Method Article
Ce manuscrit décrit une technique de modélisation des capsulaire Infarctus. Ici, nous avons utilisé une technique photothrombotique modifiée avec une faible intensité de la lumière après la cartographie cible pré-opératoire. En utilisant cette technique, nous avons créé un modèle d'infarctus capsulaire circonscrites avec déficience motrice persistante.
Recent increase in the prevalence rate of white matter stroke demands specific research in the field. However, the lack of a pertinent animal model for white matter stroke has hampered research investigations. Here, we describe a novel method for creating a circumscribed capsular infarct that minimizes damage to neighboring gray matter structures. We used pre-surgery neural tracing with adeno-associated virus-green fluorescent protein (AAV-GFP) to identify somatotopic organization of the forelimb area within the internal capsule. The adjustment of light intensity based on different optical properties of gray and white matter contributes to selective destruction of white matter with relative preservation of gray matter. Accurate positioning of optical-neural interface enables destruction of entire forelimb area in the internal capsule, which leads to a marked and persistent motor deficit. Thus, this technique produces highly replicable capsular infarct lesions with a persistent motor deficit. The model will be helpful not only to study white matter stroke (WMS) at the behavioral, circuit, and cellular levels, but also to assess its usefulness for development of new therapeutic and rehabilitative interventions.
Jusqu'à récemment, la «matière grise course (GMS) modèles" ont été exclusivement utilisé pour comprendre la physiopathologie de l'AVC et de guider le développement de nouveaux traitements. Cependant, il y a eu une augmentation de la prévalence de l' AVC qui affecte la substance blanche sous - corticale chez les personnes âgées, ce qui constitue 15-25% de tous les AVC 1,2. De nombreuses études ont été menées en ce qui concerne la course en utilisant des modèles GMS, alors qu'il ya peu d'études qui ont utilisé la substance blanche course (WMS) modèles. La matière blanche chez les rongeurs est sensiblement inférieure à la matière blanche chez les êtres humains ou de primates. Par conséquent, il est plus difficile d'accéder sélectivement et détruire les régions cibles dans la substance blanche 3. En outre, aucun des outils efficaces ont été développés à ce jour pour détruire sélectivement l'étendue prévue de la substance blanche ciblée. Par conséquent, il y a eu absence de modèles appropriés pour l'étude des accidents vasculaires cérébraux de la substance blanche.
st animalmodèles Roke sont souvent utilisés pour surveiller la progression de la récupération motrice pour le développement de nouvelles méthodes de réadaptation et thérapeutiques. Il est idéal d'utiliser un modèle animal qui présente un déficit neurologique à long terme concordant avec les altérations anatomiques démontrées dans la course humaine 4,5. À cet égard, la récupération rapide du déficit moteur et une large participation du cerveau après lesioning de l'infarctus peut ne pas être réaliste dans la poursuite de la recherche sur les AVC. Les modèles précédents capsulaire de l' infarctus ont été faites par l'occlusion de l'artère carotide interne des artères ou de la choroïde antérieure et la diffusion de l' endothéline-1 (ET-1) dans la capsule interne 9/6. Néanmoins, l'occlusion de l'artère nécessite une dissection minutieuse des artères, mais il produit une vaste zone de lésion vasculaire, y compris la capsule interne, sans déficits comportementaux persistants. De plus, ET-1 n'a pas été diffusée à détruire complètement le bras postérieur de la capsule interne, et donc moins marqué ou persistant behdéficit avioral.
