Un modèle immunologique pour la transplantation héterotopique de cellules cardiaques et cardiaques chez les rats

Nous décrivons un modèle de transplantation abdominale hétérotopique de coeur chez les rats, impliquant des modifications des stratégies actuelles, qui mènent à une approche chirurgicale simplifiée. En outre, nous décrivons un modèle de rejet nouveau par l’injection dans l’oreille des cellules cardiaques vitales de muscle, permettant d’autres analyses immunologiques de greffe chez des rats.

La transplantation héterotopique de coeur chez les rats a été un modèle couramment employé pour diverses études immunologiques pendant plus de 50 années. Plusieurs modifications ont été signalées depuis la première description en 1964. Après 30 ans d’exécution de la transplantation hétérotopique de coeur chez les rats, nous avons développé une approche chirurgicale simplifiée, qui peut être facilement enseignée et exécutée sans formation chirurgicale ou fond ultérieur.

Après dissection de l’aorte ascendante et de l’artère pulmonaire et de la ligature des veines cavales et pulmonaires supérieures et inférieures, le cœur du donneur est récolté et perfusé par la suite avec la solution saline glacée complétée par de l’héparine. Après avoir serré et incisiné les vaisseaux abdominaux receveurs, l’aorte ascendante et l’artère pulmonaire du donneur sont anastomosed à l’aorte abdominale destinataire et le cava inférieur de vena, respectivement, utilisant des sutures continues de fonctionnement.

Selon différentes combinaisons donneur-bénéficiaires, ce modèle permet d’analyser le rejet aigu ou chronique des allografts. La signification immunologique de ce modèle est encore renforcée par une nouvelle approche de l’injection intra-auriculaire des cellules cardiaques vitales de muscle et l’analyse ultérieure du tissu lymphatique cervical drainant.

La transplantation cardiaque hétérotopique est un modèle expérimental fréquemment utilisé pour différentes investigations concernant la tolérance de transplantation, le rejet aigu et chronique d’allogreffe, les dommages d’ischémie-réperfusion, la perfusion de machine ou le remodelage cardiaque. Entre autres avantages, la fonction de greffe peut être surveillée non invasivement par palpation et l’échec de greffe ne conduit pas à une déficience vitale du receveur en contraste avec d’autres organes, tels que les reins ou les foies.

En 1964, Abbott et coll. ont d’abord décrit la transplantation héterotopique abdominale de coeur chez les rats¹. Plus tard, en 1966, la technique de bout en bout pour les anastomoses a été décrite par Tomita et coll.². Le travail de base pour le modèle actuellement utilisé a été rapporté par Ono et Lindsey en 1969³. Au cours des dernières décennies, plusieurs modifications ont été publiées pour créer différents types de greffes de cœur ventriculaire gauches déchargées, partiellement chargées ou chargées, y compris la transplantation cardiaque-poumon hétérotopique^{combinée 4,5,,6}. Pour les analyses immunologiques, une transplantation de greffe de coeur chargée non-volume est le plus couramment effectuée. Dans ce cas, le flux sanguin pénètre rétrogradement dans l’aorte ascendante de donneur et par la suite les artères coronaires. Le drainage veineux se produit le long du sinus coronaire dans l’oreillette et le ventricule droit(figure 1A-B). Par conséquent, le ventricule gauche est exclu du flux sanguin, en dehors des quantités marginales de sang des veines de Thèbes. Cela en fait également un modèle utile pour étudier les mécanismes pathophysiologiques pendant la thérapie gauche ventriculaire dispositif d’assistance⁷.

La transplantation cardiaque hétérotopique a été effectuée chez diverses espèces, y compris les souris, lapins, porcs et a même été utilisé comme un dispositif d’assistance uni- ou biventriculaire chez l’homme^8,9,10,11. Le rat représente toujours un animal expérimental populaire pour les modèles de transplantation, d’autant plus que les temps de survie de greffe pour différentes combinaisons de souches de rat ont été bien définis dans le passé et un grand nombre de réactifs immunologiques sont accessibles^12,13. Contrairement aux souris, les rats sont plus grands faisant la chirurgie et l’accès au tissu lymphatique pour des analyses immunologiques plus^{faisables 12}. En outre, l’introduction de technologies commerciales de clonage chez les rats ces dernières années conduira très probablement à un intérêt récurrent pour les modèles de rat expérimental¹⁴.

