The author thanks R. Boss, A. Cosandey, C. Fournier, I. Ivanovic, and J. Naskova for their excellent work.

1. aislados de Staphylococcus aureus <ol><li> Spread 10 l de S. aureus cultivo madre o una colonia crecida en un medio selectivo en placas de agar Columbia que contenían 5% de sangre de oveja (BA). </li><li> Incubar aeróbicamente a 37 ° C durante 18 horas a 24 horas. </li></ol> 2. Extracción de ADN <ol><li> Preparar tampón TEL que contiene Tris-HCl 10 y 10 mM Na 2 EDTA, pH 8,5. Preparar alícuotas y autoclave a 121 ° C durante 15 min. </li><li> Recoge 1 colonia de BA utilizando un asa estéril de plástico o un palillo de madera estéril y resuspender en 100 l TEL. Utilice tubos de 1,5 ml con tapones de rosca. </li><li> Incubar a 95 ° C durante 10 min. Después, colocar las muestras inmediatamente en hielo húmedo. </li><li> Diluir las muestras 1: 100 en H 2 O adecuado para PCR (= molde de ADN para la PCR). Las muestras no diluidas y diluidas pueden conservarse a -20 ° C durante 1 mes. </li></ol> 3. RS-PCR <ol><li&gt; Para cada pipeta de la muestra en un tubo de PCR 1.5 l H 2 O, 12.5 l Taq Master Mix, 2 l de cebador G1 10 M, 2 l L1 cebador 10 mM, y 7 l de plantilla de ADN que corresponde a aproximadamente 30 ng de pura 2 ADN. </li><li> Ejecute el siguiente programa de ciclos en un ciclador de PCR estándar: 15 min 95 ° C, seguido de 27 ciclos que comprenden 94 ° C durante 1 min, seguido de una rampa de 2 min y recocido a 55 ° C durante 7 min. Después de otros 2 min rampa, se extienden a 72 ° C durante 2 min. Terminar PCR por una extensión final a 72 ° C durante 10 min seguido de enfriamiento a 4 ° C. NOTA: Los productos de PCR se pueden almacenar a -20 ° C durante 5 días. </li><li> Para cada serie de RS-PCR incluye un control positivo, es decir, una muestra con un genotipo conocido (normalmente GTB), y un control negativo (H 2 O). </li></ol> 4. Electroforesis <ol><li> Utilice un kit de electroforesis miniaturizado comercial de ADN (kit MED) juntocon un Bioanalyzer conectado a un PC y el software instalado. Estudiar los manuales correspondientes del fabricante cuidadosamente. </li><li> Configurar la estación de cebado de chips y ajustar el clip de jeringa de acuerdo con el manual del fabricante. </li><li> Preparar la mezcla de gel colorante según el manual del fabricante. </li><li> Carga de la mezcla de gel colorante (de acuerdo con el manual del fabricante). <ol><li> Equilibrar la mezcla de gel de colorante a RT durante 30 min antes de su uso. </li><li> Ponga nuevo chip de ADN en el chip de la estación de cebado. Pipeta de 9 l de gel colorante en el G. bien marcado </li><li> Asegúrese de que el émbolo se posiciona a 1 ml y luego cerrar la estación de cebado de chips. Presione el émbolo hasta que se lleva a cabo por el clip de jeringa. Espere exactamente durante 30 segundos y luego suelte el clip de jeringa. </li><li> Espere a 5 seg. Tire lentamente el émbolo de 1 ml posición. </li><li> viruta abierta estación de cebado y pipeta de 9 l de gel colorante en ambos pozos marcados &quot;G&quot;. </li></ol></li><li> Carga del MArker <ol><li> Pipeta 5 l de marcador en los 12 pocillos de muestra y en la escalera bien. No deje ninguna de las 13 pozos vacíos. </li></ol></li><li> Cargando la escalera y las muestras. <ol><li> Pipeta de 1 l de escalera de ADN a la bien marcada con el signo escalera. </li><li> Pipeta de 1 l de muestra (pozos utilizados) o 1 l de agua desionizada (pocillos no utilizados). </li><li> Ponga el chip horizontalmente en el adaptador y de vórtice durante 1 min a 2400 rpm. </li><li> Ejecutar el chip en el Bioanalyzer dentro de 5 minutos. </li></ol></li><li> Ejecución del análisis <ol><li> Iniciar el Bioanalyzer y el ordenador conectado. Abra el software. </li><li> Abra la tapa de la Bioanalyzer y colocar el chip en el soporte de chip (chip encaja de una sola manera). Cierre la tapa con cuidado. </li><li> En el contexto del instrumento del software seleccione &quot;Electroforesis&quot;&gt; &quot;ADN de doble cadena&quot;&gt; &quot;ADN 7500&quot;. Aceptar el prefijo del archivo actual del software o modificarlo.