Method Article
Cette étude rapporte une méthode efficace de la cellule adipeuse endoscopiques dérivée du tissu stromal (ADSC) feuillet transplantation pour la prévention de la sténose oesophagienne après une dissection étendue endoscopique sous-muqueuse (ESD) dans un modèle porcin.
Au cours des dernières années, la cellule-feuille construction a suscité un grand intérêt dans la médecine régénérative, notamment pour les procédures de chirurgie reconstructive. Le développement des technologies diversifiées, combinant des cellules stromales dérivées de tissu adipeux (ADSCs) avec diverses biomatériaux a conduit à la construction de nombreux types de substituts du génie tissulaire, tels que les os, le cartilage et les tissus adipeux de rongeurs, porcine ou ADSCs humaines. dissection prolongée oesophagienne endoscopique sous-muqueuse (ESD) est responsable de la formation de sténose de l'œsophage. la prévention des Rétrécissement reste difficile, sans traitements efficaces disponibles. Des études antérieures ont rapporté l'efficacité de la muqueuse cellulaire feuilles transplantation dans un modèle canin et chez les humains. ADSCs sont attribuées des propriétés anti-inflammatoires, des effets immunitaires locales de modulation, néovascularisation induction, et les capacités de différenciation en mésenchymateuses et lignées non-mésenchymateuses. Cette étude originale décrit la tra endoscopiquensplantation d'une construction de génie tissulaire ADSC pour empêcher sténose de l'œsophage dans un modèle porcin. La construction ADSC est composée de deux feuilles ADSC allogéniques en couches les unes sur les autres sur une membrane de support en papier. Les ADSCs ont été marqués avec le fluorophore PKH67 pour permettre endomicroscopie laser confocale à base de sonde (pCLE) suivi. Le jour de la transplantation, à 5 cm et une ESD hémi-circulaire connu pour induire œsophage a été réalisée. Les animaux ont été immédiatement transplantées par voie endoscopique avec 4 constructions ADSC. L'adhérence complète des constructions ADSC a été obtenu après 10 min d'application douce. Les animaux ont été sacrifiés au jour 28. Tous les animaux ont été transplantés avec succès. Transplantation a été confirmée le jour 3 avec une évaluation de pCLE positive. Par rapport aux animaux transplantés, les animaux témoins ont développé des sténoses sévères, avec grand développement du tissu fibrotique, trouble alimentaire plus fréquent, et le gain de poids réduit. Dans notre modèle, la transplantation de allogenic ADSCs, organisés en feuilles doubles de cellules, après ESD prolongée a réussi et fortement associée à un taux de sténose de l'œsophage inférieur.
La gestion des tumeurs œsophagiennes superficielles a changé avec le développement de nouvelles techniques endoscopiques. De nos jours, la résection endoscopique est le traitement de première ligne. En effet, elle est associée à la morbidité et de mortalité inférieurs à ceux d' une chirurgie avec des résultats oncologiques égaux 1, 2, 3. La résection endoscopique de la muqueuse (EMR) et muqueux résection endoscopique (ESD) sont les techniques les plus couramment utilisés. Dans le cas d'une tumeur superficielle étendue, l'EDD est préférable. Par rapport à EMR, ESD permet en bloc résection, indépendamment de la taille de la lésion et de la forme 4, 5, 6. La principale complication tardive de l'EDD est la formation de sténose de l'œsophage, ce qui se produit généralement entre une et deux semaines après la résection. Des études récentes publiées ont montré que la formation de sténose est corrélée à lataille de la résection. La Endoscopic Société japonaise recommande d'éviter l'EDD taille est supérieure à ¾ de la circonférence de l'œsophage, car ils sont associés au développement de sténoses dans plus de 90% des cas et sont responsables de troubles alimentaires graves et la détérioration importante de la qualité de vie.
La prévention de la sténose de l'œsophage reste difficile. Mécanismes impliqués dans la formation de sténoses ne sont que partiellement connus. Rétrécissement formations semble résulter de l'association de deux mécanismes différents: (1) le recrutement cellulaire pro-inflammatoire et (2) le développement excessif de la fibrose 7. Plusieurs traitements préventifs ont été proposés. Cependant, les résultats ne sont pas satisfaisants, avec peu d' avantages et d' effets secondaires graves , 8, 9. Récemment, une équipe japonaise, Ohki et al. , A proposé de transplanter une feuille cellulaire à une seule couche de cellules de la muqueuse orale autologues dans le Esophcicatrice ageal. La transplantation a été effectuée immédiatement après ESD 10, 11. Ils ont démontré l'efficacité de cette approche novatrice, d'abord dans un modèle canin, puis chez les patients.
cellules adipeuses dérivées de tissu stromales (ADSCs) sont prometteurs en médecine régénérative. Leur application dans plusieurs domaines, a donné des résultats intéressants, notamment dans le processus de cicatrisation. Thérapie ADSC offre plusieurs avantages, car les cellules sont facilement isolés et sont associés à des propriétés anti-inflammatoires, des effets immunomodulateurs locaux, néovascularisation induction et capacités de différenciation en lignées mésenchymateuses et non mésenchymateuses 12, 13, 14.