Un modèle d'infarctus photothrombotique a été largement utilisé pour générer divers types de lésions d' infarctus du cortex et des structures sous - corticales 10. La technique comprend l' administration par voie intraveineuse suivie d' une illumination focale, ce qui conduit à l' agrégation plaquettaire dans les petits vaisseaux et la génération des lésions d'infarctus 10. Technique photothrombotique a été largement utilisé pour créer des lésions GMS, alors qu'il a rarement été utilisé pour générer des lésions WMS 5,11. Pour cette technique, une combinaison de colorant rose bengale et l'irradiation de lumière a été démontrée comme étant utiles dans la destruction de la structure cible, ce qui provoque des déficits fonctionnels correspondants. L'élément clé de la technique photothrombotique est une irradiation lumineuse, car elle détermine la taille des lésions d'infarctus. les résultats d'irradiation de lumière dans des effets différents sur la matière grise et la substance blanche, parce que la diffusion de la lumière est plus de 4 fois plus élevé dans ma blanchetter par rapport à la matière grise 12; Par conséquent, si l'intensité lumineuse a une suffisamment faible irradiance (<1,140 mW / mm 2), on peut limiter l'extension à laquelle la lésion photothrombotique affecte la mesure dans la substance blanche (ie., Capsule interne). Par exemple, la lumière de l'énergie plus élevée peut provoquer des infarctus à la fois la matière grise et blanche, mais la lumière de faible énergie peut induire photothrombosis seulement dans la substance blanche. En outre, la pénétration de l'énergie lumineuse a été très limitée. Environ 99% de l' énergie lumineuse a été perdu au - delà de 1 mm de la source de lumière 13. Par conséquent, il est prévu que vise précisément, la lumière d'énergie inférieure photothrombosis induit seulement dans la substance blanche avec un empiètement minimal de la matière grise voisine.
Ici, nous décrivons un nouveau procédé pour créer des lésions d'infarctus dans la zone de la patte avant de la capsule interne chez les rongeurs. Nous décrivons la méthode d'identification de la zone de forelimb dans le ca internepsule, la technologie de l'irradiation de lumière, y compris l'ajustement et la fourniture de la lumière, et la génération d'une lésion d'infarctus. Nous décrivons également les tests comportementaux utilisés pour évaluer l'exhaustivité de la modélisation capsulaire.
Toutes les procédures ont été menées selon les directives institutionnelles de Gwangju Institute of Science and Technology (GIST), et toutes les procédures ont été approuvées par le Institutional Animal Care et utilisation Comité à GIST.
1. Les étapes de pré-lesioning
2. PhotothromBotic Infarctus lesioning dans la capsule interne
3. Évaluation des capsulaire Infarctus lesioning
La méthode présentée ici est destinée à créer un Infarctus capsulaire circonscrit avec un déficit moteur persistant. Par conséquent, il est essentiel de déterminer correctement la cible à l'intérieur de la capsule interne dans l'étape de pré-chirurgie. La cartographie somatotopique des fibres pyramidales dans la capsule interne n'a pas été réglé à ce jour. D'identifier correctement la cible à l'intérieur de la capsule interne, la zone de la patte avant doit être définie. Une injection d'AAV-GFP dans la zone de la patte avant du cortex moteur peut tracer les axones des fibres pyramidales dans la capsule interne (figure 1). D' autres marqueurs neuronaux, tels que biotinylé dextran amine (BDA), peut être utilisé pour le même objectif. Les coordonnées stéréotaxiques de la cible à l'intérieur de la capsule interne peuvent être élucidées en traçant les projections axonales qui proviennent de la zone de la patte avant du cortex moteur vers la capsule interne.
Figure 1. Identification de la zone forelimb dans la capsule interne 2 semaines après l'injection d'AAV-GFP. Fibres axonales GFP-transduction qui proviennent de la zone de forelimb du cortex moteur sont présentés dans le noyau ventro des thalamus (flèches) et la partie caudale de la capsule interne (pointe de flèche). La ligne pointillée indique le contour de la capsule interne, et les chiffres se rapportent aux distances de bregma. Hippo, hippocampe; Cpu, putamen caudé; VL, noyau ventro; IC, capsule interne. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
L'intensité optimale de la lumière peut être différente en fonction du poids de contrainte et le corps de l'animal et les types et diamètres des fibres optiques. Par conséquent, l'intensité lumineuse optimale doit être déterminée séparément avant l'expérience de l'infarctus lesioning principal. En utilisant la procédure photothrombotique, l'intensité lumineuse peut être augmentée progressivement jusqu'à ce que l'étendue de la lésion couvre toute la largeur de la capsule interne , sans détruire les structures de matière grise voisines (figure 2). L'intensité lumineuse optimale peut être vérifiée en comparant la mesure histologique de la lésion d'infarctus et d'emplacements.
