Utilisation quantitative PCR en temps réel pour déterminer prise de greffe de donneurs de cellules dans un modèle murin concurrentiel greffe de moelle osseuse

Détermination de la prise de greffe de cellule donneuse présente un défi dans des modèles de souris moelle osseuse greffe qui n'ont pas bien définis marqueurs phénotypiques. Nous avons décrit une méthodologie pour quantifier les hommes greffe de cellule donneuse dans des souris femelles bénéficiaires de greffes. Cette méthode peut être utilisée dans toutes les souches de souris pour l'étude des fonctions HSC.

Modèles murins de greffe de moelle osseuse constituent un outil important pour mesurer de cellules souches hématopoïétiques (CSH) et les gènes qui déterminent les fonctions / molécules qui régulent la CSH. Dans ces systèmes, le modèle de transplantation, la fonction des cellules souches hématopoïétiques est déterminé par la capacité de ces cellules à des souris greffer et reconstituer bénéficiaires irradiées de façon létale. Communément, la cellule donneuse contribution / prise de greffe est mesurée par des anticorps spécifiques aux bailleurs de protéines de surface cellulaire par cytométrie en flux. Cependant, cette méthode dépend fortement de la spécificité et de la capacité du marqueur de surface cellulaire pour différencier des bailleurs de fonds des cellules dérivées de cellules destinataire-nées, qui peuvent ne pas être disponibles pour toutes les souches de souris. Compte tenu de la diversité des souches de souris génétiquement modifiées sur le marché, cette surface cellulaire / cytométrie de flux basé sur la méthode comporte des limites importantes en particulier dans les souches de souris qui n'ont pas bien définis marqueurs de surface de cellules du donneur séparer congéniques destinataire CElls. Ici, nous avons enregistré une technique basée sur la PCR pour déterminer la prise de greffe de cellule donneuse / contribution à des souris receveuses de transplantation. Nous avons transplanté hommes CSH donneurs de moelle osseuse de souris irradiées de façon létale congéniques femmes. Échantillons de sang périphérique ont été prélevés au moment de post-transplantation différents points. Des échantillons de moelle osseuse ont été obtenus à la fin des expériences. L'ADN génomique a été isolé et le gène du chromosome Y spécifique, Zfy1, a été amplifié par PCR en temps réel quantitative. La prise de greffe des hommes donneurs de cellules dérivées des souris receveuses femelles a été calculé par rapport à la courbe standard avec pourcentage connu des ADN masculins vs femme. Bcl2 a été utilisé comme gène de référence pour normaliser la quantité d'ADN total. Nos données suggèrent que cette approche permet de déterminer de manière fiable la prise de greffe de cellule donneuse et fournit une méthode utile, mais simple dans la mesure de la reconstitution hématopoïétique dans des modèles murins de transplantation de moelle osseuse. Notre méthode peut être effectué systématiquement dans la plupart des laboratoires, car aucunéquipements coûteux comme la cytométrie de flux est nécessaire.

Murin moelle osseuse (MO) transplantation modèle a été développé dans les années 1960 ^1. Ce modèle a été largement utilisé pour l'étude des cellules souches donateurs hématopoïétiques (CSH) la biologie dans une souris hôte receveur. Murin modèle de greffe de moelle osseuse nous a fourni de précieuses connaissances sur les fonctions HSC et de leur régulation et est indispensable dans la recherche HSC. Allogénique modèle greffe de moelle osseuse comme C57BL/6J ^H2b-souris Balb / C ^H2d ou d'un modèle de transplantation congéniques ^CD45.2 comme C56Bl/6J-B6.SJL ^CD45.1 sont utilisés dans de nombreux laboratoires pour étudier la fonction des gènes sur l'activité HSC ^2, effet de traitement de la toxicomanie sur les maladies de fonction ³ ou greffe de CSH connexes tels que la réaction du greffon contre l'hôte (GvHD) ^4.

Marqueurs de surface cellulaire tels que haplotype CMH ou CD45.1 sont couramment utilisés pour distinguer les donneurs de cellules dérivées de cellules de destinataire origine. C57BL/6J ^{H2b, CD45.2} , Balb / C ^H2d et B6.SJL ^CD45.1 sont les souches de souris les plus couramment utilisés dans la greffe de moelle osseuse, car la contribution cellule donneuse peut être facilement évaluée par cytométrie en flux mesure CD45.1 vs vs CD45.2 ou H2b H2D. Cependant, de nombreuses autres souches telles que FVB / NJ ⁵ et C3H sont également souvent utilisé pour générer transgénique ou génétiquement des souris knockout. Ces souris peuvent être recroisé à une lignée consanguine et maintenus dans un mélange génétique / CMH arrière-plan. Dans ces cas, la détermination de la prise de greffe de cellule donneuse et la fonction HSC pourrait être difficile en tant que marqueurs de surface spécifiques des donneurs de cellules peuvent ne pas être disponibles.