En général, les greffes cardiaques hétérotopiques peuvent être fixées aux vaisseaux receveurs en effectuant une anastomose cervicale ou abdominale. Cependant, quelques études suggèrent qu’une anastomose fémorale facilite une meilleure surveillance en raison d’un meilleur accès pour la palpation manuelle ou l’échocardiographie transfemorale et permet ainsi une détection plus précise de l’échec de greffe^15,16.

Il a été démontré qu’il n’y a aucune différence en ce qui concerne le temps d’opération, le taux de complication, les résultats et le temps de survie de greffe entre les deux techniques d’anastomose¹⁷. De toute évidence, la disponibilité d’un nombre suffisant de ganglions lymphatiques drainants doit être mentionnée comme un avantage de l’anastomose cervicale; cependant, des périodes d’entraînement plus longues sont nécessaires. En revanche, l’anastomose abdominale est moins compliquée et également valable pour les investigations immunologiques, particulièrement lorsqu’elle est combinée avec des résultats d’une nouvelle méthode d’injection dans l’oreille des cellules cardiaques allogenic et lymphadenectomy cervical suivant. Une combinaison des deux modèles offre un large éventail d’analyses immunologiques post-interventionnelles.

Le protocole suivant se réfère à l’opération en paires de chirurgiens afin de réduire le temps d’ischémie. Cependant, toutes les expériences peuvent être effectuées par une seule personne. La configuration d’instruments et de matériaux pour l’explantation et l’implantation cardiaque est affichée dans la figure 2A-B.

Toutes les expériences animales ont été réalisées conformément aux directives du Comité local d’examen des animaux d’éthique des autorités régionales pour la protection des consommateurs et la sécurité alimentaire de Basse-Saxe (LAVES, Oldenburg, Allemagne) avec l’approbation des 12/0768 et 17/2472.

1. Explantation et perfusion cardiaque

REMARQUE : Comme les donneurs de greffe, les rats femelles ou mâles à un âge de 7-22 semaines ont été employés.

1. Anesthésiez le rat donneur par inhalation d’isoflurane (induction à 5% et entretien à 3% avec un flux O₂ de 1 L/min). Injecter 5 mg de carprofène sous-cutanée par kg de poids corporel pour l’analgésie périopératoire et vérifier l’absence du réflexe de retrait de pincement d’étteil.
2. Appliquer le lubrifiant pour les yeux et enlever la fourrure abdominale et thoracique à l’aide d’une tondeuse mécanique.
3. Placer le donneur en position de supine, fixer les membres à la base de la table d’opération avec des bandes élastiques et stériliser la peau avec 70% d’éthanol ou une autre alternative suffisante.
4. Incisez la peau dans la direction longitudinale et après l’application de l’anesthésique local (p. ex., la lidocaïne 0,2 %) effectuer une laparotomie médiane à l’aide de ciseaux.
5. Insérez les rétracteurs, mobilisez l’intestin à gauche du donneur et exposez le cava de vena inférieur avec des cotons-tiges stérilisés.
6. Pour l’anticoagulation, injecter 500 I.U. d’héparine dissous dans 1 ml de solution saline isotonique glacée par voie intraveineuse en perforant le cava vena inférieur. Arrêtez le saignement au site de perforation par compression légère avec un coton-tige après rétractation de l’aiguille(figure 3A).
7. Incisez le diaphragme et effectuez la thoracotomie latérale aux deux côtés du donneur.
8. Épinglez le mur ventral mobilisé du thorax sur la table d’opération.
9. Retirez le péricarde et le nerf vagal par préparation émoussée à l’aide de deux porte-aiguilles micro.
10. Effectuer la transection des vaisseaux abdominaux afin d’exsanguinate le donneur et décharger le cœur.
11. Insérez la branche émoussée d’une sonde aux ciseaux pointus dans le sinus péricardique transversal et séparez l’aorte ascendante et l’artère pulmonaire aussi distale que possible sous la traction cautale légère du cœur avec une compresse mouillée(figure 3B).
12. Placez une seule ligature 5-0 autour du vena cava supérieur et inférieur et les veines pulmonaires et serrez-le aussi dorsal que possible (figure 3C).
13. Coupez le tissu dorsale à la ligature et extrayez le cœur (figure 3D).
14. Perfusez le cœur explanté avec une canule de 18 G à partir d’un cathéter intraveine à travers l’aorte ascendante et l’artère pulmonaire avec 30 ml de glace froide, solution saline isotone complétée par 1000 I.U. d’héparine et placer le cœur dans un tube de 15 mL rempli de solution saline sur la glace (Figure 3E-F).