</li><li> Haga clic en el botón de inicio presente en el software. Introduzca los nombres de las muestras en el software. Una vez finalizada la ejecución de chip (después de aproximadamente 30 min) el Fin del mensaje de ejecución aparece en el software Bioanalyzer. </li><li> Retirar el chip y la limpieza de los electrodos de la Bioanalyzer de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li></ol></li></ol> 5. Inferir el genotipo de la Reseña Electroforesis <ol><li> Cargar el software Mahal (software está disponible gratuitamente a partir de los autores). </li><li> datos de referencia de importación en el software Mahal: &quot;Archivo&quot;&gt; ​​&quot;Importar datos de referencia&quot; </li><li> Abra la electroforesis ejecutarse en el contexto de datos del software Bioanalyzer. Seleccionar un perfil de electroforesis de una muestra. </li><li> Compruebe si los picos relevantes. <ol><li> Utilice el software Mahal para comprobar si los picos relevantes: &quot;Herramientas&quot;&gt; &quot;media de fluorescencia&quot;. Insertar en el cuadro de la &quot;fluorescencia&quot;los valores de fluorescencia indican como unidades de fluorescencia (FU), ya que se pueden leer desde el software Bioanalyzer. Inserte los 4 (3) con picos de fluorescencia más elevada en orden ascendente y separados por comas. Ejemplo: 126 130 132 137. NOTA: Si no todos estos picos FU se indican mediante el software Bioanalyzer, tienen que ser estimado por la lectura de estas naciones de la trama. </li></ol></li><li> Presione el botón &quot;Calcular&quot;. Un pico es relevante si la fluorescencia observado es superior al valor indicado en el cuadro de &quot;pico de altura mínima&quot;. </li><li> Inferir el genotipo. <ol><li> Insertar en los Mahal cuadro de texto &quot;Picos de entrada (pb)&quot; a los tamaños en pares de bases de todos los picos pertinentes en orden ascendente y separados por comas. Ejemplo: 440.462.519.579.637. NOTA: Si no todos estos tamaños máximos se indican mediante el software Bioanalyzer, tienen que ser estimado por la lectura de estas naciones de la trama. </li></ol></li><li> Presione el botón &quot;Calcular&quot;. </li><li> En la listacaja, buscar la mínima distancia de Mahalanobis al cuadrado &quot;d2m&quot;. Si el valor de P correspondiente derecho a es ≥0.05 entonces la probabilidad es ≥5% de que la hipótesis nula H 0 se rechaza (H 0: el observado y el perfil de referencia son idénticos), que significa que el perfil observado se acepta ser idéntica a el perfil de referencia del genotipo indicada. </li><li> Si d2m es mínimo, pero el campo del valor P correspondiente está vacía, rechazar H 0 con una probabilidad &lt;5%. NOTA: Esto significa que los perfiles son desiguales aunque d2m es mínima. Tal resultado puede ser el resultado de condiciones que no sean promedio de electroforesis. <ol><li> Para corregir estas desviaciones, insertar en el cuadro de texto &quot;Observado Pico (pb)&quot; el ​​valor 395 y pulse el botón &quot;Calcular&quot;. Revisar una vez más d2m mínimo y un valor de p correspondiente ≥0.05. Si no tiene éxito, trate de los valores 405, 415, y 425. NOTA: A veces pasos más pequeños son aúnindicado. Si todavía no tiene éxito, el perfil observado no está presente en los datos de referencia, puede ser un nuevo genotipo o variante. </li></ol></li><li> Varios perfiles <ol><li> Repita los pasos 5.6 a 5.9 para cada perfil de electroforesis por separado. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Sears, P. M., McCarthy, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+and+treatment+of+staphylococcal+mastitis.">Management and treatment of staphylococcal mastitis.</a> Vet.Clin.North Am.Food Anim.Pract. 19 (1), 171-185 (2003).</li><li>Fournier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+Staphylococcus+aureus:+association+of+virulence+genes,+genotypes+and+clinical+outcome.">Bovine Staphylococcus aureus: association of virulence genes, genotypes and clinical outcome.</a> Res.Vet.Sci. 85 (3), 439-448 (2008).</li><li>Cosandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+genotype+B+and+other+genotypes+isolated+from+cow+milk+in+European+countries.">Staphylococcus aureus genotype B and other genotypes isolated from cow milk in European countries.</a> J.Dairy Sci. 99 (1), 529-540 (2016).