Utilisation du chromosome Y spécifique sonde d'ADN pour détecter les cellules du donneur mâle par transfert de Southern de sexe dépareillés greffe de moelle osseuse a été développé par le groupe du Dr Miwa ^6. Ensuite, une PCR en temps réel pour la région Y détermination du sexe a été jugée une méthode précise et hautement spécifique pour quantifier macellules fœtales LE dans le système sanguin maternel ^7. Ce concept a été adapté par le groupe du Dr Schwarzenberger pour le développement d'une technique de PCR en temps réel dans un modèle de transplantation de moelle osseuse murine pour déterminer la prise de greffe de cellule donneuse ^8. Nous avons également modifié cette méthode pour la mesure de la prise de greffe de cellule donneuse dans FVB / NJ modèle osseuse de souris greffe de moelle. Cette méthode est actuellement largement utilisés dans notre groupe pour étudier le rôle de la kinase PIM1 en biologie HSC.

1. Isolement de cellules de moelle osseuse

1. Euthanasier mâles donneurs FVB / NJ souris et femelles FVB / NJ souris utilisant le CO ₂ méthode suivie par dislocation cervicale. Les femelles FVB / NJ cellules de moelle osseuse seront utilisées comme cellules compétitifs.
2. Utilisez de petits ciseaux et des pinces, disséquer les fémurs et tibiaes de souris et de les placer dans une boîte de culture tissulaire de 60 mm contenant 6 ml RPMI1640 glacée avec du FBS inactivé chaleur 5%. Utilisez le tissu Kimwipe pour enlever les muscles et d'autres tissus. Couper les deux extrémités de chaque corps d'os dans le plat.
3. Branchez l'extrémité de l'os avec une aiguille 23G sur une seringue de 3 cc, rincer la moelle osseuse avec RPMI1640 avec du FBS inactivé chaleur 5% dans le plat. Désagréger les tissus de moelle osseuse par des aspirations répétées en utilisant la même aiguille. Transférer la suspension cellulaire à 15 ml du tube de centrifugation.
4. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 400 xg, éliminer le surnageant, remettre en suspension les cellules dans 1 ml de sang température ambiante tampon de lyse des globules rouges (155 mM de pbicarbonate de otassium, 10 mM de chlorure d'ammonium, 0,1 mM d'EDTA, pH = 7,4) et incuber à température ambiante pendant 5 min, puis ajoutez 5-10 ml de RPMI 1640 avec du FBS inactivé chaleur 5%.
5. Passez les cellules à travers un tamis cellulaire. Recueillir le débit à travers un nouveau tube. Centrifuger pendant 5 min à 400 x g. Retirer le surnageant, le culot cellulaire ne doit contenir aucune couleur rouge. L'absence de couleur rouge indique une suppression complète des globules rouges. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de RPMI 1640 avec du FBS inactivé chaleur 5%. Vortexer doucement pour s'assurer que la suspension cellulaire est complètement uniforme. Prélever une partie aliquote et compter les cellules dans un hémocytomètre. Calculez combien de volume de cellules nécessaires pour la transplantation de moelle osseuse et de cellules aliquotes et mélanger suffisamment de cellules du donneur avec des cellules mâles concurrents femelles à un ratio de 5:2. Centrifuger pendant 5 min à 400 xg, laver avec du PBS, remettre en suspension dans du PBS à la concentration finale de cellules du donneur à 5 x 10 cellules ⁶ / ml et un concurrent à 2 × 10 ⁶ / ml.

2. Concurrentiel greffe de moelle osseuse

1. Souris irradier bénéficiaires féminins (8-12 semaines d'âge) avec des rayons gamma radiateur à une dose unique de 11Gy 4-6 heures avant la transplantation de moelle osseuse 137Cs.
2. Placez les souris irradiées de sexe féminin dans un dispositif de retenue de la souris. Injecter le donateur mixte et les cellules concurrents via la veine caudale dans 0,1 ml de volume total de sorte que chaque souris reçoit ⁵ × 10 5 cellules du donneur et 2 × 10 ⁵ cellules de la moelle osseuse concurrents.