Figure 2. Étendue de l'Infarctus Lésions Across Varier l' intensité de la lumière laser de 2 mW à 5 mW 2 semaines après photothrombotique lesioning. L'intensité lumineuse optimale est considéré comme entre 3 mW et 4 mW dans ce cadre expérimental. Les flèches indiquent la lésion d'infarctus./53281/53281fig2large.jpg "Target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Nous préférons utiliser l'ONI dans lequel la fibre optique est contenue dans un tube métallique mince (aiguille spinale). La fibre optique peut produire un minimum de dispersion de la lumière à partir du côté de la fibre, ce qui est susceptible de générer des dommages neuronaux supplémentaire le long du tube de fibre optique. Enrobage de la fibre optique est également avantageuse pour empêcher la flexion de la fibre optique dans des cibles plus profondes, ainsi que pour fixer le ONI au cadre stéréotaxique (figure 3).
Figure 3. Construction de l'interface optique-neural (ONI). (A) coupe de l'aiguille spinale. (B) de dénudage de la fibre optique. (C & d) Le tube métallique d'ancrage est inséré par-dessus lafibre optique dénudée et à l'étroit pour fixer la fibre optique sur le moyeu de l'aiguille spinale. (E) La fibre optique époxy ajoutée est insérée dans l'aiguille spinale. (F) La résine époxyde est durci à 100 ° C pendant 20 min. (G) La fibre optique est clivé à la pointe de l'aiguille spinale. (H) La fibre optique est polie. (i) L'intensité lumineuse est mesurée à partir de la pointe de la fibre optique. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
La procédure photothrombotique produira des lésions et des endroits reproductibles avec ~ réussite de 70% dans la déficience motrice. Lésion capsulaire typique de l' infarctus englobe la dimension ventro - dorsale de fibres capsulaires (figure 4A). En outre, la lésion d'infarctus se prolonge le long de l'axe antéro - postérieur de la capsule interne a augmenté en raison de la diffusion de la lumière dans la fibre capsulaire. (Figure 4B) Le faisceau optique situé au- dessous de la capsule interne est constituée de fibres de matière blanche; Par conséquent, il est souvent endommagée par l'irradiation d'une intensité lumineuse accrue. Des coupes en série et la coloration sont nécessaires pour confirmer l'ensemble du volume et de l'étendue de l'infarctus. Le volume d'infarctus était de 0,63 ± 0,37 mm 3. Pour évaluer la destruction de la fibre capsulaire, neurofilament et luxol taches bleu-PAS rapide sont utiles.
Figure 4. Aspect microscopique des capsulaire 3 semaines après l' infarctus Photothrombosis. Aspect microscopique des capsulaire Infarctus 3 semaines après photothrombosis. A) tranche de cerveau de la section coronale dans le cerveau de rat. Pointe de flèche indique le tube d'aiguille contenant de la fibre optique dans le thalamus et jusqu'à la capsule interne. B) série de coloration Nissl du coronal des tranches de cerveau showi ng toute l'étendue de la lésion d'infarctus dans la capsule interne. Arrowheads indiquent la lésion de l' infarctus. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Le succès de la modélisation peut être évaluée par des tests de comportement en utilisant une seule pastille atteignant tâche. La performance comportementale après 1 semaine après la lesioning de l' infarctus est un bon guide pour confirmer lesioning précis, qui accompagne la dépréciation persistante et marquée de SPRT en dépit de la formation pellet unique quotidienne atteint (figure 5). Une fois que le déficit moteur est indiqué dans le PRG, le déficit neurologique a persisté pendant 3 période d'observation d'un mois. groupe Sham-exploité n'a pas montré la diminution significative de la performance SPRT après l'opération.