Dans une précédente étude, notre équipe a démontré l'efficacité de la double ADSC-feuille endoscopique transplantation pour prev sténose oesophagienneention après ESD prolongée dans un modèle porcin 15. Dans cet article, les rapports de construction ADSC-feuille et technique de transplantation endoscopiques sont présentés.
Tous les animaux ont été traités selon le Comité d'éthique de la recherche animale (Lignes directrices du ministère français de l'Agriculture). Le protocole a reçu l'approbation du comité d'éthique local autorisé pour les expérimentations animales à l'Université Paris Descartes (numéro enregistré MESR 2035,02; Faculté de médecine Paris Descartes, Paris, France).
1. ADSC Culture et étiquetage
2. Double ADSC-feuille Construct
3. oesophagien Endoscopic dissection sous-muqueuse (ESD)
4. Endoscopic Transplantation
5. postopératoires Évaluation et suivi
La culture de ADSCs et la procédure pour obtenir la feuille de ADSC est représentée sur la figure 1. La figure 2 montre la construction de la greffe, composé de deux feuilles ADSC en couches les unes sur les autres sur leur membrane support papier. ADSCs ont déjà été marqués avec le fluorophore PKH67 pour permettre la surveillance de la greffe in vivo avec pCLE. La figure 3 montre les différentes étapes d'extension de l' oesophage endoscopique dissection sous - muqueuse, ce qui entraîne une cicatrice de l' œsophage 5 cm et semi-circonférentielle. La figure 4 montre la procédure de transplantation endoscopique. La transplantation a réussi pour tous les animaux après 10 min d'application douce. La figure 5 montre l'évaluation de pCLE positif le jour 3, ce qui confirme le succès de la procédure de transplantation.
La période de suivi a permis de analys sténoses multimodales est. Les différentes évaluations sont montrées dans les figures et le tableau suivants. Par rapport aux animaux témoins, le groupe des animaux transplantés a montré des difficultés alimentaires moins fréquentes et plus le gain de poids au jour 28. Un animal dans le groupe transplanté a développé une sténose oesophagienne sévère par rapport à tous les animaux dans le groupe témoin. Par rapport aux animaux transplantés, les animaux témoins ont développé un tissu fibrotique significatif. Le tableau 1 montre les résultats cliniques et endoscopiques au cours de la période de suivi. La figure 6 montre l'endoscopie et les signes radiologiques à la fin de la période de suivi chez des animaux transplantés et non transplantés. La figure 7 montre les différents résultats histologiques entre les animaux transplantés et de contrôle. Ces données confirment l'efficacité de ADSC-feuille transplantation pour la prévention de la sténose oesophagienne.
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Figure 1. ADSC-feuille Construct. A et B. Early-passage ADSCs dans des boîtes de culture standard avec différents grossissements. feuilles de ADSC ont été obtenus par culture ADSCs PKH marqués sur des boîtes de culture sensibles à la température commerciale. C. Lorsque la température d'incubation a été réduite à 20 ° C (température ambiante), toutes les cellules spontanément détachés des surfaces plat comme des feuilles ADSC intactes, sans la nécessité d' un traitement enzymatique. Fiche D. Un ADSC récolté avant la construction de greffe en utilisant une membrane de transfert. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Double ADSC-feuille Construct. A, B et C. La veille transplantation, ADSCs PKH marquées ont été récoltées au nombre précoce de passage (P4 - P5), semé sur une culture cellulaire sensible à la température de 12 puits, et cultivées à 37 ° C et 5% de CO 2 avec du milieu essentiel alpha-minimal , y compris 10% du foetus sérum de veau et 1% d'antibiotiques (pénicilline et streptomycine). Chaque puits a été revêtu d'une membrane de poly-N-isopropylacrylamide (au fond de chaque puits) et on ensemence avec 1,5 x 10 6 cellules. Lorsque la température d'incubation a été réduite à 20 ° C (température ambiante), toutes les cellules spontanément détachés sous forme de feuilles intactes ADSC sans la nécessité d'un traitement enzymatique. D. schéma théorique de la double feuille d' assemblage de cellule composée de deux feuilles ADSC couches les unes sur les autres et appliquées sur une membrane de support en papier. E. Vue macroscopique d'une cellule double-feuille construction terminée. Modifié de référence 15. S'il vous plaît cliquez ici t o voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Procédure Dissection sous - muqueuse endoscopique. R. marques endoscopiques ont été créés pour délimiter la zone de résection, allant de 40 à 45 cm de l'arc dentaire