3. Prélèvement des échantillons

Couples semaine après la transplantation de moelle osseuse, de prélever des échantillons de sang périphérique (~ 50 pi) de la souris femelle receveuse par rétro-orbitaire saignement sous condition de l'anesthésie. Les échantillons sont prélevés dans des tubes EDTA enduits. Échantillons BM peuvent également être recueillies à la fin de l'expérience, le plus souvent au moins 4 post-transplantation mois, avec les mêmes procédures que décrites précédente (étape 1);% habituellement 20-40 du1 tibia cellules BM sont assez pour faire une quantité suffisante d'ADN. Échantillons de sang ou de BM âge appariés normaux chez les souris femelles et mâles sont également recueillies pour préparer la courbe standard.

4. Isolement de l'ADN génomique

1. Ajouter 4 × volume de la chambre de lyse RBC température tampon (~ 200 pi) pour chaque échantillon de sang. Bien mélanger et incuber à température ambiante pendant 5 min. Ajouter 1 ml de PBS, puis tourner vers le bas pour enlever la plupart des lysé RBC.
2. Isoler l'ADN en utilisant un kit d'extraction de sang ADN (ADN QIAmp sang kit d'extraction). Préchauffer le tampon d'élution (AE) à 37 ° C afin d'améliorer le rendement de l'ADN élué. ADN masculins et féminins pour la courbe standard sont isolés de façon similaire.
3. (Facultatif) ADN génomique peut être encore purifié ou concentré selon la méthode de précipitation EtOH en présence d'acétate de sodium 3 M (pH = 5,5). Les culots d'ADN sont ensuite remises en suspension dans 40-50 ul d'eau distillée pour l'analyse immédiatement ou conservés à -20 ° C pour une utilisation ultérieure.
4. Mesurer la concentr ADNtion avec photomètre ND-1000 spectres Nanodrop. Les échantillons présentant des DO 260/280 entre 1,8 à 2,0 sont utilisés pour une analyse plus approfondie.
5. Diluer avec l'ADN DNase sans H ₂ O à 4ng/μl dans un volume total de 50 ul.

5. Préparation courbe standard

Diluer l'ADN masculin et féminin ADN à une concentration de 4 ng / ul, et rendre le mélange d'ADN selon la Table1

La préparation des échantillons tableau 1. Pour la courbe standard. Normales hommes et femmes FVB / NJ souris à l'âge de 8-12 sem ont été sacrifiés. Les cellules sanguines et BM ont été recueillies. ADN provenant de cellules mâles et des cellules femelles ont été isolées et remises en suspension à une concentration de 4ng/μl. Les ADN masculins et féminins ont été mélangés à des taux différents pour générer les mélanges d'ADN d'échantillons standard.

6. PCR en temps réel

1. Mettre en place la plaque de réaction PCR en mélangeant SYBR Green Supermix réactif avec des amorces et l'ADN génomique. Le volume de réaction (20 pi) contient 400 nM de chaque amorce et 5 pi d'ADN génomique de cellules sanguines (4ng/μl x5 pi = 20 ng) dans chaque réaction. ADN samples normes et ont été établis en trois exemplaires. Les séquences d'amorces sont présentés dans le tableau 2.

Tableau 2. Séquence de l'amorce de RT-PCR pour Bcl2 murin et Zfy1.

2. Effectuer la réaction de PCR en utilisant Biorad iQ5 machine de PCR dans les conditions suivantes: 95 ° C 3 min, 42 cycles d'amplification de 95 ° C pendant 10 sec, 58 ° C pendant 25 s et 72 ° C pendant 15 s, suivi d'une courbe de fusion- l'étape.
3. Obtenir cycle seuil (Ct) des valeurs par Bio-Rad iQ5 2.1 Système Standard Edition optique. Calculer δCt (Ct ^{Zfy1 <}/ Sup> ^Ct-Bcl2) valeur, et Zfy1 niveau d'expression est calculée en tant que valeur de ^{2-δ Ct.}
4. Établir des courbes d'étalonnage pour chaque série de réactions utilisant du ^2-δCt lecture à partir connues mâle / femelle mélanges étalons. Les courbes d'étalonnage sont générées par le moyen de pointage ^2-δCt valeur de triplicatas à l'ADN mâle% connue dans le mélange avec ajustement de la régression linéaire.