2. Implantation cardiaque

REMARQUE : En tant que destinataires, des rats femelles ou mâles de 10 à 14 semaines ont été utilisés. Les donneurs et les receveurs étaient à peu près appariés.

1. Effectuez l’anesthésie du rat destinataire en utilisant également l’inhalation d’isoflurane (induction à 5% et entretien à 1,5-2% avec un flux O₂ de 1 L/min). Injecter 5 mg de carprofène sous-cutanée par kg de poids corporel pour l’analgésie périopératoire et vérifier l’absence du réflexe de retrait de pincement d’étteil.
2. Appliquer le lubrifiant pour les yeux, enlever la fourrure abdominale, fixer les membres et stériliser la peau de façon analogue à la préparation du donneur. Pour des résultats postopératoires optimaux, effectuez l’opération sur un tapis de chauffage pour prévenir l’hypothermie peropératoire.
3. Après l’incision longitudinale de la peau, appliquez un anesthésique local, tel que la lidocaïne (0,2 %), sur le fascia abdominal. Ouvrez la cavité abdominale par la laparotomie médiane et insérez les rétracteurs.
4. Mobiliser l’intestin vers le côté supérieur gauche du receveur et le placer dans une compresse chaude et mouillée.
5. Après avoir mobilisé le duodénum et le jejunum proximal, respectivement, à l’aide du microscope chirurgical (ou des lunettes grossissantes) avec un grossissement 5-7x, exposer l’aorte abdominale et le vena cava inférieur par préparation émoussée avec des cotons-tiges. Ne séparez pas les vaisseaux abdominaux.
6. Élever les vaisseaux abdominaux à l’aide de deux micro-porte-aiguilles sans blesser les veines lombaires et positionner la pince vasculaire Cooley(figure 4A).
7. Perforez les vaisseaux abdominaux avec une canule arquée de 27 G(figure 4B).
8. Agrandir le site de perforation à l’aide de ciseaux Potts pour créer une incision longitudinale qui correspond à la taille des lumen des vaisseaux donneurs(figure 4C-D) et perfuser les vaisseaux destinataires avec une solution saline afin d’enlever les caillots et de prévenir la thrombose postopératoire.
9. Placez la greffe dans le situs et fixez l’aorte ascendante du donneur à l’aorte abdominale du receveur par deux points interrompus simples (8-0 monofilament suture non résorbable) au coin crânien et caudal de l’incision longitudinale(figure 4E).
10. Anastomose l’aorte ascendante du donneur avec l’aorte abdominale du receveur par un 8-0 en cours d’exécution suture monofilament en deux étapes: premièrement, placez la greffe à droite des vaisseaux destinataires et effectuez la première moitié de l’anastomose(figure 4E). Par la suite, placez la greffe à gauche des vaisseaux destinataires et effectuez la deuxième moitié de l’anastomose(figure 4F).
11. Fixer l’artère pulmonaire du donneur au cava inférieur de vena analoguement à l’anastomose aortale (8-0 monofilament suture non résorbable). Suture la première moitié de l’anastomose veineuse du côté intraluminal du vaisseau(figure 4G-H).
12. Rincer les anastomoses avec saline directement avant de resserrer les noeuds pour prévenir l’embolie périphérique.
13. Placez une gaze hémostatique autour des deux anastomoses et relâchez soigneusement la pince vasculaire de Cooley de sorte que la répafusion de la greffe puisse commencer. Manipuler les saignements le long des anastomoses par compression légère avec des cotons-tiges stérilisés.
    REMARQUE : La greffe devrait commencer à battre après environ 60 s.
14. Remplacez l’intestin dans un méandre comme la mode. Assurez-vous qu’il n’y a pas de malrotations du radix mésensèque pour prévenir la nécrose intestinale ou l’obstruction mécanique.
15. Fermez les muscles abdominaux/fascia et la peau séparément à l’aide de sutures continues de polyfilament 3-0.

