Method Article
Este manuscrito describe una técnica de modelado de infarto capsular. Aquí hemos utilizado una técnica photothrombotic modificado con baja intensidad de la luz después de la cartografía de destino antes de la cirugía. Usando esta técnica, hemos creado un modelo de infarto capsular circunscrita con deficiencia motora persistente.
Recent increase in the prevalence rate of white matter stroke demands specific research in the field. However, the lack of a pertinent animal model for white matter stroke has hampered research investigations. Here, we describe a novel method for creating a circumscribed capsular infarct that minimizes damage to neighboring gray matter structures. We used pre-surgery neural tracing with adeno-associated virus-green fluorescent protein (AAV-GFP) to identify somatotopic organization of the forelimb area within the internal capsule. The adjustment of light intensity based on different optical properties of gray and white matter contributes to selective destruction of white matter with relative preservation of gray matter. Accurate positioning of optical-neural interface enables destruction of entire forelimb area in the internal capsule, which leads to a marked and persistent motor deficit. Thus, this technique produces highly replicable capsular infarct lesions with a persistent motor deficit. The model will be helpful not only to study white matter stroke (WMS) at the behavioral, circuit, and cellular levels, but also to assess its usefulness for development of new therapeutic and rehabilitative interventions.
Hasta hace poco, la "carrera de la materia gris (GMS) modelos" se han utilizado exclusivamente para comprender la fisiopatología del accidente cerebrovascular y para guiar el desarrollo de nuevos tratamientos. Sin embargo, ha habido una creciente prevalencia de accidente cerebrovascular que afecta a la sustancia blanca subcortical en individuos de edad avanzada, lo que constituye 15 - 25% de los ictus 1,2. Numerosos estudios se han realizado en relación con el uso de modelos de carrera de la SGM, mientras que hay pocos estudios que han utilizado modelos de carrera de la sustancia blanca (WMS). La materia blanca en los roedores es sustancialmente menor que la materia blanca en los seres humanos o primates. En consecuencia, es más difícil de acceder selectivamente y destruir las regiones diana en la sustancia blanca 3. Además, no hay herramientas eficaces se han desarrollado hasta la fecha para destruir selectivamente la medida prevista de la materia blanca de destino. Por lo tanto, ha sido la falta de modelos apropiados para el estudio de los trazos de la materia blanca.
st Animalmodelos roke a menudo se utilizan para controlar el progreso de la recuperación de motor para el desarrollo de nuevos rehabilitación y métodos terapéuticos. Es ideal para utilizar un modelo animal que exhibe un déficit neurológico a largo plazo concordante con las alteraciones anatómicas demostrado en el accidente cerebrovascular humana 4,5. En este sentido, la rápida recuperación del déficit motor y la amplia participación del cerebro después del infarto lesioning puede no ser realista en la búsqueda de la investigación del accidente cerebrovascular. Anteriores modelos de infarto capsular han sido realizadas por la oclusión de la carótida interna o las arterias coroideas anterior y difusión de la endotelina-1 (ET-1) en la cápsula interna 6-9. Sin embargo, oclusión de la arteria requiere una cuidadosa disección de las arterias, sino que produce una amplia área de la lesión del infarto, incluyendo la cápsula interna, sin déficit de comportamiento persistentes. Por otra parte, ET-1 no era difusa para destruir por completo el brazo posterior de la cápsula interna, y por lo tanto menos marcada o de persistir Behavioral déficit.
Un modelo de infarto photothrombotic ha sido ampliamente utilizado para generar diversos tipos de lesiones del infarto en el córtex y estructuras subcorticales 10. La técnica incluye la administración intravenosa, seguido por la iluminación focal, lo que conduce a la agregación de plaquetas en los vasos pequeños y la generación de lesiones de infarto 10. Photothrombotic técnica se ha utilizado ampliamente para crear lesiones GMS, mientras que rara vez se ha utilizado para generar lesiones WMS 5,11. Para esta técnica, una combinación de Rosa de Bengala colorante y la luz de irradiación ha demostrado ser útil en la destrucción de la estructura diana, causando déficits funcionales correspondientes. El elemento clave de esta técnica es photothrombotic irradiación de luz, ya que determina el tamaño de las lesiones de infarto. Resultados de irradiación de luz en diferentes efectos en la materia gris y la materia blanca, debido a la dispersión de la luz es más de 4 veces mayor en ma blancatter en comparación con la materia gris 12; En consecuencia, si la intensidad de la luz tiene una irradiancia suficientemente baja (<1,140 mW / mm2), se puede limitar la extensión a la lesión photothrombotic afecta a la medida en la sustancia blanca (es decir., Cápsula interna). Por ejemplo, la luz de mayor energía puede inducir infartos, tanto en la materia gris y blanca, sin embargo, menor energía de la luz puede inducir photothrombosis sólo en la sustancia blanca. Por otra parte, la penetración de la energía de la luz era muy limitado. Aproximadamente el 99% de la energía de la luz se pierde más allá de 1 mm de la fuente de luz 13. Por lo tanto, se espera que los objetivos muy precisos, más baja energía la luz induce photothrombosis sólo en la sustancia blanca con una intrusión mínima de la sustancia gris vecino.