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Figure 5. Changements dans Simple Pellet Atteindre Scores après capsulaire infart 4,20. Les groupes expérimentaux (PRG et MRG) présentaient une diminution significative des scores immédiatement après la lesioning de l'infarctus par rapport au groupe de pseudo-opérées (SOG). Le MRG présente une reprise progressive des performances SPRT, tandis que le PRG présente la déficience motrice persistante au fil du temps. Op, photothrombotique Infarctus lesioning; PRG, groupe pauvre de récupération; MRG, groupe de reprise modérée. La signification statistique a été déterminée en utilisant une analyse répétée de la mesure des écarts. + SOG contre MRG; * SOG contre PRG. Les données sont des moyennes ± sem. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Le modèle de l'infarctus capsulaire présenté ici démontre une lésion ciblée avec marquée et persistante déficience motrice en fonction de forelimb. Les modèles précédents de l' AVC capsulaire subcortical ont démontré un degré insuffisant de déficience motrice et un 6,8,9 rapide de processus de récupération. En ce sens, ce modèle ressemble aux cas cliniques capsulaire d'infarctus qui présentent une déficience fonctionnelle à long terme.
Les étapes les plus critiques dans le développement d'un modèle capsulaire Infarctus circonscrit sont: 1) d'identifier correctement la représentation somatotopique de la partie du corps destinée à désactiver la fonction au sein de la capsule interne; 2) pour identifier l'intensité optimale du laser vert, qui peut détruire toute la largeur de la capsule interne avec l'empiètement minimal de structures de matière grise voisine; et 3) pour placer avec précision la fibre optique dans la structure cible. Bien que les techniques présentées peuvent induire circonscriventd modèle Infarctus capsulaire avec un taux de réplication élevé (> 70%), de petites différences dans le ciblage et le degré d'exhaustivité de la destruction couvrant toute la largeur de la capsule interne peut tenir compte des différents déficits moteurs.
Le faisceau cortico - spinal est situé dans la moitié antérieure de la branche postérieure de la capsule interne chez l' homme malgré la controverse de l' organisation somatotopique 15. En revanche, il n'y a pas de classification équivalente ou élucidation détaillée de l'organisation somatotopique de la capsule interne chez les rongeurs. Le manque de connaissances en ce qui concerne l'organisation somatotopique conduit souvent à des cibles incorrectes des Infarctus lesioning au sein de la capsule interne avec des résultats différents moteurs parmi les modèles capsulaire d'infarctus. Cependant, nous avons identifié les axones GFP transduite dans la partie caudale de la capsule interne, ce qui représente probablement le trajet des fibres motrices des membres antérieurs. En outre, lesioning de cette zone justified un déficit marqué et persistant de l'forelimb compétence atteint. Par conséquent, nous recommandons la partie caudale de la capsule interne pour lesioning stéréotaxique pour améliorer la validité du modèle capsulaire de l'infarctus.
Pré-réglage de l'intensité lumineuse est obligatoire pour produire une mesure uniforme de l'infarctus lésion dans les modèles de temps parce que la souche animale, le poids corporel, la source lumineuse et le type d'ONI peut générer différentes tailles d'infarctus. Par conséquent, des expériences préliminaires utilisant des intensités lumineuses différentes sur des animaux expérimentaux avec la même souche et de poids corporel doivent être conduites jusqu'à ce que la lésion d'infarctus satisfaisante est obtenue avec une intensité lumineuse minimale.