et en impliquant la moitié de la circonférence. B. L'injection sous - muqueux d'une solution de glycérol contenant de l' indigo carmin. Le but de cette injection est de séparer la couche muqueuse de la couche musculaire afin d'exposer la couche sous-muqueuse. Incisions C. périphériques ont été réalisées à l' extérieur des marques endoscopiques, révélant la couche sous - muqueuse injectée. D. La vue endoscopique à la fin de la dissection sous - muqueuse montrant un 5 cm de long et hémi-circonférentielle cicatrice oesophagien.et = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Double ADSC-feuille Endoscopic procédure de transplantation. A. Quatre ADSC construit prêts à être transplantés. B. Protection de l'ADSC construire sous un grand chapeau endoscopique avant la transplantation. C. Vue endoscopique de la traversée du pharynx animal, montrant la construction ADSC protégée sous le bouchon endoscopique. D. 10 min d'application était suffisante pour obtenir la feuille d' adhésion. L'application a été réalisée en utilisant le bouchon endoscopique ou endoscopique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Constatations de PCLE. pCLE le jour 3 montre des signaux spontanés et intenses semblables à ceux obtenus in vitro, compatible avec succès une transplantation de cellules feuille. Aucun signal n'a été trouvé sur les jours 14 et 28. A. Le vitro du signal pCLE dans des ADSCs en suspension. B. Le signal de pCLE in vitro de ADSCs organisés en une feuille cellulaire. C. La vivo pCLE application dans la sonde à la cicatrice de l' œsophage. D. Le signal de pCLE in vivo de ADSCs visualisé le jour 3 après la transplantation. Modifié de référence 15. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6 : Résultatsde l'analyse morphologique le jour 28. Par rapport au groupe de contrôle, l'endoscopie et les résultats radiologiques sur 28 jours ont montré un rétrécissement court et léger sans dilatation en amont et une muqueuse complètement re-épithélialisées. Modifié de référence 15. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7. Évaluation histologique des zones sténoses. L'analyse histologique a été réalisée après HES-étiquetage et glisser digitalisation. Chez les animaux transplantés (A), le processus de guérison a été amélioré, avec une augmentation réépithélialisation et une diminution du développement de la fibrose, par rapport à les animaux non greffés (B). le développement du tissu fibrotique Intense étaitobservée en raison de la musculeuse destruction des muqueuses, fibrotique invasion de la couche musculeuse intérieure, et de grands défauts des muqueuses. Modifié de référence 15. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Tableau 1. Les évaluations cliniques durant la période de suivi. Les évaluations cliniques ont été réalisées à l'aide d'une évaluation clinique quotidienne en fonction du score Mellow Pinkas et avec une variation de poids. (*) Mellow Pinkas score de 16. Modifié de référence 15.
Dans ce modèle de porc, la transplantation ADSC-feuille était techniquement réussie, et l'évaluation in vivo de pCLE permis pour la surveillance de la greffe de cellules. Des évaluations cliniques, endoscopiques, radiologiques et histologiques ont démontré l'efficacité de la feuille de ADSC endoscopique à la prévention de la sténose oesophagienne après ESD prolongée.
La transplantation endoscopique d'une solution ADSC de glycérol contenant une feuille carmin de teinture indigo est une approche novatrice en médecine régénérative. Ohki et al. décrit d'abord la procédure de transplantation endoscopique. Dans leurs études, les constructions de cellules feuilles sont composées de feuilles par voie orale muqueuse épithéliale de cellules en couche sur une feuille mince de difluorure de polyvinylidène, utilisé comme membrane de support 10, 11, 19. La membrane de support a été saisi avec des forceps endoscopique et soigneusement placé sur le lit de la plaie. Cell-feuille adhésion a été obtenue après 10 min d'application douce. Cette procédure n'a pas encore été reproduite. Dans cette étude, doubles constructions ADSC-feuilles ont été transplantés pour de multiples raisons. Le choix de ADSC était basée sur plusieurs études qui ont démontré leurs capacités anti-inflammatoires, en particulier dans le processus de guérison de la peau. ADSCs sont connues pour moduler les interactions des kératinocytes et des fibroblastes 7. Le mécanisme du développement de la fibrose est complexe et que partiellement compris. L'effet paracrine semble jouer un rôle majeur dans l' action ADSC, y compris la production de facteur anti-inflammatoire, tels que TGFß et les facteurs pro-angiogéniques 20.