A continuación, se describe un nuevo método para crear lesiones de infarto en la zona de la extremidad anterior de la cápsula interna en los roedores. Se describe el método de identificación de la zona de la extremidad anterior de la ca internapsule, la tecnología de irradiación de luz, incluyendo el ajuste y la entrega de la luz, y la generación de una lesión del infarto. También describimos las pruebas de comportamiento utilizados para evaluar la integridad de la modelización capsular.
Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales del Instituto Gwangju de Ciencia y Tecnología (GIST), y todos los procedimientos fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo en GIST.
1. Pasos Pre-Lesioning
2. PhotothromBotic infarto en lesiones por la cápsula interna
3. Evaluación de las lesiones por infarto capsular
El método que aquí se presenta tiene por objeto crear un infarto capsular circunscrita con un déficit motor persistente. Por lo tanto, es fundamental para determinar correctamente el objetivo dentro de la cápsula interna en la etapa de pre-cirugía. El mapeo somatotopic de fibras piramidales en la cápsula interna no ha sido resuelto hasta la fecha. Para identificar correctamente el objetivo dentro de la cápsula interna, el área de la extremidad anterior deberán estar delimitadas. Una inyección de AAV-GFP en el área de la extremidad anterior de la corteza motora puede rastrear los axones de las fibras piramidales en la cápsula interna (Figura 1). Otros marcadores neuronales, tales como biotina amina dextrano (BDA), se puede utilizar para el mismo propósito. Las coordenadas estereotácticas de la diana dentro de la cápsula interna puede ser dilucidado mediante el trazado de las proyecciones axonales que se originan en la zona de la extremidad anterior de la corteza motora a la cápsula interna.
Figura 1. Identificación de la Zona Extremidad anterior de la cápsula interna 2 semanas después de la inyección de AAV-GFP. GFP-transduced fibras axonales que se originaron en la zona de la extremidad anterior de la corteza motora se muestran en el núcleo ventrolateral del tálamo (flechas) y la porción caudal de la cápsula interna (punta de flecha). La línea punteada indica el contorno de la cápsula interna, y los números se refieren a las distancias desde el bregma. Hipopótamo, el hipocampo; CPU, putamen caudado; VL, núcleo ventrolateral; IC, cápsula interna. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La intensidad de luz óptima puede ser diferente dependiendo de la cepa y el peso corporal del animal y los tipos y diámetros de fibras ópticas. Por lo tanto, la intensidad de luz óptima debe determinarse por separado antes del experimento principal del infarto de lesionar. Usando el procedimiento photothrombotic, la intensidad de la luz se puede aumentar gradualmente hasta que la extensión de la lesión cubre toda la anchura de la cápsula interna sin destruir las estructuras de materia gris vecinos (Figura 2). La intensidad de luz óptima se puede verificar mediante la comparación de la medida histológico de la lesión del infarto y ubicaciones.
Figura 2. extensión del infarto lesiones Al otro lado de mayor o menor intensidad de la luz laser de 2 mW hasta 5 mW 2 semanas después de lesiones por photothrombotic. La intensidad de la luz óptima se considera que es entre 3 y 4 mW mW en este entorno experimental. Las flechas indican la lesión del infarto./53281/53281fig2large.jpg "Target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Preferimos utilizar el ONI en el que la fibra óptica está contenida en un tubo de metal fina (aguja espinal). La fibra óptica puede producir dispersión de la luz mínima de la cara de la fibra, que es probable que genere daños neuronales adicional a lo largo del tracto de fibra óptica. Encasement de la fibra óptica también es ventajoso para evitar la flexión de la fibra óptica en objetivos más profundos, así como para fijar la ONI al marco estereotáctico (Figura 3).