3. Soins postopératoires

1. Pour l’analgésie postopératoire, fournir aux destinataires une injection sous-cutanée supplémentaire de 5 mg de carprofène par kg de poids corporel le premier jour postopératoire (POD). En outre, ajouter 1 g de Metamizol à 500 ml d’eau potable jusqu’à la troisième POD.
2. Commencez à surveiller la fonction de greffe cardiaque par palpation abdominale quotidienne sur le troisième POD.
   REMARQUE : En cas d’échec de greffe avant le troisième POD, une insuffisance chirurgicale plutôt qu’immunologique devrait être considérée. Cependant, cela dépend bien sûr de la combinaison de souches choisie et du modèle immunologique respectif (p. ex., rejet hyperacute après la vaccination préalable).
3. Après le rejet de greffe, extraire des tissus comme les ganglions lymphatiques rétropétonéaux drainants crâniens des anastomoses, de la rate, du sang, du thymus et de la greffe pour d’autres analyses immunologiques par cytométmétrie de débit ou immunohistochimie.

4. Digestion enzymatique du cœur et injection sous-cutanée des cellules cardiaques de l’oreille

1. Effectuez l’explantation et la perfusion cardiaque de façon analogue à la transplantation cardiaque hétérotopique (voir étape 1).
2. Badigeonné le cœur en blocs de 3 mm x 3 mm à l’aide d’un scalpel stérile ou de ciseaux stériles et incuber pendant 30 min à 37 oC en milieu de culture contenant 0,5 mg/mL collagenase.
   REMARQUE : Il est important d’employer le milieu de culture contenant la pénicilline, la streptomycine et la glutamine sans sérum foetal de veau (FCS) particulièrement pendant que FCS inhibe la digestion de collagène.
3. Ajouter le tissu digéré à un tamis à gros pored, tout en en enlevant le milieu de la culture et hacher soigneusement pour obtenir une suspension des cellules cardiaques vitales, la plupart du temps des cellules cardiaques simples mortes et des cellules sanguines restantes. Laver la suspension cellulaire deux fois avec une solution saline isotonique stérile.
   REMARQUE : Paramètres de centrifugation : 10 min, 200 x g, 20 oC
4. Filtrer la suspension à l’aide d’une passoire cellulaire de 40 m et recueillir les congeries cellulaires vitales en rinçant la passoire cellulaire avec 5-10 ml de solution saline isotonique.
5. Après centrifugation, réanimer les cellules du muscle cardiaque en solution saline dissoute à une concentration de 5x10⁵ cellules/mL et tirer la solution cellulaire vers le haut dans une seringue de 1 mL.
6. Effectuez une anesthésie analogue au protocole décrit pour la narcose bénéficiaire (voir étape 2) pour la transplantation cardiaque hétérotopique.
7. Placez le destinataire dans une position latérale et fixez l’oreille avec un doigt à l’aide de ruban double(figure 5A).
8. Injecter 20 lil de la solution de cellules de muscle cardiaque (contenant 1 x 10⁴ cellules) par l’intermédiaire d’une canule de 27 G s.c. près des vaisseaux capillaires visuels dans l’oreille du receveur(figure 5B).
9. Après une période d’observation définie (selon la combinaison de souches choisie et la force de rejet), extraire les ganglions lymphatiques cervical drainants et effectuez d’autres analyses telles que la cytométrie du débit ou les co-cultures(figure 5C).
   REMARQUE : En outre, l’analyse histologique du pinna peut être effectuée pour déterminer l’infiltration de cellules.

Dans le passé, différentes questions immunologiques ont été abordées sur la base du modèle, qui a été validé dans le groupe de travail par plus de 500 greffes avec un taux de survie de plus de 95%^{13,18,19,20,21,22,23,24}. Les temps de fonctionnement totaux (y compris l’explantation et l’implantation de greffe) ne dépassaient habituellement pas 60 minutes, alors que les temps combinés d’ischémie froide et chaude étaient d’environ 30 minutes. Les combinaisons de souches appliquées étaient principalement basées sur le fond de Lewis (Lew). Les greffes syngéniques ont survécu jusqu’à 100 jours sans signes d’échec de greffe, mais réduction significative de poids et de taille sur l’explantation de greffe. Plus récemment, nous avons effectué la transplantation cardiaque hétérotopique dans deux combinaisons différentes de donneur-bénéficiaire simulant un modèle de rejet rapide et prolongé : Lew.1a - Lew wt menant au rejet rapide (temps de survie moyen de 7,4 jours) et Lew.1u-7B Lew.1a menant à un rejet plus prolongé (temps de survie moyenne de 42,5 jours) (figure 6). Macroscopiquement, les greffes rejetées ont montré une thrombose accompagnée d’une décoloration et d’un gonflement livides, tandis que les greffes non rejetées montrent une atrophie distincte, probablement en raison d’un ventricule gauche déchargé. En outre, nous avons rédigé des sections cryostat des cœurs transplantés afin de détecter l’infiltration cellulaire à l’aide d’une méthode alcalin phosphatase-antialkaline phosphatase (APAAP). Des cadres simples avec un grossissement 50x ont été fusionnés à une image composite, donnant un aperçu de la greffe complète et la distribution des cellules infiltrées. L’analyse histologique a montré une infiltration accrue de cellules immunitaires (par exemple, CD4^,TCR, ou NKR-P1A/B) dans les greffes allogéniques, tandis que les greffes syngéniques étaient en grande partie exemptes d’infiltration cellulaire(figure 7A-C).⁺