</li><li>Boss, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+Staphylococcus+aureus:+Subtyping,+evolution,+and+zoonotic+transfer.">Bovine Staphylococcus aureus: Subtyping, evolution, and zoonotic transfer.</a> J.Dairy Sci. 99 (1), 515-528 (2016).</li><li>Graber, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mastitis-related+subtypes+of+bovine+Staphylococcus+aureus+are+characterized+by+different+clinical+properties.">Mastitis-related subtypes of bovine Staphylococcus aureus are characterized by different clinical properties.</a> J.Dairy Sci. 92 (4), 1442-1451 (2009).</li><li>Heiniger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kosten-Nutzen-Analyse+einer+Intervention+zur+Verbesserung+der+Eutergesundheit+in+Schweizer+Milchviehbetrieben.">Kosten-Nutzen-Analyse einer Intervention zur Verbesserung der Eutergesundheit in Schweizer Milchviehbetrieben.</a> Schweiz.Arch.Tierheilkd. 156 (10), 473-481 (2014).</li><li>Hamann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+the+physiological+cell+count+threshold+based+on+changes+in+milk+composition.">Definition of the physiological cell count threshold based on changes in milk composition.</a> IDF Mastitis Newsletter. 25, 9-12 (2003).</li><li>Hwang, S. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilocus+sequence+typing+of+Staphylococcus+aureus+isolates+recovered+from+cows+with+mastitis+in+Brazilian+dairy+herds.">Multilocus sequence typing of Staphylococcus aureus isolates recovered from cows with mastitis in Brazilian dairy herds.</a> J.Med.Microbiol. 56, 1505-1511 (2007).</li><li>Tavakol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine-associated+MRSA+ST398+in+the+Netherlands.">Bovine-associated MRSA ST398 in the Netherlands.</a> Acta Vet.Scand. 54, 28 (2012).</li><li>Harmsen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Typing+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+in+a+university+hospital+setting+by+using+novel+software+for+spa+repeat+determination+and+database+management.">Typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a university hospital setting by using novel software for spa repeat determination and database management.</a> J.Clin.Microbiol. 41 (12), 5442-5448 (2003).</li><li>Zadoks, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+pulsed-field+gel+electrophoresis+and+binary+typing+as+tools+in+veterinary+clinical+microbiology+and+molecular+epidemiologic+analysis+of+bovine+and+human+Staphylococcus+aureus+isolates.">Application of pulsed-field gel electrophoresis and binary typing as tools in veterinary clinical microbiology and molecular epidemiologic analysis of bovine and human Staphylococcus aureus isolates.</a> J.Clin.Microbiol. 38 (5), 1931-1939 (2000).</li><li>Cremonesi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+characteristics+of+Staphylococcus+aureus+strains+associated+with+high+within-herd+prevalence+of+intramammary+infections+in+dairy+cows.">Genomic characteristics of Staphylococcus aureus strains associated with high within-herd prevalence of intramammary infections in dairy cows.</a> J.Dairy Sci. 98 (10), 6828-6838 (2015).</li><li>Enright, M. C., Day, N. P., Davies, C. E., Peacock, S. J., Spratt, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilocus+sequence+typing+for+characterization+of+methicillin-resistant+and+methicillin-susceptible+clones+of+Staphylococcus+aureus.">Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus.</a> J.Clin.Microbiol. 38 (3), 1008-1015 (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

El paso más crítico de todo el procedimiento es cuando hay un exceso de ADN en RS-PCR (&gt; 30 ng de ADN / ensayo puro) 2. En general, la resolución de un perfil es óptimo si todos sus picos de inicio y fin en la línea de base. Si dos picos están demasiado juntos, la resolución es incompleta. En estas condiciones, el software Bioanalyzer puede conducir a la identificación de los picos apropiado de manera que se requiere la identificación manual. Todos los picos visiblemente separadas y relevantes expresados ​​como pb o FU se incluyen para otros análisis. El exceso de ADN molde para RS-PCR resulta en picos anchos y por lo tanto a pico resolución superposición y alteración de los picos. Además, la migración es más lenta líder a pico tamaños que se incrementan falsamente que el