Figura 3. Construcción de la Interfaz óptico-neural (ONI). (A) El corte de la aguja espinal. (B) desprendimiento de la fibra óptica. (C + d) El tubo de metal de anclaje se inserta sobre elfibra óptica despojado y estrecha para asegurar la fibra óptica al cubo de la aguja espinal. (E) La fibra óptica añadido epoxi se inserta en la aguja espinal. (F) El epoxi se endurece a 100 ° C durante 20 min. (G) La fibra óptica se escinde en la punta de la aguja espinal. (H) La fibra óptica se pule. (i) La intensidad de la luz se mide desde la punta de la fibra óptica. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El procedimiento photothrombotic producirá lesiones reproducibles y lugares con ~ 70% de éxito en la alteración motora. Lesión típica del infarto capsular abarca la dimensión ventrodorsal de fibras capsulares (Figura 4A). Por otra parte, la lesión del infarto se extiende a lo largo del eje anteroposterior en la cápsula interna debido a la mayor dispersión de la luz dentro de la fibra capsular. (Figura 4B) El tracto óptico situado debajo de la cápsula interna se compone de fibras de materia blanca; por lo tanto, a menudo se daña por irradiación de un aumento de la intensidad de la luz. Se requieren secciones seriadas y tinción para confirmar todo el volumen y la extensión del infarto. El volumen del infarto fue de 0,63 ± 0,37 mm 3. Para evaluar la destrucción de la fibra capsular, neurofilamentos y manchas Luxol Fast Blue-PAS son útiles.
Figura 4. Aspecto microscópico de capsular de infarto 3 semanas después de Photothrombosis. Aspecto microscópico del infarto capsular 3 semanas después de photothrombosis. A) de cortes de cerebro de la sección coronal en el cerebro de rata. La punta de flecha indica la zona de la aguja que contiene la fibra óptica en el tálamo y hasta cápsula interna. B) tinción de Nissl de serie de la rodajas de cerebro coronal showi ng de toda la extensión de la lesión del infarto en la cápsula interna. Las puntas de flecha indican la lesión del infarto. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El éxito de la modelización puede evaluarse mediante pruebas de comportamiento utilizando un solo pellet alcanzar tarea. El rendimiento de comportamiento después de 1 semana después de la lesioning infarto es una buena guía para confirmar lesioning precisa, que acompaña al deterioro persistente y marcada de SPRT a pesar del entrenamiento diario sola pastilla alcanzar (Figura 5). Una vez que se muestra el déficit motor en el PRG, el déficit neurológico persistió durante el período de 3 meses de observación. simulacro de accionamiento grupo no mostró la disminución significativa de los resultados SPRT después de la operación.
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Figura 5. Cambios en la sola pastilla que alcanzan puntuaciones después de infarto agudo del 4,20 capsular. Los grupos experimentales (PRG y MRG) mostró una significativa disminución de las puntuaciones inmediatamente después de la lesioning del infarto en comparación con el grupo de operación simulada (SOG). El MRG exhibe una recuperación gradual de las actuaciones SPRT, mientras que el GRP exhibe el deterioro motor persistente en el tiempo. Op, photothrombotic lesioning del infarto; PRG, pobres grupo de recuperación; MRG, grupo de recuperación moderada. La significación estadística se determinó utilizando el análisis de medidas repetidas de las varianzas. + SOG frente MRG; * SOG frente PRG. Los datos son medias ± SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El modelo de infarto capsular presentado aquí demuestra una lesión diana con deficiencia motora marcada y persistente en la función de la extremidad anterior. Los modelos anteriores de un derrame cerebral subcortical capsular han demostrado un grado insuficiente de deterioro motor y una rápida 6,8,9 proceso de recuperación. En este sentido, este modelo se asemeja a los casos de infarto capsular clínicos que presentan deterioro funcional a largo plazo.
Los pasos más críticos en el desarrollo de un modelo de infarto capsular circunscrita son: 1) para identificar correctamente la representación somatotopic de la parte del cuerpo destinada a desactivar la función dentro de la cápsula interna; 2) identificar la intensidad óptima del láser verde, que puede destruir todo el ancho de la cápsula interna con la intrusión mínima del vecino estructuras de materia gris; y 3) para colocar con precisión la fibra óptica en la estructura objetivo. Aunque las técnicas presentadas pueden inducir circunscribend modelo de infarto capsular con una alta tasa de replicación (> 70%), pequeñas diferencias en la orientación y el grado de integridad de destrucción que cubren toda la anchura de la cápsula interna puede dar cuenta de los diferentes déficits motores.