Endoscopic ADSC-feuille transplantation présente plusieurs limites. Tout d'abord, les feuilles de cellules ont été appliqués pendant 10 minutes à la cicatrice de l'oesophage afin d'obtenir une adhérence stable. Cette partie de la procédure était difficile, techniquement difficile, et a dû être effectué par un endoscopiste expérimenté. Néanmoins, tous les animaux ont été transplantées avec succès, ce qui confirme la faisabilité de la procédure endoscopique. Récemment, l'utilisation d'un dispositif 3D-imprimé pour améliorer le succès de la cellule-feuille transplantation a été rapportée 21. D'autre part, cette technique est associée à un taux de survie inconnue. Une cicatrice de l'œsophage est un environnement agressif pour les cellules. Un plat sensible à la température permet la production de la cellule de feuilles à travers la construction d'une matrice extracellulaire, et pour la formation de connexions cellulaires. Ainsi, pour améliorer le taux de survie et les interactions ADSC, un double ADSC-feuille de construction a été choisi 22, 23. Cette étude n'a pas été conçue pour évaluer soit le taux de survie des cellules ou l'effet de dose de la transplantation sur la prévention de sténose de l'œsophage, qui sont les deux questions importantes. Troisièmement, comme dans Ohki et al. , L'utilisation d'une membrane de soutien était nécessaire pour porter le ADSC-feuille construction. à l'arrièreer transplantation, la membrane du support papier ne pouvait pas être enlevé sans destruction de construction. Ce matériau étranger intra-oesophagien est responsable de l'augmentation de l'inflammation. Une technique optimisée permettrait le retrait de la membrane de support en papier.
suivi de la transplantation avec pCLE a également été difficile. Cette nouvelle technique d'imagerie endoscopique permet l'analyse histologique in vivo, y compris la visualisation du motif glandulaire, micro-vascularisation et l' altération cellulaire. pCLE a été évaluée dans de nombreuses pathologies digestives, telles que la maladie inflammatoire de l' intestin, de l' oesophage de Barrett, et les kystes pancréatiques mucine 24, 25. Le PKH67 fluorophore pCLE compatible a été utilisé pour le marquage des cellules. Un signal fluorescent compatible avec la présence de la feuille de ADSC a été observée chez 4 animaux le jour 3. Ce résultat positif reflète le succès de la transplantation ADSC feuilles. Cependant, becautilisation PKH67 a un signal diminué au fil du temps et après la division cellulaire, l' évaluation de pCLE était possible que quelques jours après la transplantation 26. Ohki et al. et Kanai et al. contrôlée feuille de transplantation de cellules par immunocoloration, et ils ont confirmé la présence de cellules jusqu'à ce jour 8 après la transplantation. cellules matures ont été utilisées dans cette étude, qui ont l'avantage d'immunocoloration spécifique.
Sténose œsophagienne est l'un des événements les plus graves indésirables suivants ESD, limitant ainsi le développement de la technique. techniques optimales pour prévenir la formation de sténoses font encore défaut. Dans la pratique clinique, les patients atteints de l' oesophage ESD prolongée sont prescrits différents traitements préventifs, tels que les corticostéroïdes, les dilatations de ballons endoscopiques ou oesophagien stenting 27. L' application locale de biomatériau a été menée, avec des résultats variables 28, 29 . Le but de la médecine régénérative est de reconstituer un tissu ou un organe en utilisant diverses approches, telles que le remplacement des tissus ou immunomodulation local. Pour le remplacement de tissus, l'utilisation d'échafaudages biologiques avec ou sans les cellules épithéliales a été évaluée dans la littérature , 30, 31. Une réépithélialisation précoce et l'augmentation a été observée dans la cicatrice de l'œsophage. Pour immunomodulation locale, peu de données sont disponibles dans la littérature sur l' injection ADSC ou de l' application de la membrane amniotique 32, 33. Une formation de sténoses retardée et un taux de striction réduite ont été observées.
Dans ce modèle de porc, la cellule-feuille procédure de transplantation endoscopique a été réalisée avec succès. ADSCs transplantées organisés en feuilles doubles cellulaires ont démontré leur capacité à prévenir la formation de sténose oesophagienne après ESD prolongée. Les mécanismes impliqués dans la guérison ADSCprocessus sont mal compris et doit être étudié plus loin dans les études futures. Ainsi, compte tenu de ces résultats prometteurs, un essai clinique devrait être menée pour évaluer l'efficacité de la construction ADSC-feuille après étendue ESD chez les patients.
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
This study was supported and funded by the Avenir Foundation (Fondation de l'Avenir, 255 rue de Vaugirard, 75719 Paris cedex 15, Paris, France). This study would never have been conducted without the precious help of the veterinary team of the Laboratory of Biosurgical Research from the Alain Carpentier Foundation.
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