genotipo ya no se puede inferir. Por último, el número de picos irrelevantes es más grande. Para los perfiles con más de 3 picos, el pico de fluorescencia con la máxima no debería exceder las 150 FU. Genotipado por RS-PCR como se ha descrito está limitado por el hecho de que la inversión en máquinas es necesario y se requiere el software gratuito Mahal. De hecho, se necesitan una máquina estándar de PCR y el Bioanalyzer. El primero es bastante barato hoy en día, mientras que el último es más caro. La resolución de electroforesis basado en agarosa no es suficiente incluso si se utiliza alta resolución de agarosa. En estas condiciones es sólo posible distinguir entre GTB, GTC, y todos los otros genotipos. Los costes para la electroforesis utilizando el kit de MED o electroforesis de agarosa, sin embargo, son similares. El kit MED junto con el Bioanalyzer más supera a electroforesis en agarosa estándar de una manera que el último método es práctico, sencillo, y los datos obtenidos está presente en forma electrónica que simplifica el almacenamiento y el posterior análisis considerablemente. Principalmente todos bioanalyzers disponibles comercialmente son adecuados para este tipo de análisis, siempre que el electrophoretResolución de CI es adecuado y el tamaño de las bandas obtenida es precisa e imparcial. La resolución de RS-PCR para las cepas de la especie bovina de S. aureus es alta. Es tan buena como la tipificación spa, y mejor que MLST y PFGE 4,14. Además, en comparación con todos los otros métodos de caracterización usados comúnmente para la subtipificación S. aureus (tipificación spa, MLST, PFGE), su rendimiento de la muestra es alto: la extracción de ADN es fácil y rápido, 96 muestras se pueden procesar en una carrera RCR (normalmente S / N) y la electroforesis e inferir el genotipo es sencillo. El análisis completo de 96 muestras requiere una noche para PCR y un día para la electroforesis y la evaluación. Otras ventajas de RS-PCR por Fournier et al. 2 son los bajos costos, especialmente en comparación con MLST que requiere siete genes para ser secuenciados en ambas direcciones 15. Además, RS-PCR es la única predecir contagiosity método y la patogenicidad de cepas deS. aureus implicados en la mastitis bovina, 2,5 predictores clave en la medicina veterinaria clínica. Finalmente, RS-PCR por sí sola es suficiente para investigar la epidemiología de S. bovino aureus 3,4,5,14. Interpretación de los datos es sencillo, incluso en un contexto internacional tan sólo unos pocos genotipos principales se observan 2,3. Para las comparaciones epidemiológicas entre bovina y las cepas humanas, RS-PCR y la tipificación spa juntos son preferibles como el último método es ampliamente utilizado en la tipificación de las cepas humanas de modo que una gran cantidad de datos está disponible. MLST, sin embargo, es adecuado para la evaluación de la clonalidad de las cepas 15 y para los análisis filogenéticos 4. Para la solución de problemas en relación con el termociclador de PCR, kit de MED y el Bioanalyzer, los manuales correspondientes deben ser consultados. En el caso del método de RS-PCR, la solución de problemas se simplifica enormemente si los controles de PCR positivos y negativos apropiados son included en cada serie. Si el control positivo es negativo, la mezcla de PCR no estaba compuesto adecuadamente y / o el ADN de control fue degradado. Si el control negativo (H 2 O) generado una o más bandas, la mezcla de PCR estaba contaminado con algo de ADN. En ambos casos, los perfiles no deben ser interpretadas y RS-PCR tiene que repetirse. Si la interpretación no es posible debido a un problema de electroforesis, electroforesis necesita ser repetido usando un nuevo chip. problemas electroforéticos se caracterizan normalmente por la migración inadecuada y la alineación de una o ambas bandas marcadoras resultante de la carga y la manipulación del chip apropiado. Si el perfil de electroforesis obtenido no puede ser interpretado por el software Mahal, el archivo de perfil generado por el software Bioanalyzer se envía al autor para su posterior evaluación. Normalmente, se usa demasiado de ADN plantilla para RS-PCR o el perfil representa un nuevo genotipo o variante genotípica.