El tracto corticoespinal se encuentra en la mitad anterior del brazo posterior de la cápsula interna en los seres humanos a pesar de la controversia de la organización somatotopic 15. Por el contrario, no ha habido ninguna clasificación equivalente o elucidación detallada de la organización somatotópica de la cápsula interna en roedores. La falta de conocimiento sobre la organización somatotopic a menudo conduce a los objetivos incorrectas de lesioning infarto dentro de la cápsula interna con diferentes resultados motores entre los modelos de infarto capsular. Sin embargo, hemos identificado los axones GFP-transduced en la porción caudal de la cápsula interna, lo que probablemente representan la trayectoria de las fibras motoras del miembro anterior. Por otra parte, lesionando de esta zona demonstrated un déficit marcado y persistente de la habilidad de llegar a la extremidad anterior. Por lo tanto, se recomienda la porción caudal de la cápsula interna para lesioning estereotáctica para mejorar la validez del modelo de infarto capsular.
Pre-ajuste de la intensidad de la luz es obligatoria para producir una medida uniforme de la lesión del infarto en modelos de accidente cerebrovascular debido a que la cepa de animal, el peso corporal, la fuente de luz y los tipos de ONI pueden generar diferentes tamaños de miocardio. Por lo tanto, los experimentos preliminares utilizando diferentes intensidades de luz en animales de experimentación con la misma cepa y el peso corporal deben llevarse a cabo hasta que se consigue la lesión del infarto satisfactoria con intensidad de luz mínima.
intensidad de la luz fuerte que puede destruir toda la anchura de la fibra capsular (anterior-posterior y la extensión dorsoventral) que corresponde a la zona de la extremidad anterior con un daño mínimo a las estructuras vecinas se considera que es la intensidad de luz óptima. el forelimb área de la cápsula interna está limitada por el tálamo por encima y el tracto óptico inferior. Por lo tanto, la profundidad de inserción ONI debe ser precisa para destruir toda la extensión de la IC en la dirección dorsoventral, con la preservación simultánea de las estructuras vecinas superiores e inferiores. la colocación inexacta de la ONI resulta en una destrucción incompleta del IC, que conduce a una rápida recuperación del déficit motor como resultado de la plasticidad sináptica de las fibras piramidales restantes en la cápsula interna. En exámenes histológicos de serie, el factor más de confusión en la inducción de un déficit motor persistente fue la colocación incorrecta de la ONI, lo que conduce a la falta de destruir toda la anchura de la PLIC 4,16. Por lo tanto, cuidado se debe prestar atención para alcanzar el objetivo correcto. Recientemente, Blasi et al. Reportó que duradera déficit motor puro se puede producir al hacer una lesión del infarto en cápsula interna posteriorel uso de la endotelina-1 (ET-1) 17. Sin embargo, la ET-1 puede destruir la estructura de la materia gris vecino por la difusión de la ET-1.
Pruebas de comportamiento es un punto de referencia disponible de inmediato en el laboratorio para evaluar la formación de la lesión del infarto en la cápsula interna. Sin embargo, se recomienda una evaluación del rendimiento del motor de una semana después del infarto lesioning para dividir a los animales en grupos de recuperación moderados y pobres. recuperación moderada se definió como un aumento en la puntuación de rendimiento> 50% en comparación con la puntuación antes de lesioning, mientras que una mala recuperación fue definido como la recuperación de <50%. Entre las pruebas de comportamiento del motor de la extremidad anterior, la sola pastilla alcanzar tarea es una de las pruebas más sensibles para ambas mediciones cuantitativas y cualitativas del rendimiento motriz accidente cerebrovascular inducida por 14. La tarea mide cuantitativamente el éxito alcanzando al mismo tiempo proporcionar un análisis del uso de la extremidad anterior, como agarrar y recuperar un alimentobolita. El análisis cualitativo del movimiento alcanzando también es útil para diferenciar la calidad de la recuperación del accidente cerebrovascular distinguiendo genuina recuperación funcional o compensación 20. Aquí, describimos brevemente la medición cuantitativa de la SPRT; Sin embargo, se recomienda un análisis cualitativo mediante la filmación y de puntuación basado en un análisis cuadro por cuadro para un análisis más detallado.
Las técnicas presentadas aquí no tienen por qué limitarse a la inducción de la modelización del infarto capsular circunscrito. La técnica se puede aplicar a la inducción de una lesión del infarto en otras áreas de materia blanca, tales como el cuerpo calloso, comisuras anterior y fibras de conexión entre las estructuras neurales. La combinación de la pequeña ONI y photothrombotic técnica basada en las propiedades ópticas de la materia blanca es capaz de destruir las estructuras específicas con un daño mínimo a las estructuras vecinas. Por ejemplo, infartos lacunares se pueden producir fácilmented apuntando a las estructuras subcorticales relacionados con las funciones motoras, cognitivas y de memoria. Cuando la estructura objetivo es grande, múltiples inserciones de la ONI y diferentes de orientación y ángulo trayectorias pueden ser necesarios para producir el grado deseado de las lesiones.
