11. 轻轻地将面罩与帽管放在兔子的嘴和鼻子上（图4H）。用缠绕在面罩上的绳子固定面罩，并将字符串的两端连接到约束器上。将封盖管的另一端连接到生命体征监视器上。
    注意:在实验期间，防止绳子放在兔子的眼睛上是很重要的。为此，将绳子贴在兔子耳朵之间的约束器中间。为了改善封顶信号，使用胶带和细片氮化金创建单向阀门，使氧气进入T型管，并将呼出的二氧化碳直接排入封顶管（图4I）。

3. 录像电子电讯

1. 使用市售的 EEG 软件执行视频 EEG-ECG 录制。
   注意:生物可能引线和视频被锁定的时间锁定，以便以后将电气和视频信号（例如，EEG 峰值与肌曲速抽搐相关联）。
2. 确认最佳连接，无基线漂移、无 60 Hz 电气噪声和高信号与噪声比。具体而言，确保心脏波形的每个阶段都能在心电图上可视化，并且增量、表塔和阿尔法波不会在视觉上被 EEG 上的高频噪声遮盖。
   1. 如果所有电极都产生过量的噪声，则调整中央参考引引。如果只有一个电极过于嘈杂，则将电极推入皮肤深处或重新定位，直到没有金属暴露。
3. 调整视频，以便所有兔子可以同时看到，这允许运动活动与脑电图发现（图5A）的相关性。
   注:该系统可同时容纳多达7只兔子的EEG/ECG/氧化计/封盖记录。
4. 从每只动物开始基线记录至少10-20分钟，或直到心率稳定到平静的放松状态（200-250 bpm），兔子至少5分钟不表现出大动作。在没有任何过滤器的情况下获取全带宽电图数据。为了更好地可视化数据，将低频滤光片（=高通滤清器）设置为 1 Hz，将高频滤光片设置为 59 Hz。
   注意:兔子放松的另一个迹象是EEG睡眠主轴的开始（稍后讨论）。
5. 在实验期间实时添加时间锁定的笔记，以指示干预（如药物输送）和神经心脏事件（例如，EEG 峰值、运动发作、异位跳动和心律失常）和运动/调查器人工制品的时间。
   注:由于调查员需要进行干预（例如，刺激、送药）的频率，以尽量减少调查员进出房间和打开/关闭门的压力，因此在整个实验过程中，调查员仍然站在房间的对面。调查人员尽量远离动物，保持安静和安静，以尽量减少潜在的干扰动物。

4. 实验协议

注:如果对同一动物进行，以下每个实验都是在单独的日子进行的。口服测试复合药物研究与急性晚期亲惊厥药物研究之间有2周的延迟。必要时，进行刺激性实验，然后等待30分钟，然后进行PTZ药物研究。