intensité de la lumière forte qui peut détruire toute la largeur de la fibre capsulaire (antéro-postérieur et dorso-ventral mesure) qui correspond à la zone de forelimb avec un minimum de dommages aux structures voisines est considéré comme l'intensité lumineuse optimale. Le forelimb zone de la capsule interne est limitée par le thalamus supérieurement et les voies optiques inférieurement. Par conséquent, la profondeur d'insertion ONI doit être précis pour détruire toute l'étendue du circuit intégré dans la direction dorso-ventrale, avec la préservation simultanée des structures voisines supérieures et inférieures. le placement imprécis de l'ONI se traduit par une destruction incomplète du circuit intégré, ce qui conduit à une récupération rapide du déficit moteur en raison de la plasticité synaptique des fibres pyramidales restant dans la capsule interne. Lors des examens histologiques de série, le facteur le plus de confusion dans l'induction d'un déficit moteur persistant était le mauvais positionnement de l'ONI, ce qui conduit à l'échec de détruire toute la largeur de la CARP 4,16. Par conséquent, une attention particulière devrait être portée pour atteindre la bonne cible. Récemment, Blasi et al. A rapporté que durant le déficit moteur pur peut être produit en faisant une lésion d'infarctus dans la capsule postérieure interneà l' aide d' endothéline-1 (ET-1) 17. Cependant, ET-1 peut détruire la structure de la matière grise voisine par la diffusion de l'ET-1.
les tests de comportement est une référence immédiatement disponible au laboratoire pour évaluer la formation de la lésion d'infarctus dans la capsule interne. Toutefois, l'évaluation de la performance du moteur, une semaine après l'infarctus lesioning est recommandé de diviser les animaux en groupes de récupération modérés et pauvres. Reprise modérée a été définie comme une augmentation du score de performance de> 50% par rapport au score avant lesioning, alors une mauvaise récupération a été définie comme la récupération de <50%. Parmi les tests de comportement du moteur de forelimb, le culot unique tâche est d' atteindre l' un des tests les plus sensibles pour les mesures quantitatives et qualitatives des performances motrices induites par l' AVC 14. La tâche mesure quantitativement le succès atteint tout en fournissant simultanément une analyse de l'utilisation de forelimb, tels que la saisie et la récupération d'un alimentpastille. L'analyse qualitative du mouvement pour atteindre est également utile pour différencier la qualité de la récupération de l' AVC en distinguant la récupération ou la compensation 20 fonctionnelle réelle. Ici, nous avons brièvement décrit la mesure quantitative de la SPRT; Cependant, l'analyse qualitative en utilisant le tournage et la notation basée sur une analyse trame par trame est recommandé pour une analyse plus détaillée.
Les techniques présentées ici ne doivent pas se limiter à l'induction de la modélisation circonscrite capsulaire de l'infarctus. La technique peut être appliquée à l'induction d'une lésion d'infarctus dans d'autres domaines de la matière blanche, tels que le corps calleux, commissure antérieure et des fibres de liaison entre les structures nerveuses. La combinaison de la technique minuscule ONI et photothrombotique basée sur les propriétés optiques de la matière blanche est susceptible de détruire les structures ciblées avec un minimum de dommages aux structures voisines. Par exemple, infarctus lacunaires peuvent être facilement produired en ciblant les structures sous-corticales liées aux fonctions motrices, cognitives et de la mémoire. Lorsque la structure cible est grande, insertions multiples de l'ONI et différents ciblage et angulaires trajectoires peuvent être nécessaires pour produire le degré souhaité de lésions.
Il existe plusieurs limitations de cette technique. La technique est suffisante pour démontrer la conséquence de l'infarctus lesioning dans le CARP et la récupération ultérieure. Toutefois, ce modèle ne reflète pas le spectre complet des WMS humains parce que la destruction de la matière blanche photothrombotique diffère légèrement de WMS humains. Par conséquent, les résultats d'imagerie neurobiologiques ou IRM peuvent présenter des caractéristiques différentes dans le stade précoce de lesioning photothrombotique. Par conséquent, ce modèle devrait être utilisé de façon appropriée à troquer les avantages et les inconvénients du modèle. Techniquement, pas toutes les chirurgies peuvent produire le déficit moteur marqué et permanent dans ce modèle, car il nécessite des procédures très précises. Specifically, les mains formés et expérimentés sont nécessaires pour produire la grande reproductibilité dans la génération de ce modèle.