Staphylococcus (S. aureus) se conoce como el patógeno más importante en todo el mundo responsable de la infección intramamaria (IMI) en el ganado 1. El estudio realizado por Fournier et al., 2 demostrado en las vacas suizas y los estudios realizados por Cosandey et al. 3 y de Boss et al. 4 en vacas de 12 países europeos que S. aureus aislado de bovino IMI es un grupo genéticamente heterogéneo. Mediante amplificación por PCR de la región espaciadora intergénica 16S-23S rRNA (RS-PCR), un total de 17 genotipos se detectaron inicialmente en 101 aislamientos epidemiológicamente independientes 2. El genotipo B y C de genotipo (GTC) fueron más comunes (80%), mientras que los otros 15 genotipos (SMT) se produjeron en raras ocasiones, cada uno haciendo del 1 al 4% de todos los aislamientos. A nivel europeo 3, GTB, GTC, GTF, GTI, y GTR fueron los genotipos más importantes que comprenden el 76% de todas las cepas analizadas (n = 456). GTB se encuentra en el centro de Europa wientras los otros genotipos se difundieron ampliamente. El 24% restante de las cepas incluyó 41 genotipos, muchos de ellos, sin embargo, se observaron sólo una vez. Los estudios realizados por Fournier et al., 2, Cosandey y col. 3, y Graber et al. 5 demostraron además que los genotipos fueron altamente asociados con su patrón de genes de virulencia, así como en el suizo como a nivel europeo. Los estudios revelaron diferencias más grandes en la prevalencia entre IMI S. aureus GTB, GTC y los otros genotipos 2,5: Teniendo en cuenta GTB, hasta el 87% de las vacas de un rebaño se infectaron por este genotipo. En el caso de GTC y de los otros genotipos, sin embargo, IMI fue sólo se encuentra en 1 a 2 vacas de un rebaño. IMI causada por S. aureus, normalmente resulta en la inflamación de las glándulas mamarias correspondientes y un aumento de células inflamatorias en la leche. Como consecuencia de ello, la co células somáticasunts en la leche (SCC), el indicador clave de la calidad de la leche en la mayoría de los países, se incrementa dando lugar a una disminución del precio de la leche o incluso detener la entrega. Además de la RS-PCR de Fournier et al. 2, se han descrito otros métodos de tipificación para subtipificación cepas bovinas de S. aureus 8-11. Dos de los más comunes incluyen la tipificación spa de 12 y Multi Locus Secuencia Typing (MLST) 13. El primero de ellos está basado en el ADN secuenciación de la región espaciadora variable del gen que codifica para la proteína de spa estafilocócica A, mientras que el segundo se requiere la secuenciación de los genes de limpieza 7. Esto significa que un 12 y siete PCRs 13, respectivamente, necesitan ser realizados, seguido de purificación amplicón, reacción de secuenciación y el análisis utilizando equipo específico. En comparación con RS-PCR, estos métodos requieren un esfuerzo adicional considerable en el laboratorio que resulta en un flujo de muestras de bajo y altos costos. losel rendimiento es especialmente baja en el PFGE. Teniendo en cuenta la resolución de estos métodos para las cepas de la especie bovina de S. aureus, RS-PCR es por lo menos tan bueno como spa escribir 4 y mejor que MLST 4 o PFGE 15. Todos estos métodos que incluyen la tipificación binaria 13 demostraron su eficacia en la obtención de una mayor comprensión de la patogénesis de la IMI bovina causada por S. aureus, pero debido a las restricciones mencionadas son menos apropiados para grandes investigaciones clínicas. Además, la genotipificación por RS-PCR como se describe por Fournier et al. 2 permite la predicción fiable de la epidemiológica y el potencial patógeno de S. aureus involucrado en el IMI bovina, dos valores clave en la medicina veterinaria clínica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="616">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td>
			<td style="width:100px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1.08382.0500</td>
			<td style="width:181px;">Mw =121.14g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Titriplex III</td>
			<td style="width:100px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1.08418.0250</td>
			<td>Mw = 372.24g/mol; Substance is equivalent to Na2EDTA&#183;2H2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydrochloric acid 5mol/l</td>