1. 为了让兔子适应约束器，让研究者客观地确认心肺率稳定，用心肺和神经元传感器对所有兔子进行仪器检测，并>每个动物进行1小时1至3次的连续视频监测。
2. 幻影刺激实验
   1. 除了上述方法外，在兔子眼睛水平前放置一个带有圆形反射器30厘米的光源，闪光强度设定为最大（16坎德拉^）29。光源由 图4E中的一个白点表示。
      注:一个光线昏暗的房间应该用来引起感光反应^37。
   2. 由于兔子的眼睛在头部的一侧而不是头部的前面（就像人类一样），在兔子的两侧放置2面镜子，在兔子的后面放置1面镜子，使光线进入兔子的眼睛。
      注:一面≥20厘米高、长120厘米 ≥的平面镜子在兔子周围形成一个三角形的外壳，以确保闪烁的光线进入兔子的眼睛，如 图4E所见。
   3. 将光源连接到具有可调速率、强度和持续时间的控制器。
   4. 使用具有红灯和红外记录功能的摄像机录制视频。
   5. 将兔子暴露在每个频率30s，睁开眼睛，然后用外科口罩遮住脸部，以模拟或导致眼睛闭合在每个频率。
      注:先前的研究表明，闭眼是最具有挑衅性的策略，可以引起^对癫痫发作的感光性。此外，10%的感光患者在^闭眼时只出现脑电示征。通过观察头部和全身肌克隆抽搐、克隆人或补品状态的存在，可以临床上识别癫痫发作。脑电图记录更彻底地分析脑电图相关性（如尖峰、多尖峰和有节奏放电），具有运动表现，以明确诊断癫痫发作活动。癫痫患者应检查由癫痫学家确认的由肌肉人工制品或不确定癫痫波遮盖的运动。
   6. 以 2 Hz 增量将刺激器频率从 1 Hz 增加到 25 Hz。然后执行相同的照片刺激协议，但这次以 5 Hz 增量将频率从 60 Hz 降低到 25 Hz。
      注意:如果兔子有癫痫发作，实验应该停止。继续监视兔子 30 分钟。然后将兔子送回房间，每1小时监测3小时，以便完全恢复。但是，如果photic刺激诱导光帕罗西斯反应，则跳过上升频率的其余部分，并且从 60 Hz 下降到发生另一个光平氧异常响应，从而重新开始该系列。这将允许确定上下色刺激阈值。没有必要延迟，因为光平氧反应将在磷刺激停止后停止。如果不清楚是否发生了光平氧反应，频率在延迟10s³⁸后重复。
   7. 实验完成后，从兔子身上取出EEG和心电图引线，并将其送回其家笼，由饲养人员进行日常护理。
3. 药物口服管理
   1. 由于许多药物是口服的，通过与食品级苹果酱混合来制备口服化合物。将 0.3 毫克/千克 E-4031 混合在 3 mL 的苹果酱中，无需针头即可放入 3 mL 口服/灌溉注射器中。
      注意:可以以这种方式管理几种药物，包括测试化合物、已知可改变 QT 持续时间的药物（莫西氟沙辛或 E-4031），以及阴性控制或车辆。有些药物在静脉注射配方中不可用。此外，许多药物是在口服配方中开具的，因此静脉注射可能与临床相关性较低。
   2. 抬起上唇，将口服注射器的尖端滑入兔子嘴边，兔子的牙齿不会遮挡，并将所有的药物和苹果酱注射到兔子的嘴里。
   3. 继续视频-EEG-ECG录制2小时，然后将动物送回其家庭笼子进行日常护理。
   4. 在实验的第2天和第3天，将兔子连接到视频-EEG-ECG，记录10-20分钟的基线，然后注射相同的药物，并记录2小时。
   5. 洗掉1周后，执行10-20分钟的基线，然后给每只兔子一剂安慰剂连续3天，并记录2小时。
      注:口服药物的管理可以设计为交叉研究，其中安慰剂在第1周给予，药物在第2周。
4. 静脉注射药物实验（彭泰利内特拉佐尔，PTZ）
   1. 为了可视化边缘的耳静脉，剃掉兔子耳朵的后表面。使用 70% 的乙醇擦拭对场地进行消毒并扩张边缘耳静脉。这由 图4F中的黑色虚线椭圆形表示。
   2. 此时，让一个实验者用手捂住兔子的脸，以减轻手术对兔子的压力。第二个实验者用无菌的25G血管解剖器小心地调节边缘耳静脉。
   3. 导管进入静脉后，在导管末端放置无菌注射塞，以便针头可以静脉注射药物。注塑插头的位置由 图4G中的蓝色圆圈表示。
   4. 用胶带包4×4英寸纱布做夹板，形成管状，放在兔子的耳朵里。然后将夹板粘在耳朵上，使导管固定到位，保持直立，类似于非导管耳。
   5. 注射1mL的10 USP单位每mL肝盐水。
      注:导管和容器应明显清除空气，并保留专利。如果导管不在容器中，注射器不会轻易推动，皮下组织中会积聚盐水。
   6. 每10分钟以1毫克/千克的增量给兔子静脉注射1毫克/千克至10毫克/千克的PTZ增量剂量。在每种剂量的开始时做一个说明，以指示注射了哪些动物和药物的浓度。
      注意:这有助于评估 PTZ 管理的急性和添加剂效应。或者，为了进一步评估低剂量PTZ的慢性影响，兔子在每个低剂量浓度下重复剂量，7剂量在2毫克/千克，3剂量在5毫克/千克，然后3剂量在10毫克/千克，每个剂量分开10分钟。
   7. 每次剂量后，仔细监测视频-EEG-ECG-capnx-氧化术，了解任何神经-心脏电和呼吸异常以及癫痫成形活动的视觉证据。实时和分析后注意这些变化。
      注:扣押活动通常从 PTZ 管理的 60 年代开始。

5.非生存实验结论。

1. 如果兔子在 PTZ 实验过程中没有经历突然死亡，则每 4.54 kg 体重（或所有兔子的 1.5 mL）使用 1mL 的 390 毫克/mL 的五巴比妥钠，然后进行 1 mL 的正常盐水冲洗。监测心电图，确保兔子心脏骤停。
2. 一旦兔子出现心脏骤停，迅速进行尸检，以重新分离各种器官，包括心脏、肺、肝脏、大脑、骨骼肌肉和后续分子/生化分析所需的任何其他组织。
3. 按照制度政策处置兔子。

6. 心电图分析

1. 使用市售的心电图分析软件可目视检查心电图，并识别心动过速、心动过速、异位跳动和其他心律失常的时期（图6）。为了减少要审查的数据量，创建一个 tachogram，这将增加识别心动过速、心动过速或 RR 间隔不规则的易用性。
   注意:心电图异常（例如QT_c 延长）和心律失常通过审查心电图以检查速率异常（例如， brady-/心动过速）、节奏（例如，早产儿/心室复合体）、传导（例如，心室阻塞）和波形（例如，非鼻腔心房/心室心动过速和颤动）。通过查看 RR 间隔中的异常情况，可以检测到心律失常。心动过速可以通过心率超过每分钟300次的塔乔格拉姆部分来识别。当心率低于每分钟 120 次时， 就会识别布雷迪心肌。
2. 使用市售的心电图分析软件，在基线和挑衅时（例如，调查员操纵动物、测试剂的管理以及癫痫发作引起的心电图变化）执行标准心电图测量（心率、心脏周期间隔）。

