Nuestra investigación se centra en las infecciones por Staphylococcus aureus con el objetivo de establecer un modelo de infección intercelular. Este modelo proporcionará información valiosa sobre el mecanismo subyacente a las infecciones intercelulares y contribuirá al desarrollo de una edad estricta para su prevención y tratamiento. Los últimos avances en la infección intracelular por Staphylococcus aureus son el estudio del mecanismo de infección para regular la supervivencia y la propagación de las bacterias dentro de la célula, y se agregarán para optimizar el fármaco y la modificación estructural para mejorar el efecto terapéutico.
Este campo de investigación utiliza el cultivo celular, la tecnología de secuenciación emergente de células, las termias oxitérmicas de alto combustible, la tecnología de edición de genes y otras tecnologías relacionadas para estudiar la infección bacteriana en las células. A diferencia de los modelos tradicionales de infección, hemos refinado las condiciones experimentales específicas de las infecciones intracelulares. Después de infectar las células con Staphylococcus aureus individualmente, las células infectadas por las bacterias se inoculan en ratones para establecer infecciones intracelulares.
Este enfoque mejora la eficiencia al minimizar la interferencia de las bacterias libres, lo que garantiza una retención más precisa del proceso de infección intracelular. Nuestro método se centrará en el desarrollo de fármacos de anticuerpos y avanzará para prevenir y tratar las infecciones bacterianas en el futuro. Para preparar un caldo con un 6% de almidón, agregue extracto de carne de res en polvo, triptona y cloruro de sodio a un recipiente de vidrio sucesivamente en la proporción de masa de 3 a 10 a 5.
Agregue 100 mililitros de agua destilada doble y revuelva para disolver los componentes. Calienta la solución en el microondas. Luego, agregue almidón soluble en una proporción de masa de 6 y revuelva la mezcla hasta que se disuelva por completo.
Esterilizar el caldo en autoclave a 121 grados centígrados durante 30 minutos. Una vez esterilizado, guarde el caldo a cuatro grados centígrados hasta que se forme una pasta. Para recolectar macrófagos peritoneales de ratón, con la mano izquierda, agarre el cuello del ratón y controle su cola.
A continuación, voltee el ratón para que su cabeza quede hacia abajo y su abdomen hacia arriba. Administrar una inyección intraperitoneal de tres mililitros de caldo de almidón al 6% en el ratón. Después de 72 horas de la inyección, sacrificar el ratón anestesiado y desinfectarlo con alcohol etílico al 75%.
Con unas tijeras oftálmicas, corte el abdomen del ratón para exponer completamente el peritoneo. Inyectar 10 mililitros de DMEM en la cavidad abdominal mediante inyección intraperitoneal. Frote suavemente el abdomen durante un minuto para lavar la cavidad.
Luego, use una jeringa para recolectar el líquido lavado en un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugar el líquido de lavado a 300 g durante cinco minutos y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet celular en 10 mililitros de DMEM suplementado con 10% de FBS, penicilina y estreptomicina.
Tome 10 microlitros de suspensión celular y agréguelo al contador de células para contar las células. Diluya las células a una concentración de 2 veces 10 a la potencia de 6 células por mililitro con DMEM FBS. Coloque un mililitro de suspensión celular por pocillo en una placa de seis pocillos.
Incubar la placa a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante cuatro horas. Después de la incubación, retire el sobrenadante. Lavar las células dos veces con PBS estéril y cultivarlas durante la noche con un mililitro de DMEM por pocillo en las mismas condiciones.
Incubar los macrófagos peritoneales con Staphylococcus aureus MRSA-252 durante dos horas. Retire el sobrenadante y lave las células dos veces con PBS. Añadir un mililitro por pocillo de medio DMEM completo que contenga 100 microgramos por mililitro de gentamicina e incubar durante dos horas a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.
Después de la incubación, lave las células tres veces con PBS. Con un raspador de células, recoja los macrófagos peritoneales en tubos de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugar las muestras a 1000 g durante cinco minutos.
Añadir 10 microgramos por mililitro de lisozima a los macrófagos infectados con MRSA-252 intracelular, e incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Después de lavar las celdas dos veces con PBS, vuelva a suspenderlas en un mililitro de PBS. A continuación, saca unos 20 microlitros de alícuota y añade 0,1%Triton X-100 durante cinco minutos para lisar las células.
Realice diluciones en serie de la suspensión de células lisadas con PBS y colóquelas en una placa tríptica de barrena de soja. Incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, cuente las colonias bacterianas para calcular la bacteria MRSA-252 intracelular en macrófagos peritoneales.
Coloque al ratón bajo una lámpara infrarroja de fisioterapia hasta que la vena de la cola se dilate. Divide aleatoriamente a los ratones en cuatro grupos. Inyecte por vía intravenosa 3 veces 10 a la potencia de 6 UFC Planctonic MRSA-252 en la vena de la cola del ratón.
Después de 24 horas, sacrificar el ratón anestesiado y desinfectarlo a fondo con alcohol etílico al 75%. Use pinzas con una mano para levantar la piel abdominal y con la otra mano corte la piel con tijeras oftálmicas. Localiza los riñones en la cavidad abdominal y desmárcalos por completo.
Transfiera los riñones a un tubo de molienda que contenga un mililitro de PBS y triélelos hasta que no quede tejido sólido. Vierta el tejido homogeneizado en el tubo Eppendorf. Realizar diluciones seriadas del homogeneizado de tejidos mediante PBS.
Localice cada dilución en placas de barrena de soja tríptico separadas e incube durante la noche a 37 grados centígrados. Cuente las colonias bacterianas al día siguiente y analice los datos. Los modelos de infección intracelular de S. aureus se establecieron con éxito en condiciones optimizadas de fagocitosis y tratamiento antibiótico prolongado con algunas bacterias que sobrevivieron dentro de los macrófagos.
Los macrófagos infectados con S. aureus resistente a la meticilina retuvieron bacterias intracelulares después de dos horas de tratamiento con antibióticos cuando el sobrenadante ya no contenía bacterias. In vivo, los ensayos de colonización bacteriana en ratones mostraron que la vancomicina eliminó el S. aureus extracelular, pero no logró eliminar las bacterias intracelulares.