			<td style="width:100px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1.09911.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Columbia agar+5% sheep blood</td>
			<td style="width:100px;">bioM&#233;rieux</td>
			<td style="width:119px;">43049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agilent DNA7500 Kit</td>
			<td style="width:100px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">5067-1504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:100px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">G2940CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agilent 2100 expert sofware</td>
			<td style="width:100px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HotStarTaq master mix&#160;</td>
			<td style="width:100px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">203445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primer L1</td>
			<td style="width:100px;">Mycrosinth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>5&#39;CAA GGC ATC CAC CGT3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primer G1</td>
			<td style="width:100px;">Mycrosinth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>5&#39;GAA GTC GTA ACA AGG3&#39;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genotyping of staphylococcus aureus by ribosomal spacer pcr (rs-pcr)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Definición de un genotipo y sus variantes Un perfil electroforético que difieren en más de una banda de todos los genotipos identificados se considera como un nuevo genotipo. Nuevos genotipos se nombran y se extendieron acuerdo con Fournier et al. 5 que conduce a los genotipos de GTA a la GTZ, seguido de los genotipos GTAA a GTAZ, y GTBA a GTBZ, y al GTCA GTCC en la actualidad. Variación en sólo una banda es considerada como una variante genotípica. Se indica con números romanos superíndice después del nombre del genotipo (por ejemplo, GTRI, GTRII). En total, actualmente hay 141 genotipos y variantes en la base de datos de referencia. En las condiciones descritas anteriormente, RS-PCR por Fournier et al. 5 es altamente reproducible para determinar el genotipo de las cepas de S. aureus. La identificación definitiva de ungenotipo o variante conocida es siempre posible si los problemas técnicos pueden ser excluidas. Un resultado típico se presenta en la Figura 1 demuestra la electroforesis de 12 productos RS-PCR y presentado en el modo pseudo gel por el software Bioanalyzer. Cada carril se caracteriza por un patrón de dos o más bandas de PCR y una banda de marcador en el frente y una banda de marcador al final. Al hacer doble clic en un carril abre el perfil electroforético correspondiente, medido realmente en una ventana separada. El software Bioanalyzer permite, entre otras posibilidades, los picos observados se leen como el tamaño como unidades fluorescentes FU (Figura 2) o en pares de bases (Figura 3) mediante el cual un pico corresponde exactamente a una banda en el modo pseudo-gel. Se requiere la lectura de pico en FU para la evaluación de los picos relevantes de un perfil en el software Mahal (Figura 4), la lectura de la presión arterial para inferir el genotipo. picos irrelevantes se definen en el software Mahal como pequeño guisanteks cuya observado fluorescencia FU está por debajo de 40% de la media geométrica de los 4 (3) picos con fluorescencia más elevada. Se observan normalmente cuando hay un exceso de ADN en RS-PCR (&gt; 30 ng de ADN / ensayo puro) 2. Como un ejemplo, el genotipo de la muestra 211 presente en la figura 1 se infiere. El análisis visual del perfil electroforético de la Figura 2 (software Bioanalyzer) y el análisis con el software Mahal con la función para la prueba de los picos irrelevantes reveló 6 picos relevantes con tamaños de pico de 395 pb, 432 pb, 453 pb, 505 pb, 567 pb, y 622 pb (Figura 3). Estos valores se hayan completado y separados por comas en el cuadro de texto &quot;Picos de entrada (BP)&quot; del software Mahal (Figura 4). Para corregir las desviaciones de ejecución específica, el valor 415 se inserta en el cuadro de texto &quot;Observado Pico (pb)&quot; (Figura 4). Después de haber pulsado el &quot;Cbotón alculate &quot;, se presenta una lista ordenada por el genotipo junto con el d2m distancia de Mahalanobis al cuadrado entre el perfil genotípico consultada e indicado. desplazarse por la lista en busca de d2m mínimo. En el