7. 视频电子视网分析

1. 使用市售软件可直观地滚动浏览视频和 EEG 跟踪，以确定基线信号 （图 7）和预期的 EEG 放电（如睡眠主轴 （图 8）和顶点波 （图 9）的存在。
   注:虽然在没有任何滤波器的情况下获取全带宽电图数据，但数据应显示在设置为 1 Hz 的低频滤清器（即高通滤光器）下，并基于Nyquist定理，将高频滤波器（即低通滤波器）设置为 120 Hz，以避免丢失任何信号。在审查低频（<25 Hz）EEG活动时，可以调整滤镜以实现更好的可视化和降噪（例如，1-59 Hz）。
2. 除了角电波形式外，还使用 EEG 上的鼻子运动人工制品来确定呼吸的存在与缺失。这也可以与视频中看到的鼻子运动相关。
3. 使用市售软件对视频和 EEG 进行视觉滚动，以区分癫痫与非癫痫（例如，有意识）运动，每次剂量 PTZ （图 10）后至少 1 分钟。扫描癫痫发作前、发作期间和发作后脑电图变化。通过观察头部和全身肌克隆抽搐、克隆人或与脑电图相关性的补品状态的存在，可以临床上识别癫痫发作。EEG 变化可能包括 EEG 尖峰、多尖峰和有节奏的放电。
   注意:EEG被肌肉神器或不确定性癫痫成因波遮盖的运动应由神经学家审查以供确认。将视频集中在一只兔子身上，以便更密切地观察它的行为，以及其EEG和心电图录音（图5B）可能是有利的。
4. 根据运动表现的类型和严重程度对视频 EEG 进行评分，这些发作通常发生在 PTZ 注射后 1 分钟内（表 1）。
5. 在幻觉刺激实验后，通过在市售的 EEG 分析软件中创建光谱分析图，分析 EEG 的腹腔引线，以识别其存在和缺乏腹腔驱动节奏。腹腔驱动节奏将在光谱分析中创建一个与刺激器频率相对应的峰值（图 11）。
   注意:除基本频率峰值外，幻影刺激还可能产生谐波频率峰值。

7. 呼吸功能分析

1. 查看生命体征监测仪（图4I）的输出，并导出信号以供进一步分析。
2. 注意癫痫发作期间和癫痫发作后呼吸模式的变化，尤其是呼吸暂停开始的时间点。

上述方法能够检测大脑和心脏传导系统中的异常以及呼吸障碍。数据采集软件用于评估心电图形态并检测任何异常心率、传导障碍或心电图节律（心室/心室异位跳动和 Brady-/tachy-心律失常）（图 6）。除了可视化心电图形态外，还分析这些痕迹以量化 RR 间隔、心率、PR 间隔、P 持续时间、QRS 间隔、QT 间隔、QTc、JT 间隔和 T_峰值 到 T_端 间隔。对这些数据的分析表明，很容易检测到心动/胸腺心律失常。

除了分析心电图数据外，还分析了 EEG 数据。使用光谱分析（图 7）收集和分析基线 EEG。此数据显示，前引线的振幅高于前引线，并且所有引线的主导频率都在增量范围内。能够以高信号与噪声比记录兔子的EEG，对于检测癫痫排泄物和对记录进行进一步分析非常重要。与人类睡眠主轴具有相似形态和频率的波出现在图8中。源自头部中心的顶点波显示在图 9 中。除了正常的EEG变化外，在基线记录期间还注意到各种有意识的非癫痫兔子运动，以区分它们与癫痫排泄物（图10）。在补充电影 1 - 11中，可以播放显示的动作的视频 EEG 录音以及其他动作。

采取了几种方法，试图诱发癫痫发作。第一种方法采用 photic 刺激在 1-60 Hz 与眼睛睁开和关闭 （图 4E）.由于眼睛对兔子的位置是横向的，而不是像人类一样前视的，所以使用镜子用单一的光源将光线引导到兔子的眼睛中。从 3 Hz 的 photic 刺激实验中对 EEG 的分析显示，预期的 3 Hz 频率（图 11）具有很强的眼部驱动响应。除了刺激外，兔子还通过左边缘耳静脉导管（图4G）注射五角星（PTZ，GABA_A阻滞剂）。PTZ 的注射在 1 分钟内导致不同程度的癫痫发作活动，并与不同的 EEG 波形相关。图12、图13、图14、图15、图16、图17中显示了一些具有代表性的波形，包括塔爆发、大振幅突起、多尖波、低压多尖波、有节奏伽马爆发和电脑静音（ECS）。