La lymphadenectomie cervicale et les essais de re-stimulation des cellules de ganglion lymphatique drainants après injection d’oreille des cellules cardiaques de muscle cardiaque dans les combinaisons de souches mentionnées ci-dessus ont indiqué des réponses immunitaires spécifiques aux souches distinctes vers le tissu cardiaque allogénique et ont permis d’autres analyses immunologiques, telles que le profilage de cytokine(figure 8A-C).

Figure 1 : Présentation schématique des anastomoses de bout en bout et du flux sanguin qui en résulte à travers le cœur. Après anastomosing le donneur ascendant aorta bout à côté de l’aorte abdominale destinataire et analoguement l’artère pulmonaire au vena cava inférieur de destinataire (A), le flux sanguin pénètre dans les artères coronaires par l’aorte ascendante. Le drainage veineux se produit par l’intermédiaire du coronarius sinus dans l’oreillette et le ventricule droit et par l’artère pulmonaire dans le vena cava inférieur de destinataire (B). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Instruments et matériaux chirurgicaux requis. (A) Explantation: 1: bande élastique de membre, 2: rétracteurs, 3: 5-0 ligature, 4: ciseaux pointus de sonde, 5-6: micro porte-aiguilles, 7: ciseaux, 8: forceps chirurgicaux, 9: micro forceps, 10: lubrifiant pour les yeux, 11: compresses, 12: coton-tiges, 13: base de perfusion, 14: solution saline sur glace. (B) Implantation: 1: bande élastique de membre, 2: rétracteurs, 5-6: porte-aiguilles micro, 7: ciseaux, 8: forceps, 9: micro forceps, 10: lubrifiant pour les yeux, 11: compresses, 12: coton-tiges, 15: micro ciseaux, 16: micro forceps, 17: ciseaux Potts, 18: porte-aiguille, 19: canule arquée, 20: pince vasculaire Cooley, 21: 8-00 sutures monofilament, 22: gaze hémostatique, 23: 3-0 sutures de polyfilament, 24: plat Petri, 25: Carprofène (5 mg/mL), 26: anesthésique local (lidocaine 0,2%), 27: solution saline. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Explantation cardiaque. Après l’héparinisation (A), la thoracotomie est effectuée et l’aorte ascendante et l’artère pulmonaire sont sectionnées aussi distal que possible (B). Avec une seule ligature pulmonaire et les deux veines de cavalerie sont occluded (C) et le cœur est retiré de la cavité thoracique (D). (E) montre le cœur avant et (F) après perfusion avec 30 mL solution saline contenant de l’héparine. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Implantation cardiaque. Après l’exposition des vaisseaux abdominaux et le placement d’une pince vasculaire Cooley (A) les vaisseaux sont cannulés (B) et une incision longitudinale est effectuée à l’aide de ciseaux Potts (C-D). L’aorte ascendante du donneur est fixé avec un noeud chacun dans le coin crânien et caudal de l’incision de l’aorte abdominale bénéficiaire (E) et l’anastomose est effectuée par des sutures en cours d’exécution en continu (E-F). Notez que la greffe est placée sur le côté droit des vaisseaux pour la première moitié de l’anastomose (E) et sur le côté gauche des vaisseaux pour la deuxième moitié de l’anastomose (F) et l’anastomose veineuse suivante. La première moitié de l’anastomose veineuse est effectuée par une suture intraluminale (G). Après avoir terminé la seconde moitié de l’anastomose veineuse, la greffe est prête pour la réperfusion (H). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : Injection intra-aurtique de cellules musculaires cardiaques allogéniques. Après avoir fixé l’oreille du receveur sur un doigt à l’aide de ruban double(A)allogenic cellules musculaires cardiaques vitales sont injectés sous-cutanée près des vaisseaux capillaires visuels (B). Après une période d’observation drainant les ganglions lymphatiquescervicals( ) sont extraits (C). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6 : Survie cardiaque dans différentes combinaisons synogènes et allogéniques donneur-bénéficiaire. L’analyse Kaplan-Meier montre la survie du modèle de rejet rapide syngénique (n-10; du modèle de rejet prolongé n'5) et des greffes allogéniques (modèle de rejet rapide n'11; n '14 modèle de rejet prolongé). Dans le modèle prolongé de rejet six de 14 destinataires ont atteint la fin de la période d’observation (60 jours) sans échec de greffe, menant à une survie prolongée de greffe dans ce groupe. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7 : Analyse histologique des greffes cardiaques syngéniques et allogéniques. (A-B) montrent l’infiltration de cellules CD4^à l’aide de la méthode de coloration APAAP dans une greffe syngénique (A) et une greffe allogénique lors du rejet (B). (C) présente l’augmentation de l’infiltration cellulaire dans les greffes allogéniques par rapport aux greffes syngéniques (servant de groupe de référence) pour différents sous-ensembles de cellules immunitaires. La classification appliquée à la quantification de l’infiltration cellulaire a été modifiée à partir de Hirschburger et coll.²⁵: 0 - infiltration comparable aux greffes syngéniques; 0,5 - légère augmentation des cellules tachées dans les sections de tissu isolé; 1 - augmentation des cellules tachées singulières sur toute la section tissulaire; 1.5 - augmentation des grappes de cellules tachées réparties uniformément sur toute la section tissulaire; 2 - forte; 2,5 - très fort; 3 - augmentation la plus forte des grappes de cellules tachées dans toute la section tissulaire. Les sections histologiques des greffes ont été analysées à l’aide d’un grossissement 50x. Cinq greffes par groupe (syngénique et allogénique, respectivement) ont été incluses dans l’analyse. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8 : Analyse des cellules des ganglions lymphatiques drainants après injection intra-aurogène des cellules musculaires cardiaques. Re-stimulation spécifique (avec 2 x 10⁵ ratenocytes de la souche de donneur respective) de 2 x 10⁵ lymphocytes récoltés à partir de ganglions lymphatiques urèbres ou mésentériques (LN) de rejet rapide Lew wt et Les destinataires prolongés de Rejet de Lew.1a ont montré la prolifération sensiblement réduite des cellules drainantes de ganglion lymphatique dans les destinataires de Lew.1a (A), alors que la capacité de prolifération en général était toujours observable après stimulation non spécifique avec l’anticorps CD3/CD28 (B). Étonnamment, le profilage de cytokine a indiqué une augmentation des cytokines inflammatoires dans les ganglions lymphatiques des destinataires de rejet prolongés (C). Les résultats sont présentés comme moyen - SEM d’au moins 4 animaux par groupe. L’importance est indiquée avec ' pour p-valeurs '0.05 et '' pour p-valeurs '0.0001. (Ce chiffre a été modifié à partir de Beetz et al.²⁴). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