Figures 1 et 2 montrent des exemples de courbes de référence tracées avec des valeurs moyennes de ^2-δCt contre pourcentages d'ADN masculin. Figure 1A montre la température de fusion spécifique pour Bcl2 et Zfy1 amplicons localisés à 78,5 ° C et 88,5 ° C respectivement. Bcl2 est utilisé en tant que gène de référence pour normaliser la quantité totale d'ADN chargé dans chaque réaction de PCR. Bcl2 courbes d'amplification (vue Log) pour chaque échantillon standard fusionner avec l'autre indépendante de la concentration d'ADN masculin, ce qui indique la même quantité de l'ADN chargé (figure 1B). Cependant, Zfy1 courbe d'amplification migré vers la gauche avec une quantité croissante d'ADN masculin dans l'échantillon (figure 1C). Pour valider notre méthode, nous avons testé hommes greffe de cellule donneuse chez les souris transplantées recevant cellules BM à partir WT vs Pim triple élimination (TKO) au moment de souris post-transplantation différents points. Fois dans le sang périphérique (6wks) et des échantillons BM (16wks) w avant analyse. CSH de souris TKO Pim ont des défauts dans la reconstitution des souris irradiées de façon létale (An, N et al., Manuscrit en cours de révision). Comme prévu, les souris receveuses transplantées avec des cellules TKO Pim avait un pourcentage beaucoup plus faible de cellules mâles par rapport à des souris transplantées avec des cellules WT (figure 3).

Figure 1. (A) courbe de fusion représentant de multiples échantillons avec différents pourcentages d'ADN masculins. Le pic à 78,5 indique une amplification de Bcl2, tandis que le pic à 88,5 ° C indique l'amplification de ZFY-1. Courbe d'amplification représentant de multiples échantillons d'ADN avec un pourcentage différent de Bcl2 mâle (B) et Zfy1 (C), Ct: seuil cycle.= "Http://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50193/50193fig1large.jpg" target = "_blank"> Cliquez ici pour agrandir la figure.

Figure 2. RT-PCR courbe standard pour le pourcentage d'ADN masculin. Échantillons (20 ng d'ADN dans 20 ul volume total) de mélanges d'ADN masculins et féminins obtenus à partir de cellules de moelle osseuse ont été traités pour la RT-PCR comme décrit dans le protocole. Les valeurs moyennes de δCt (Ct-Ct ^{Zfy1 Bcl2)} pour les échantillons individuels ont été calculés et ^{2-δ Ct} (axe Y) ont été tracées à l'encontre pourcentage d'ADN masculin (axe X) (intervalle de 0,2% à 100%) avec une régression linéaire agencement. R2 représente le coefficient de détermination.

Figure 3. Competitive greffe de moelle osseuse expériences. 5 x 10 ⁵ cellules totales BM du WT mâle ou appariés pour l'âge masculine Pim triple KO (TKO) souris avec 2 x 10 ⁵ cellules concurrents féminins moelle osseuse ont été transplantés dans des hôtes femelles irradiées. Du sang périphérique (PB) chimérisme à 6 semaines et chimérisme BM à 16 semaines post-transplantation ont été estimés par le pourcentage d'ADN mâle par RT-PCR comme décrié dans le protocole (* p <0,05, ** P <0,01).

L'objectif de notre étude est de fournir aux spectateurs une technique basée sur la PCR pour quantifier la prise de greffe de cellule donneuse dans un modèle concurrentiel osseuse murine greffe de moelle. Plusieurs études ont été rapportés par RT-PCR pour détecter les cellules du donneur dans des modèles de transplantation ^9-10. Le groupe du Dr Schwarzenberger a d'abord développé un modèle murin de greffe de moelle osseuse en utilisant PCR en temps réel pour amplifier chromosome Y spécifique ^8. Cette méthode a été utilisée pour étudier Gli-1 fonction dans l'activité HSC ^11. Nous avons ensuite encore modifié le protocole et a fourni une analyse détaillée, étape par étape protocole expérimental en format visualisé. La présentation visualisée de notre protocole permet au public de suivre notre protocole facilement. Nous avons également comparé nos résultats de la PCR en utilisant l'ADN génomique à partir d'échantillons d'ADN vs BM du sang périphérique. Les données de prise de greffe des donateurs BM et des échantillons de sang sont fondamentalement en accord, cependant, la variation généralement moins a été trouvée dans les échantillons BM. C'estprobablement due à l'hémoglobine résiduelle après lyse des globules rouges dans le sang périphérique, qui puisse compromettre la pureté / qualité de l'ADN génomique dans les échantillons de sang.