为了确定癫痫发作，使用了若干标准。对视频进行审查，以确定任何可能的癫痫发作运动表现。然后，为了确认运动活动是癫痫活性的结果，EEG 信号被评估为暂时相关的 EEG 峰值、多峰值、尖锐波或有节奏的放电。如有疑问，视频 EEG 将由第二个调查员和/或癫痫学家进行审核以供验证。癫痫发作开始被定义为有节奏的EEG放电（EEG癫痫发作开始）和运动活动（临床癫痫发作开始）的第一例。当停止有节奏的 EEG 尖峰和运动活动时，分别观察到 EEG 和临床癫痫发作。除了各种EEG波形态学外，兔子还通过越来越普遍和越来越长时间的运动捕捉而进步。之所以建立缉获量表，是因为拉辛缉获量表及其修改版本均不适用于受约束的兔子（表1）。具有代表性的电机扣押活动的视频显示在补充电影17，补充电影18，补充电影19，补充电影20，补充电影21，补充电影22。

此处介绍的方法还能够确定癫痫发作调解的突然死亡之前的多系统级联事件（图 18）。各种病理包括:脑电沉默（ECS）、呼吸骤停（呼吸暂停）、胸心律失常和心脏骤停（系统）在实验中，一只兔子在药理学诱发的癫痫发作后突然死亡。在这只兔子中，有一个序列，从呼吸骤停开始，然后是ECS，心房阻塞，几个非持续性心动过速，心动过速，并最终停止。

图1:实验方案概述。 为了概述本议定书的主要步骤，创建了一个数字。该图概述了必须准备记录设备，然后将设备连接到兔子并确保观察到高质量的信号。在此步骤之后，可以执行预期的实验，可以采购器官，并分析视频-EEG-ECG-封顶-氧化测量数据。请单击此处查看此图的较大版本。

图2:实验设备。实验设置图，包括计算机、红外光、麦克风、摄像机、生命体征监视器、64 针头箱、放大器、数字化器、8 个电极（5 个 EEG、3 个 ECG） – 连接到头箱的每个动物的地面。引线根据以下颜色编码:4 个蓝色 EEG、1 个黑色 EEG 参考、3 个红色 ECG、1 个绿色地面。没有显示容纳兔子的约束箱。此设置允许同时记录多达 7 只兔子。黄线表示顶膜管，并将面罩连接到生命体征监视器。蓝线表示连接到生命体征监视器的氧化线。请单击此处查看此图的较大版本。

图3:EEG和心电图的图片。 （A） 弯曲心电图电极和直 EEG 电极。（B） 如何将心电图电极钩在兔子皮下组织中，使其通过和通过。缩写（LL:左肢，RA:右臂，RL:右肢，LA:左臂，RF:右前额，LF:左前额，Cz:中心，RO:右眼，LO:左眼）。请单击此处查看此图的较大版本。

图4:兔子连接到设备。 （A） 心电图电极的位置，左臂由一个黄点表示。右臂由白点指示。左腿由红点表示。右腿前部的地面由绿点表示。（B） 兔子在约束器与心电图和 EEG 电极连接。（C） 幼兔在约束器中适当修改，以容纳较小的兔子，包括兔子下面的助推器、颈部泡沫和切割PVC管。（D） 与 EEG 电极位置的约束器中的兔子。右前方由橙色点表示。左前方由红点表示。右眼线由黄点表示。左眼线由蓝点表示。引用由黑点表示。（E） 兔子在约束器与磷刺激器和镜面展位设置。光源由白点表示。（F） 兔子耳朵被剃光后的边缘耳静脉被酒精擦拭。（G） 兔子用血管解剖器牢固地贴在左边缘耳静脉上。注塑插头的位点用蓝点表示。（H） 兔子的面罩被一个包含单向阀门的T形管子连接到顶膜管上。（I） 与封盖管相连的面罩和 T 形图图。在灵感过程中，室内空气可以通过单向阀（绿色箭头）进入 T 形件。在过期期间，CO₂ 通过输入封顶管（黄色箭头）离开 T 件。由于死空间小，T片中保留_{的二氧化碳} 很少，一般小于5 mmHg。请单击此处查看此图的较大版本。

图5:同时兔子视频-EEG-ECG-角摄影-氧化计。 （A）同时录制3只兔子的视频-EEG-ECG。（B） 放大缩小 #2字体功能 放大缩小字体功能（LL: 左肢， RA: 右臂， 洛杉矶: 左臂）（C） 同时记录封顶（黄色）和全息摄影（蓝色）。图中包括受启发_{的二氧化碳}、端潮CO_2、呼吸速率、脉搏速率和脉搏氧化物的测量结果。请单击此处查看此图的较大版本。

图6:兔子心电图。（A） 基线心电图。引线显示在标准的双极前平面边缘铅配置和单极配置（RA: 右臂， LL: 左肢， LA: 左臂） 与Cz铅在头上作为参考.（B） 过早的心室复合体。（C） 鼻窦胸腔。（D） 鼻窦心动过速。（E） 基线兔心电图跟踪与 P 波启动，P 波峰，P 波结束，QRS 波开始，QRS 波峰，QRS 波端，ST 段高度，T 波峰，T 波端标记。（F） 心电图测量。所有测量均以毫秒为标准，但心率除外，心率为每分钟节拍。请单击此处查看此图的较大版本。