La méthode précédemment décrite de la transplantation cardiaque hétérotopique chez les rats est principalement basée sur la description d’Ono et Lindsey en 1969³. Depuis lors, plusieurs modifications ont été introduites chez diverses espèces, ce qui a conduit à une grande diversité de ce modèle. Combinant plusieurs de ces modifications et introduisant notre propre expérience résultant de plus de 30 ans d’exécution des transplantations cardiaques hétérotopiques en laboratoire, nous avons créé une approche chirurgicale faisable, qui ne nécessite pas de longues périodes d’entraînement ou de fond chirurgical. Dans ce qui suit, nous discuterons des limites générales de ce modèle et soulignerons les étapes critiques du protocole. En outre, nous metrons l’accent sur les avantages de combiner la transplantation cardiaque hétérotopique avec une nouvelle méthode d’injection dans l’oreille des cellules cardiaques de muscle.

Anesthésie et complications générales
Bien qu’il ait été rapporté que l’anesthésie isoflurane est supérieure à l’anesthésie d’injection concernant la survie tôt après la transplantation héterotopique de coeur, la dépression respiratoire peropératoire représente toujours l’une des complications les plus communes et exige donc une gestion soigneuse de narcosis²⁶. Au lieu de l’explantation et de l’implantation de greffe série, respectivement, nous conseillons de commencer la préparation du receveur et des vaisseaux abdominaux immédiatement après la thoracotomie de l’animal donneur, en particulier parce que les temps d’opération de moins d’une heure sont associés à un meilleur résultat concernant la greffe et la survie du receveur^26,27. Outre des complications déjà mentionnées telles que l’hypothermie due à de longs temps d’exploitation et des tapis de chauffage manquants, et la nécrose intestinale ou l’obstruction par le placement nonphysiologique de l’intestin, une parésie des membres d’entrave représente une complication supplémentaire, qui peut être empêchée par le clampage vasculaire atraumatique et le rinçage complet des anastomoses pour éviter l’embolie périphérique^28,29.