Il ya plusieurs avantages à notre base de PCR technique pour quantifier la prise de greffe de cellules du donneur. Premièrement, notre technique peut être réalisée dans la plupart des laboratoires. Il n'y a pas besoin d'équipement spécialisé et coûteux en temps réel autre que la machine-PCR. Nous avons également modifié composant de réaction PCR et utilisé SYBR Green Supermix au lieu de Taqman. Ce changement réduit encore les coûts et dépenses que nous éliminer la sonde marquée par fluorescence. Deuxièmement, notre technique est fiable et hautement reproductibles. Nous avons utilisé le gène Bcl2 de référence pour normaliser la quantité d'ADN total par opposition à Kit de quantification d'ADN. Gène bcl2 a été utilisée parce que: 1) ce gène n'est pas situé sur le chromosome Y. Par conséquent, son expression n'est pas affectée par la prise de greffe donneur de cellules mâles. 2). Bcl2 n'est pas réglementé dans les conditions actuelles de transplantation. Comme shpropre à la figure 1, Bcl2 gène produit un contrôle fiable et très cohérents pour le chargement indépendant de l'ADN total loaded quantité d'ADN mâle. Zfy1 est un gène de doigt de zinc dans les testicules de détermination région ¹² et est situé sur le chromosome Y. Il a été rapporté que le niveau d'expression génique de Zfy1 correspond bien à la quantité d'ADN de cellules mâles dans un modèle murin de transplantation ^8. Troisièmement, notre technique basée sur la PCR est très sensible et permet de détecter la prise de greffe de cellule donneuse à <1%. En outre, les échantillons peuvent être conservés pendant longtemps pour une analyse ultérieure. En revanche, le flux conventionnelle basée sur la cytométrie méthode nécessite le traitement d'échantillons immédiat. Enfin, notre technique est la souche de souris indépendante et peut être utilisé pour le fond génétique qui manque de marqueurs de surface bien définies pour les cellules du donneur séparer les cellules receveuses. C'est l'avantage le plus important de cette méthode.

En vertu de notre condition expérimentale actuelle (donneur / compétou le rapport est 5/2), nous avons observé autour de la prise de greffe des donateurs de 80-90% à 16 semaines en utilisant la méthode basée sur la PCR. Nos données sont tout à fait comparables avec conventionnelle, basée sur la cytométrie en flux, méthode qui a montré la prise de greffe ~ 95% cellule donneuse à 16 après la transplantation semaines avec des bailleurs de fonds (CD45.2) / concurrent (CD45.1) Ratio de 4:1 ^2. Par rapport à la méthode classique qui utilise marqueur de surface cellulaire pour détecter les cellules du donneur dans les souris receveuses, l'inconvénient majeur de notre méthode est l'incapacité à analyser la prise de greffe dans diverses sous-populations de cellules sanguines telles que dans les lymphocytes B, les cellules T ou des granulocytes. Toutefois, en cas de besoin, il est possible de collecter chaque population de cellules en utilisant la technique de tri cellulaire, puis soumis les échantillons pour la RT-PCR pour déterminer la contribution cellule donneuse dans chaque population de cellules. Depuis la prise de greffe de cellule donneuse a été calculé sur la base de la courbe standard, la lecture de l'échantillon est totalement dépendant de la pente et ordonnée à l'origine de la courbe standard. Il est possible que nous puissions descendre de gamme raisonsdout (soit plus de 100% de la greffe). Cependant, ces «faux positifs ou faux négatifs» peuvent être évités si: 1) les procédures d'isolement d'ADN pour les échantillons testés et les échantillons courbe standard sont identiques, et 2) la gamme choisie de courbe standard est proche de la lecture d'échantillon attendue. En outre, puisqu'il peut y avoir des différences dans chaque réaction PCR et le statut de l'étalonnage de la machine PCR, les échantillons courbe standard doivent être inclus dans chaque plaque PCR pour éviter les variations entre chaque réaction de PCR.

Enfin, nous avons validé notre technique en utilisant nos Pim triple souris KO. Conformément au rapport précédent ^13, nous avons constaté que les CSH donateurs de souris KO Pim triples sont défectueux dans la reconstitution des souris receveuses irradiées de façon létale.

Nous n'avons pas d'intérêts financiers concurrents de divulguer.

Nous remercions le Dr Charles Greenberg pour l'utilisation de sa machine PCR en temps réel. Ce travail est soutenu par MUSC Hollings Cancer Center fonds de démarrage, Hollings Cancer Center ACS IRG, ASCO Conquer Cancer Foundation Award développement de carrière, le NIH 1K08HL 103780-01A1, et les NIH 3P30CA138313-01S3. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les vues officielles de la National Institutes of Health ou des agents de financement.