图7:基线脑电图和光谱分析。 （A） EEG 在基线记录期间跟踪。（B） 脑电图的光谱分析显示，三角洲波活动是所有引线中占主导地位的频率。三角洲 （δ: 高达 4 Hz） Theta （θ: 4-8 Hz） 波阿尔法 （α: 8 -15 Hz） 波测试版 （β: 15-32 Hz） 波伽玛 （γ: ≥ 32 Hz） 波.Y 轴是日志功率光谱密度 10*日志₁₀（μV²/Hz）。在没有任何滤波器的情况下获取了全带宽电图数据，但数据显示在低频滤光片（+高通滤波器）设置为 1 Hz，高频滤光片（+低通滤波器）设置为 120 Hz。请单击此处查看此图的较大版本。

图8:睡眠主轴脑电图追踪和光谱分析。（A） EEG 在睡眠主轴期间进行跟踪。（B） 脑电图的光谱分析显示，在12-15赫兹处存在额外的波，这与人类睡眠主轴的频率相似。三角洲 （δ: 高达 4 Hz） Theta （θ: 4-8 Hz） 波阿尔法 （α: 8 -15 Hz） 波测试版 （β: 15-32 Hz） 波伽玛 （γ: ≥ 32 Hz） 波.Y 轴是日志功率光谱密度 10*日志₁₀（μV²/Hz）。（C） 睡眠主轴的多个脑电图蒙太奇表明它们来自头部中心 （Cz），这与人类的发现一致。在没有任何滤波器的情况下获取了全带宽电图数据，但数据显示时，低频滤光片（=高通滤清器）设置为 1 Hz，高频滤光片（+低通滤波器）设置为 59 Hz。请单击此处查看此图的更大版本。

图9:顶点波跟踪和光谱分析。 （A） EEG跟踪多个顶点波。（B） 顶点波的光谱分析没有显示顶点波频率的明显差异。虽然这是预料之中的，因为视觉上的频率小于1 Hz.（C） 顶点波的多个脑电图蒙太奇显示它们来自头部中心，这与人类的发现是一致的。在没有任何滤波器的情况下获取了全带宽电图数据，但数据显示时低频滤光片（=高通滤清器）设置为 1 Hz，高频滤光片（+低通滤波器）设置为 59 Hz。 Y 轴是日志功率光谱密度 10*日志₁₀（μV²/Hz）。请单击此处查看此图的较大版本。

图10:兔子运动引起的EEG文物。 （A） 右眼囊化过程中的 EEG 。（B） 左眼眨眼时的 EEG 。（C） 在鼻子有节奏地运动期间，EEG 与呼吸有关。（D） 舔动过程中的 EEG。（E） EEG 在兔子向下伸展头部的一集里。（F） EEG 在全身复杂的有意识运动中。这些动作的视频EEG可在 补充电影3-11中找到。在没有任何滤波器的情况下获取了全带宽电图数据，但数据显示时，低频滤光片（=高通滤清器）设置为 1 Hz，高频滤光片（+低通滤波器）设置为 59 Hz。请单击此处查看此图的更大版本。

图11:在幻象刺激期间的EEG。 （A）EEG在3 Hz的刺激过程中追踪，兔子睁开眼睛。（B） 光谱分析 3 Hz photic 刺激，峰值在 3 Hz，见于腹腔引线，但前引线不可见。在没有任何滤波器的情况下获取了全带宽电图数据，但数据显示时低频滤光片（=高通滤清器）设置为 1 Hz，高频滤光片（+低通滤波器）设置为 59 Hz。 Y 轴是日志功率光谱密度 10*日志₁₀（μV²/Hz）。请单击此处查看此图的较大版本。

图12:脑电图跟踪和光谱分析的塔爆裂。 在所有 EEG 引线中都会间歇性地看到塔爆裂。这些波的频率约为 4-6 Hz. 三角洲 （δ: 高达 4 Hz） Theta （θ: 4-8 Hz） 波阿尔法 （α: 8 -15 Hz） 波测试版 （β: 15-32 Hz） 波伽玛 （γ: ≥ 32 Hz） 波.Y 轴是日志功率光谱密度 10*日志₁₀（μV²/Hz）。在没有任何滤波器的情况下获取了全带宽电图数据，但数据显示时低频滤光片（=高通滤清器）设置为 1 Hz，高频滤光片（+低通滤波器）设置为 59 Hz。 Y 轴是日志功率光谱密度 10*日志₁₀（μV²/Hz）。请单击此处查看此图的较大版本。

图13:脑电图跟踪和光谱分析大振幅的突起。 大振幅的突起在外观和频率上与塔波相似，但振幅较大。振幅的快速变化使其中一些波看起来更锐利。三角洲 （δ: 高达 4 Hz） Theta （θ: 4-8 Hz） 波阿尔法 （α: 8 -15 Hz） 波测试版 （β: 15-32 Hz） 波伽玛 （γ: ≥ 32 Hz） 波.Y 轴是日志功率光谱密度 10*日志₁₀（μV²/Hz）。在没有任何滤波器的情况下获取了全带宽电图数据，但数据显示时低频滤光片（=高通滤清器）设置为 1 Hz，高频滤光片（+低通滤波器）设置为 59 Hz。 Y 轴是日志功率光谱密度 10*日志₁₀（μV²/Hz）。视频 EEG-ECG 录制显示在 补充电影 12 中。请单击此处查看此图的较大版本。