Ligature des veines pulmonaires et cavales et des complications de saignement
Afin de réduire le temps chaud d’ischémie, nous utilisons une ligature simple pour les deux veines cavales et les quatre veines pulmonaires. Comme complication possible résultant d’un placement trop proximale/ventral de la ligature, la perturbation du backflow veineux par occlusion du coronarius de sinus doit être mentionnée. En cas de saignement grave après l’ablation de la pince Cooley et le battement visible de la greffe, la ligature doit être vérifiée pour l’insuffisance immédiatement. Nous avons observé ce type de complication surtout si la dissection des veines pulmonaires a été exécutée trop près de la ligature tout en enlevant la greffe de la cavité thoracique. Sinon, le saignement grave est principalement causé par l’insuffisance des anastomoses vasculaires. En outre, une artère coronaire qui longe l’aorte ascendante qui est souvent sectionnée pendant l’explantation est décrite pour causer des saignements mortels lors de la réperfusion²⁷.

Heure ischémique et perfusion
Quel que soit le modèle de transplantation, il est toujours indispensable de réduire le temps d’ischémie, d’autant plus que le cœur est considéré comme un organe vulnérable en ce qui concerne les dommages à l’ischémie. En effectuant une chirurgie avec deux chirurgiens, nous sommes en mesure d’atteindre un minimum de temps ischémique chaud et froid et donc renoncer à l’utilisation de solutions cardioplégiques afin de réduire les dommages ischémiques-réperfusion³⁰. Généralement, la perfusion de la greffe joue un rôle clé et est essentielle pour refroidir la greffe et enlever les cellules sanguines, ce qui pourrait entraîner une thrombose ou une embolie. Alors que les faibles pressions de perfusion conduisent à une perfusion insuffisante et donc à un retrait incomplet des cellules sanguines, des pressions de perfusion élevées peuvent causer des dommages endothéliaux^31,32. Nous conseillons la perfusion de l’artère pulmonale ainsi que l’aorte ascendante jusqu’à ce que les artères coronaires soient visiblement rincées.

Incision des vaisseaux destinataires
Une étape critique dans le protocole constitue l’incision des vaisseaux destinataires sans endommager la paroi postérieure des vaisseaux : Schmid et coll. ont décrit l’avantage de l’aortotomie ou de la venotomie effectuant une petite incision transversale suivie d’un élargissement longitudinal dans la direction crânienne et caudale, ce qui conduit encore à une diminution du taux de sténose de l’anastomose aortale³³. Dans notre modèle, les vaisseaux destinataires sont perforés à l’aide d’une petite canule. Ensuite, le site de perforation est agrandi en utilisant des ciseaux Potts pour créer une incision longitudinale. Pour une meilleure faisabilité, nous recommandons de plier la pointe de la canule à un angle de 30-45 degrés, ce qui entraîne une diminution du risque d’endommager la paroi postérieure des navires. Nous n’avons observé de sténoses vasculaires cliniquement pertinentes dans aucun de nos receveurs. Des avantages similaires de l’ouverture des vaisseaux receveurs en perforant l’aorte abdominale et le cava de vena inférieur avec une canule ont été décrits par Shan et al.³⁴.

Maîtriser le modèle de transplantation cardiaque hétérotopique
Au cours de la dernière décennie, le modèle a été exécuté par des chercheurs du département avec peu ou pas d’antécédents chirurgicaux. Comme indiqué ci-dessus, nous opérons par paires de chirurgiens, tandis que le chercheur le plus expérimenté est chargé de garantir le succès de la transplantation et en même temps d’améliorer progressivement l’ensemble des compétences du chercheur inexpérimenté. Après une courte période d’entraînement d’une dizaine d’explantations et d’implantations de greffe chez les animaux morts, le chercheur non inexpérimenté est chargé d’effectuer l’explantation cardiaque et d’aider l’implantation de greffe chez une dizaine d’animaux vivants. Par la suite, le chercheur inexpérimenté effectue activement les anastomoses vasculaires, de sorte qu’après environ dix autres transplantations, l’ancien chercheur inexpérimenté est généralement capable d’effectuer toutes les étapes critiques du modèle.

