Наше исследование сосредоточено на инфекциях, вызванных золотистым стафилококком, с целью создания модели межклеточной инфекции. Эта модель позволит получить ценную информацию о механизме, лежащем в основе межклеточных инфекций, и будет способствовать разработке строгого возраста для их профилактики и лечения. Последним достижением в области внутриклеточной инфекции Staphylococcus aureus является изучение механизма инфекции для регулирования выживаемости и распространения бактерий внутри клетки, а также добавление к оптимизации препарата и структурной модификации для улучшения терапевтического эффекта.
В этих областях исследований используются клеточные культуры, технология секвенирования новых клеток, кислородные термометры с высоким уровнем топлива, технология редактирования генов и другие связанные технологии для изучения бактериальной инфекции в клетках. В отличие от традиционных моделей инфекций, мы уточнили экспериментальные условия, специфичные для внутриклеточных инфекций. После индивидуального заражения клеток золотистым стафилококком, инфицированные бактериями клетки затем инокулируются мышам для установления внутриклеточных инфекций.
Такой подход повышает эффективность за счет минимизации вмешательства свободных бактерий, обеспечивая более точное удержание внутриклеточного инфекционного процесса. Наш метод будет сосредоточен на разработке препаратов на основе антител и продвижении в области профилактики и лечения бактериальных инфекций в будущем. Чтобы приготовить бульон из 6%-ного крахмала, добавьте порошок говяжьего экстракта, триптон и хлорид натрия в стеклянную емкость последовательно в массовом соотношении 3 к 10 к 5.
Добавьте 100 миллилитров дважды дистиллированной воды и перемешайте до растворения компонентов. Нагрейте раствор в микроволновой печи. Затем добавьте растворимый крахмал в соотношении по массе 6 и размешайте смесь до полного растворения.
Автоклавируйте бульон при температуре 121 градус Цельсия в течение 30 минут. После стерилизации храните бульон при температуре четыре градуса Цельсия, пока он не превратится в пасту. Чтобы собрать перитонеальные макрофаги мыши, с помощью левой руки захватите шею мыши и управляйте ее хвостом.
Затем переверните мышь так, чтобы ее голова была направлена вниз, а живот — вверх. Введите мышке трехмиллилитровую внутрибрюшинную инъекцию 6%-ного крахмального бульона. После 72 часов инъекции принесите в жертву мышь, находящуюся под наркозом, и продезинфицируйте ее 75% этиловым спиртом.
С помощью офтальмологических ножниц разрежьте брюшную полость мыши, чтобы полностью обнажить брюшину. Введите 10 миллилитров DMEM в брюшную полость посредством внутрибрюшинной инъекции. Аккуратно потрите живот в течение одной минуты, чтобы промыть полость.
Затем с помощью шприца наберите промытую жидкость в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров. Центрифугируйте жидкость для промывания при 300 G в течение пяти минут и выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 10 миллилитрах DMEM с добавлением 10% FBS, пенициллина и стрептомицина.
Возьмите 10 микролитров клеточной суспензии и добавьте ее в счетчик клеток для подсчета клеток. Развести клетки до концентрации в 2 раза 10 в степени 6 клеток на миллилитр с помощью DMEM FBS. Нанесите один миллилитр клеточной суспензии на лунку на шестилуночный планшет.
Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение четырех часов. После инкубации удалите надосадочную жидкость. Дважды промойте клетки стерильным PBS и культивируйте их в течение ночи одним миллилитром DMEM на лунку в тех же условиях.
Инкубировать перитонеальные макрофаги с золотистым стафилококком MRSA-252 в течение двух часов. Удалите надосадочную жидкость и дважды промойте клетки PBS. Добавьте один миллилитр на лунку полной среды DMEM, содержащей 100 микрограммов гентамицина на миллилитр, и инкубируйте в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе.
После инкубации трижды промойте клетки PBS. С помощью скребка для клеток соберите перитонеальные макрофаги в центрифужные пробирки объемом 50 миллилитров. Центрифугируйте образцы при 1000 G в течение пяти минут.
Добавьте 10 мкг на миллилитр лизоцима к макрофагам, зараженным внутриклеточным MRSA-252, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут. После двукратного промывания клеток PBS повторно суспендируйте их в одном миллилитре PBS. Затем достаньте около 20 микролитров аликвоты и добавьте 0,1% Triton X-100 на пять минут, чтобы лизировать клетки.
Выполняйте последовательные разведения суспензии лизированных клеток с помощью PBS и капайте их на триптическую соевую шнековую пластину. Инкубируйте тарелку в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию. На следующий день подсчитайте колонии бактерий, чтобы рассчитать внутриклеточные бактерии MRSA-252 в перитонеальных макрофагах.
Поместите мышь под инфракрасную физиотерапевтическую лампу до тех пор, пока хвостовая вена не расширится. Случайным образом разделите мышей на четыре группы. Внутривенно ввести 3 раза по 10 в степени 6 КОЕ планктонный MRSA-252 в хвостовую вену мыши.
Через 24 часа принесите в жертву мышь, находящуюся под наркозом, и тщательно продезинфицируйте ее 75% этиловым спиртом. Одной рукой с помощью пинцета подтяните кожу живота, а другой рукой разрежьте кожу с помощью офтальмологических ножниц. Найдите почки в брюшной полости и осторожно полностью обнажите их.
Переложите почки в трубку для измельчения, содержащую один миллилитр PBS, и измельчите их до тех пор, пока не останется твердой ткани. Вылейте гомогенизированную ткань в пробирку Эппендорфа. Выполняют серийные разведения гомогената тканей с помощью PBS.
Найдите каждое разведение на отдельных пластинах соевого шнека и инкубируйте их в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. Подсчитайте колонии бактерий на следующий день и проанализируйте данные. Модели внутриклеточных инфекций S.aureus были успешно созданы в оптимизированных условиях фагоцитоза и расширенного лечения антибиотиками, при этом некоторые бактерии выживали в макрофагах.
Макрофаги, инфицированные метициллин-резистентным S.aureus, сохраняли внутриклеточные бактерии после двухчасового лечения антибиотиками, когда надосадочная жидкость больше не содержала бактерий. Анализы бактериальной колонизации in vivo у мышей показали, что ванкомицин уничтожает внеклеточный S.aureus, но не выводит внутриклеточные бактерии.