图14:脑电图跟踪和多尖波光谱分析。 多点波断断续续地同时出现在所有引线中。在光谱分析中，有多个谐波峰值，基本频率在 6 Hz 左右。 三角洲 （δ: 高达 4 Hz） Theta （θ: 4-8 Hz） 波 阿尔法 （α: 8 -15 Hz） 波 测试版 （β: 15-32 Hz） 波 伽玛 （γ: ≥ 32 Hz） 波.Y 轴是日志功率光谱密度 10*日志₁₀（μV²/Hz）。在没有任何滤波器的情况下获取了全带宽电图数据，但数据显示时低频滤光片（=高通滤清器）设置为 1 Hz，高频滤光片（+低通滤波器）设置为 59 Hz。 Y 轴是日志功率光谱密度 10*日志₁₀（μV²/Hz）。视频 EEG-ECG 录制显示在 补充电影 13 中。请单击此处查看此图的较大版本。

图15:低压多尖波的脑电图跟踪和光谱分析。 低压多派克波类似于多派克波，但振幅较低。光谱分析类似于多尖点分析。三角洲 （δ: 高达 4 Hz） Theta （θ: 4-8 Hz） 波阿尔法 （α: 8 -15 Hz） 波测试版 （β: 15-32 Hz） 波伽玛 （γ: ≥ 32 Hz） 波.Y 轴是日志功率光谱密度 10*日志₁₀（μV²/Hz）。在没有任何滤波器的情况下获取了全带宽电图数据，但数据显示时低频滤光片（=高通滤清器）设置为 1 Hz，高频滤光片（+低通滤波器）设置为 59 Hz。 Y 轴是日志功率光谱密度 10*日志₁₀（μV²/Hz）。请单击此处查看此图的较大版本。

图16:脑电图跟踪和有节奏伽马爆发的光谱分析。前导中最清楚地看到爆裂模式中的节奏伽马爆发。在频率分析中，前导线中又出现了约 50-55 Hz 的峰值。三角洲 （δ: 高达 4 Hz） Theta （θ: 4-8 Hz） 波阿尔法 （α: 8 -15 Hz） 波测试版 （β: 15-32 Hz） 波伽玛 （γ: ≥ 32 Hz） 波.Y 轴是日志功率光谱密度 10*日志₁₀（μV²/Hz）。全带宽电图数据是在没有任何滤波器的情况下获得的，但显示的低频滤光片（=高通滤清器）设置为 1 Hz，高频滤光片（+低通滤波器）设置为 120 Hz。 请单击此处查看此图的较大版本。

图17:脑电图跟踪和光谱分析的后期泛泛脑电图抑制。 术后泛泛性 EEG 抑制与相应的频率直方图。三角洲 （δ: 高达 4 Hz） Theta （θ: 4-8 Hz） 波阿尔法 （α: 8 -15 Hz） 波测试版 （β: 15-32 Hz） 波伽玛 （γ: ≥ 32 Hz） 波.Y 轴是日志功率光谱密度 10*日志₁₀（μV²/Hz）。在没有任何滤波器的情况下获取了全带宽电图数据，但数据显示时低频滤光片（=高通滤清器）设置为 1 Hz，高频滤光片（+低通滤波器）设置为 59 Hz。 Y 轴是日志功率光谱密度 10*日志₁₀（μV²/Hz）。视频 EEG-ECG 录制显示在 补充电影 15 中。请单击此处查看此图的较大版本。

图18:癫痫发作后突然死亡的顺序。 一只兔子在 PTZ 协议期间经历了突然死亡，死亡顺序详细。脑电图表现以绿色表示。时间零是癫痫发作的临床结束。其次是电后电脑沉默（ECS.）呼吸数据以红色显示，并注明呼吸暂停的开始。心电图信息以蓝色显示。这只兔子经历了心脏阻塞，多发性心律失常，心动过速，最终无精服，这是由黑星指示。请单击此处查看此图的较大版本。

表1:被限制的兔子的扣押量表。癫痫发作严重程度的增加与日益持续和更普遍的癫痫运动活动有关。视频示例可在 补充电影 17-22中找到。 请单击此处下载此表。

补充电影 1: 基线兔子视频 EEG - ECG 录制与灯打开。 兔子被放入约束器后，兔子变得更加放松，可以进行基线记录。视频显示兔子在这段录音中没有动。 请点击这里下载这部电影。

补充电影 2: 基线兔子视频 EEG - ECG 录制与灯关闭。 为了进行色情刺激实验，必须关闭房间的灯。关闭房间的灯不会显著影响 EEG 或 ECG 录制。重要的是，摄像机有红外光，这样兔子就可以在黑暗中看到。 请点击这里下载这部电影。

补充电影3:左眼运动的肌肉神器。本文描述的方法能够辨别肌肉神器和癫痫排泄物。虽然这种周期性的大振幅波可能与癫痫发作混淆，但它与左眼运动同时发生，因此更有可能由肌肉活动引起。请点击这里下载这部电影。