Appliquant ce concept de formation, les publications passées de notre département utilisant la transplantation cardiaque hétérotopique chez les rats n’ont montré aucune différence concernant la morbidité, la mortalité ou la fonction de greffe en dépit de plusieurs équipes différentes de chirurgiens^{13,18,19,20,21,22,23,24}.

Il est à noter que l’exécution des anastomoses vasculaires représente l’étape la plus critique de ce protocole et des modèles de greffe d’organes solides en général. Nous recommandons donc des périodes d’entraînement prolongées à l’aide d’animaux morts jusqu’à ce que les anastomoses soient exécutés de façon précise et rapide, surtout si un chercheur expérimenté n’est pas disponible pour obtenir des conseils chez les animaux vivants.

Avantages et inconvénients généraux du modèle
Alors que l’induction spontanée de tolérance est souvent décrite comme un phénomène dans la transplantation de foie et également observée dans la transplantation rénale, le coeur est considéré comme un organe plutôt immunogène et permet ainsi le rejet fiable dans les modèles de greffe^35,36. Contrairement à ces résultats, nous pourrions également remarquer la survie à long terme et l’absence de rejet après la transplantation hétérotopique de coeur dans certaines combinaisons de donneur-bénéficiaires en dépit de la disparité complète majeure de complexe d’histocompatibilité.

Une critique souvent mentionnée de la transplantation hétérotopique de coeur est la subjectivité de la surveillance de greffe par palpation manuelle. Par conséquent, le modèle a été étendu aux techniques d’anastomose fémorale afin de faciliter l’accès à la palpation et d’introduire d’autres techniques de surveillance telles que l’échocardiographie transfemorale^15,16. D’autre part, Mottram et coll. ont démontré que la surveillance de la greffe par palpation corrèle bien avec les mesures électrocardiographiques³⁷. Ainsi, la palpation manuelle dans les greffes hétérotopiques de coeur semble suffisante pour surveiller la fonction de greffe dans un modèle aigu de rejet.

En conséquence du placement hétérotopique et du déchargement ventriculaire gauche, le coeur ne fonctionne pas dans des conditions anatomiques ou physiologiques en supposant que cela n’a pas d’impact sur les analyses immunologiques. Contrairement à cette hypothèse, il avait été démontré que le remodelage cardiaque résultant du déchargement ventriculaire gauche pendant la thérapie gauche ventriculaire de dispositif d’assistance mène à une libération diminuée de cytokine^38,39. D’autre part, Tang-Quan et coll. ont décrit le réglage déchargé comme une approche plus appropriée pour l’analyse immunologique, puisque des dommages ischémiques à long terme de la greffe résultant de la perfusion avec le sang partiellement désoxygéné dans le modèle ventriculaire chargé gauche a été observé⁴⁰.

Bien que le placement abdominal des greffes offre des avantages chirurgicaux en termes de praticabilité, il est difficile de récolter un nombre suffisant de ganglions lymphatiques rétropétonéaux drainants sur le rejet de greffe altérant d’autres analyses. Pour cette raison, nous avons introduit une nouvelle méthode d’injection intra-auriste de cellules musculaires cardiaques allogéniques. Issu de la recherche parasitologique, ce concept n’a pas été appliqué pour des analyses immunologiques en transplantation, malgré sa faisabilité^41,42. L’avantage de ce modèle est la possibilité d’identifier et de récolter un nombre important de ganglions lymphatiques drainants, ce qui offre la possibilité d’effectuer des analyses immunologiques complexes. Il est à noter que les deux modèles pourraient être combinés dans un receveur offrant des informations supplémentaires sur les mécanismes de rejet et de tolérance dans la transplantation cellulaire et d’organe chez les rats.

Nos modèles de transplantation de coeur de rat et de cellules cardiaques de muscle représentent une approche praticable et bien étudiée et peuvent être exécutés sans formation chirurgicale ou fond plus loin. Face au fait que de nouvelles technologies de clonage pour les rats ont été introduites et développées récemment, ces modèles offrent de vastes possibilités pour les chercheurs immunologiques de transplantation.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous tenons à remercier Britta Trautewig, Corinna Lebbert et Ingrid Meder pour leur engagement.