En conclusion, l'utilisation combinée d'une technique photothrombotique, l'optimisation de l'intensité lumineuse, et le ciblage correct est une technique utile pour produire un modèle capsulaire Infarctus circonscrit. Ce modèle sera utile non seulement pour étudier WMS au comportement, circuit, et les niveaux cellulaires, mais aussi d'évaluer l'utilité des nouvelles interventions thérapeutiques et de réadaptation.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par une subvention de l'Institut de médecine System Engineering (IMSE) & GIST-Caltech Fonds de collaboration (de K04592) à partir de GIST et par le Programme de recherche en sciences de base par le biais de la NRF de Corée, financé par le Ministère des sciences, TIC et de la planification future (NRF-2013R1A2A2A01067890).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DC Temperature controller | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC. | ATC1000 | |
Digital Stereotaxic Instruments | STOELTING CO. | 51900 | |
Electrical Stimulator | CyberMedic Corp. | EMGFES 2000 | |
Epoxy | Precision Fiber Products, INC. | PFP-353ND1 | Mix Ratio: 10(A):1(B-hardener) by weight Curing Schedule: 1 min @150 °C 2 ~ 5 min @120 °C 5 ~ 10 min @100 °C 15 ~ 30 min @80 °C |
Fiber Optic Scribe | THORLABS, INC | S90R | |
Fiber patch cable | KOREA OPTRON Corp. | Outer diameter: 3 mm Ø200 µm 0.39 NA FC/PC-FC/PC 1 m | |
Laser Power Supply | CHANGCHUN NEW INDUSTRIES OPTOELECTRONICS TECH. CO., LTD. | MGL-FN-532nm-200mW-14010196 | |
Crimp ring | DAWOOTECH CO.,LTD. | Length: 19 mm Inner diameter: 3 mm Outer diameter: 3.8 mm Material: SUS | |
Micro4-micro syringe pump controller | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | 95100 | |
Optical Power Meter | THOLABS, INC | PM100D | |
Diamond lapping (polishing) sheet | THORLABS, INC | LF3D | Grit : 3 µm |
Diamond lapping (polishing) sheet | THORLABS, INC | LF6D | Grit : 6 µm |
Rose Bengal | SIGMA-ALDRICH CO. LLC. | 330000 | |
Needle for spinal anesthesia with pencil point tip (Spinal needle) | B.BRAUN MELSUNGEN AG | 4502027 | Size: 27 G Length: 88 mm Needle: 0.40 mm |
Waterproof sandpaper | DEERFOS CO.,LTD | CC261 | Grit : 1,000 µm |
Nanofil 10 µl syringe | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | NANOFIL | |
Nanofil 33 G BVLD needle | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | NF33BV-2 | |
AAV-GFP virus | UNC Vector Core | AAV2-CamKIIa-eYFP | 2 x 1012 virus molecules/ml |
Anti-Green Fluorescent Protein, Rabbit IgG fraction | Life Technologies, INC | A11122 | primary antibody (1:200) |
Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) | Life Technologies, INC | A11034 | secondary antibody (1:500) |
Ceftezole | GUJU Pharma CO.,LTD. | A27802741 | 0.1%, 1 ml |
Lidocain hydrochloride injection | JEIL PHARMACEUTICAL CO.,LTD. | A04900271 | 2%, 1 ml |
Hand Piece Drill | Seshin | ||
Digital optical power and energy meter | THORLABS, INC | PM100D | |
Ketoprofen | UNIBIOTech |
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