补充电影4:左眼眨眼的肌肉神器。视频 EEG 录制能够检测 EEG 上的眨眼，并确定它与视频中看到的眼睛闪烁同时发生。眼睛闪烁侧向到左侧的 EEG 引线。请点击这里下载这部电影。

补充电影5:肌肉神器从下颚肌肉。 视频 EEG 能够检测头部和颈部小肌肉的运动。视频对于确定这种运动是肌肉而不是癫痫从大脑排出的宝贵因素。正如预期的那样，与此运动相关的信号产生于腹线。 请点击这里下载这部电影。

补充电影 6: 舔肌肉文物。 EEG 追踪显示大节奏的锐波，可能与癫痫发作活动一致。视频显示，这些波是由舌头运动引起的，不是癫痫放电。不出所料，与此运动相关的信号来自腹线。 请点击这里下载这部电影。

补充电影7:肌肉制品从嘴运动。在三角洲范围内看到的新波与嘴的运动有关。重要的是，这可以通过在象波出现时对口腔运动的可视化来区分间歇性减慢继发性脑病。请点击这里下载这部电影。

补充电影 8: 肌肉文物从头转。 正面引线中看到的巨大、缓慢和瞬时幅度的降低与兔子头部的转动有关。必须指出，运动前没有癫痫放电。 请点击这里下载这部电影。

补充电影 9: 肌肉文物从头部延伸。 当兔子抬起头时，所有引线中都可以看到幅度的大幅、缓慢和瞬时增加。运动前没有癫痫放电。 请点击这里下载这部电影。

补充电影10:肌肉从头部弯曲。当兔子向下伸展头部时，可以看到所有引线的振幅大幅下降。运动前没有癫痫放电。请点击这里下载这部电影。

补充电影11:来自复杂运动的肌肉神器。 在约束器中，兔子进行复杂的运动，涉及它的头部和整个身体。这发生在基线记录期间，在给予任何引起癫痫发作的药物之前。这种快速发生的运动被记录为 EEG 上的高振幅和高频率爆发。此外，在前导中看到的有节奏的尖锐波是由于鼻子的运动，这可以被看到与视频上的波同步。 请点击这里下载这部电影。

补充电影 12: 大振幅的视频 Eeg 爆裂。 PTZ注射后，一些兔子在所有线索中都显示出EEG的间歇性减速。这些异常波通常与运动无关。虽然这些波在塔范围内的爆发不是典型的癫痫发作活动，它们与人类的脑病有关。 请点击这里下载这部电影。

补充电影 13: 多尖头的视频 Eeg 。 注射后、癫痫发作期间或术后期间可立即看到尖锐的波浪。这些发现与人类发现的结果相似，与癫痫发作活动有关。在多尖刺期间，右耳也被注意到抽搐，这是癫痫发作的物理表现。 请点击这里下载这部电影。

补充电影 14: 有节奏的伽马爆裂的视频 Eeg 。 高频爆发，如视频中显示的爆发，通常发生在产后时期，偶尔在低于PTZ剂量后发生。这些高频伽马爆发的生理原因尚不清楚。 请点击这里下载这部电影。

补充电影 15: 视频 Eeg 的后期泛泛 Eeg 抑制。 在后期，特别是在普遍的补品凝固性发作之后，所有线索中往往都抑制了 EEG。手术后时期的大振幅偏转是由肌质抽搐产生的肌肉神器引起的。 请点击这里下载这部电影。

补充电影16:电脑沉默的视频EG。此视频演示了此方法的高信号与噪声比。在最小的 EEG 活动中，EEG 不会发出任何升值信号。在确定脑死亡时间时，这种特异性很重要。此外，应该指出的是，脑死亡发生后，往往有剩余的心脏功能。请点击这里下载这部电影。

补充电影 17: 癫痫发作规模阶段 0 的视频 EEG 。 扣押量表旨在通过确定癫痫发作的扩散和持续时间来分级运动癫痫发作的严重程度。在第 0 阶段，没有可见的癫痫发作活动，尽管在 EEG 上可能看到癫痫放电。 请点击这里下载这部电影。

补充电影 18: 扣押规模阶段 1 的视频 EEG 。 扣押量表的第 1 阶段通过存在短暂的部分扣押来识别。一般部分癫痫发作仅限于头部，而不是任何其他身体部位。这可能表现为单头抽搐、单耳抽搐或其他与脑电图上癫痫放电相关的短暂、非节奏运动活动。 请点击这里下载这部电影。

补充电影 19: 扣押规模阶段 2 的视频 Eeg 。 扣押量表的第 2 阶段通过非持续的一般性扣押来识别。经常全身都会经历肌曲速抽搐。这不同于后期阶段缺乏节奏性。 请点击这里下载这部电影。

补充电影 20: 癫痫发作规模第 3 阶段的视频 EEG 。 扣押量表的第 3 阶段由持续、有节奏的癫痫发作识别，该发作仅限于头部的运动表现。显示的兔子有节奏的耳朵和眼睑抽搐。兔子经历一个短暂的全身肌曲张力抽搐，但没有进展到有节奏的全身抽搐。 请点击这里下载这部电影。