Existen varias limitaciones en esta técnica. La técnica es suficiente para demostrar la consecuencia de lesioning infarto en el PLIC y posterior recuperación. Sin embargo, este modelo no refleja todo el espectro de WMS humanos debido a la destrucción de la materia blanca photothrombotic difiere ligeramente de WMS humanos. En consecuencia, los hallazgos de imagen de resonancia magnética o neurobiológicos pueden presentar diferentes características en la etapa temprana de lesioning photothrombotic. Por lo tanto, este modelo se debe utilizar adecuadamente para el comercio fuera ventajas y desventajas del modelo. Técnicamente, no todas las cirugías pueden producir el marcado déficit motor y permanente en este modelo, ya que requiere procedimientos muy precisos. Specifically, se requieren manos con formación y experiencia para producir la alta reproducibilidad en la generación de este modelo.
En conclusión, el uso combinado de una técnica photothrombotic, la optimización de la intensidad de la luz, y la orientación correcta es una técnica útil para producir un modelo de infarto capsular circunscrito. Este modelo será útil no sólo para estudiar WMS en el comportamiento, circuito, y los niveles celulares, sino también para evaluar la utilidad de las nuevas intervenciones terapéuticas y de rehabilitación.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por una beca del Instituto de Medicina Ingeniería de Sistemas (Imse) y Fondo GIST-Caltech Collaborative (K04592) de GIST y por el Programa de Investigación de Ciencias Básicas a través NRF de Corea financiado por el Ministerio de Ciencia, las TIC y la planificación futura (NRF-2013R1A2A2A01067890).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DC Temperature controller | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC. | ATC1000 | |
Digital Stereotaxic Instruments | STOELTING CO. | 51900 | |
Electrical Stimulator | CyberMedic Corp. | EMGFES 2000 | |
Epoxy | Precision Fiber Products, INC. | PFP-353ND1 | Mix Ratio: 10(A):1(B-hardener) by weight Curing Schedule: 1 min @150 °C 2 ~ 5 min @120 °C 5 ~ 10 min @100 °C 15 ~ 30 min @80 °C |
Fiber Optic Scribe | THORLABS, INC | S90R | |
Fiber patch cable | KOREA OPTRON Corp. | Outer diameter: 3 mm Ø200 µm 0.39 NA FC/PC-FC/PC 1 m | |
Laser Power Supply | CHANGCHUN NEW INDUSTRIES OPTOELECTRONICS TECH. CO., LTD. | MGL-FN-532nm-200mW-14010196 | |
Crimp ring | DAWOOTECH CO.,LTD. | Length: 19 mm Inner diameter: 3 mm Outer diameter: 3.8 mm Material: SUS | |
Micro4-micro syringe pump controller | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | 95100 | |
Optical Power Meter | THOLABS, INC | PM100D | |
Diamond lapping (polishing) sheet | THORLABS, INC | LF3D | Grit : 3 µm |
Diamond lapping (polishing) sheet | THORLABS, INC | LF6D | Grit : 6 µm |
Rose Bengal | SIGMA-ALDRICH CO. LLC. | 330000 | |
Needle for spinal anesthesia with pencil point tip (Spinal needle) | B.BRAUN MELSUNGEN AG | 4502027 | Size: 27 G Length: 88 mm Needle: 0.40 mm |
Waterproof sandpaper | DEERFOS CO.,LTD | CC261 | Grit : 1,000 µm |
Nanofil 10 µl syringe | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | NANOFIL | |
Nanofil 33 G BVLD needle | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | NF33BV-2 | |
AAV-GFP virus | UNC Vector Core | AAV2-CamKIIa-eYFP | 2 x 1012 virus molecules/ml |
Anti-Green Fluorescent Protein, Rabbit IgG fraction | Life Technologies, INC | A11122 | primary antibody (1:200) |
Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) | Life Technologies, INC | A11034 | secondary antibody (1:500) |
Ceftezole | GUJU Pharma CO.,LTD. | A27802741 | 0.1%, 1 ml |
Lidocain hydrochloride injection | JEIL PHARMACEUTICAL CO.,LTD. | A04900271 | 2%, 1 ml |
Hand Piece Drill | Seshin | ||
Digital optical power and energy meter | THORLABS, INC | PM100D | |
Ketoprofen | UNIBIOTech |
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