补充电影 21: 扣押规模第 4 阶段的视频 EEG 。 扣押量表的第 4 阶段通过持续、有节奏的癫痫发作来识别，该发作涉及整个身体。从视频中可以看出，兔子的身体与肌克隆有关，而耳朵、眼睛和头部的运动相对较少。 请点击这里下载这部电影。

补充电影 22: 癫痫发作规模第 5 阶段的视频 EEG 。 如果通过扣押的补品和凝血阶段的存在来识别，则扣押量表的最后阶段。最初是整个身体的无组织运动。接下来是补品阶段，然后是癫痫发作的克隆阶段，直到癫痫发作解决。偶尔兔子在这个阶段后会经历突然死亡，但很少在癫痫发作后死亡。 请点击这里下载这部电影。

这种实验设置有助于在兔子中，特别是在心脏和/或神经元疾病模型中，提供详细的同步视频-EEG-ECG-氧化-量谱记录和分析。本文结果表明，该方法能够检测癫痫发作和心律失常，并区分它们与电图文物。给兔子一个刺激性，诱导癫痫发作时，会得出预期的结果。从视频 EEG 录音中获得的数据能够进一步分析，以区分自愿运动与电机癫痫发作和脑电图异常（包括幻觉驱动反应、脑病和癫痫放电）的日益严重程度。各种类型的癫痫排泄物进一步特征化，并与运动活动相关。心电图分析表明，一种产生高信号噪声比的方法，允许识别和量化心脏周期的每个电相关性。这种方法还能够检测心脏异常的存在，包括过早心室复合体、胸腔心动过速、心脏阻塞、心动过速、心律失常和无囊。开发一种强有力的方法来进一步研究多系统疾病的神经-心脏相互作用，为更好地了解这些疾病提供了必要的重要技术进步。此外，随着时间的推移，对呼吸功能的监测有助于更好地了解癫痫发作后的呼吸衰竭及其对突然死亡的贡献。

这一设置也为药物研究（如心脏安全测试）提供了一个强大的系统。采用这些技术的研究项目能够实时调查神经元、心脏和呼吸表现之间的相互作用。虽然已经对啮齿动物的心脏进行了许多研究，但兔心的结果更适合转化研究，因为离子通道表达、行动潜力特性和心电图测量与人类相似。由于这是一种临床上使用的视频-EEG-ECG设置，将来同样的设计可以应用于大型哺乳动物，如猪、狗或羊。此外，此记录设置可用于自由移动的兔子的颅内 EEG 监测，从而在各种生理状态、围绕自发神经-心脏事件和突然死亡之前进行更广泛的记录。这些方法对于阐明SUDEP的机理和寻找治疗大脑和心脏疾病的新疗法将非常宝贵。

本文中提出的协议有许多关键步骤，必须遵循这些步骤才能生成具有高信号与噪声比的数据。重要的是，在实验开始前，兔子必须固定在约束器中，以限制可能导致脊柱损伤的大身体运动。所有电极都经过信号质量检查。如果所有电极都发出噪音，则可以更换参考电极以改善信号。如果单个电极是嘈杂的，那么一个电极应该被推入皮肤更深或去除并重新植入。在实验过程中，兔子的移动可能导致电极被移位。尽快更换电极，以免妨碍相机的视图，以便仍能从实验中收集数据。

本研究中概述的方法的一个优点是，它有助于调查人员筛选大量动物，并且具有成本效益。此协议存在局限性。虽然，很少有研究专门研究约束对兔子的生理影响，但我们发现兔子对约束的耐受性非常好。许多对听觉系统的研究都是在光约束下对醒兔进行的。在这种情况下，兔子安静地坐了几个小时，没有任何压力^{或不适的迹象}。被放入约束器后，兔子很少试图逃离约束物。它们表现出接近基线的心率，并且经常会入睡，如 EEG 上存在睡眠主轴所指出。兔子不表现出视觉，心率，或任何其他表现，表明他们的压力。

未来的方向是开发遥测电子EG和心电图记录系统。这将允许在各种生理状态下进行更详细的分析，检测自发性癫痫发作，以及癫痫突然意外死亡之前的神经-心脏变化级联（SUDEP）。由于技术限制和兔子中关于EEG的文献相对缺乏，首先提出了这种方法。为了使这种方法适应自由移动的兔子，它需要连续的视频监测、颅内EEG植入物和皮下心电图电极。然而，慢性呼吸封顶术是不可行的。由于机构规定（IACUC），该方法用于在限制器中≤5小时的录音。在啮齿动物中，通常使用挑衅性措施来评估发作的阈值、动力学和类型，如发热、听觉、最大电击、过度通风、睡眠剥夺和药物诱发性癫痫发作16、40、41、42、43。本议定书将允许对上述任何挑衅性措施进行测试。

作者没有什么可透露的。

作者承认这项研究得到了美国心脏协会、美国癫痫学会和SUNY上州市药理学系的资助。