presente caso, un mínimo de d2m es igual a 4.499 (Figura 4) con un valor de P ≥0.05, lo que significa que el perfil consultado no difiere significativamente de la de GTB. Las variantes de genotipos se indican como _I a _XV en el software Mahal. En el caso del genotipo B, existen las tres variantes GBT I, II GBT, y GBT III que se indican como b_i, B_II, y B_III en el software (Figura 4). Un chip de la kit MED permite que los productos de análisis de 12 RS-PCR a la vez. Si menos productos están disponibles, los pozos restantes necesitan ser cargados con agua desionizada. Los resultados sólo pueden ser interpretados si los controles inclu en RS-PCR son apropiados. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54623/54623fig1.jpg" /> Figura 1. Pseudo-gel que representa 12 productos RS-PCR y sus genotipos inferidos. Doce cepas diferentes de S. aureus fueron analizados por RS-PCR usando el kit de MED junto con un Bioanalyzer y el software incluido. El carril en el lado izquierdo muestra el marcador o &quot;escalera&quot; para la calibración tamaño del sistema en pb. En la parte superior de los gráficos, los nombres de las muestras y los genotipos correspondientes son acusados que fueron obtenidos por el software Mahal. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54623/54623fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54623/54623fig2.jpg" /> Figura 2. Perfil electroforético de sample 161 presente en la Figura 1. En la parte superior de los picos de la fluorescencia medido se indica en FU. Picos visualmente distinguibles que no fueron detectados por la necesidad de software Bioanalyzer que deben estimarse mediante la lectura de estas naciones de la trama como la realizada para el pico con un valor de fluorescencia estimado de 113 FU (en azul). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54623/54623fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54623/54623fig3.jpg" /> Figura 3. Perfil electroforético de muestra de 211 presentes en la Figura 1. En la parte superior de los picos de su tamaño se indica en el punto de ebullición. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54623/54623fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src = &quot;/ files / ftp_upload / 54623 / 54623fig4.jpg&quot; /&gt; Figura 4. Captura de pantalla del software Mahal. En el cuadro de texto &quot;Picos de entrada (pb)&quot; los tamaños máximos de la muestra 211 de la Figura 3 se rellenan. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54623/54623fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

genotipado de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; por Ribosómica espaciador de PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

genotyping-of-staphylococcus-aureus-by-ribosomal-spacer-pcr-rs-pcr

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

9.5K vistas.  Agroscope. Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

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The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1 Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached to a surface.2 Biofilm formation and development are commonly studied in the laboratory using batch systems such as microtiter plates or flow systems, such as flow-cells. These methodologies are useful for screening mutant and chemical libraries (microtiter plates)3 or growing biofilms for visualization (flow cells)4. Here we present detailed protocols for growing Staphylococcus aureus in two additional types of flow system biofilms: the drip flow biofilm reactor and the rotating disk biofilm reactor.
Drip flow biofilm reactors are designed for the study of biofilms grown under low shear conditions.5 The drip flow reactor consists of four parallel test channels, each capable of holding one standard glass microscope slide sized coupon, or a length of catheter or stint. The drip flow reactor is ideal for microsensor monitoring, general biofilm studies, biofilm cryosectioning samples, high biomass production, medical material evaluations, and indwelling medical device testing.6,7,8,9
The rotating disk reactor consists of a teflon disk containing recesses for removable coupons.10 The removable coupons can by made from any machinable material. The bottom of the rotating disk contains a bar magnet to allow disk rotation to create liquid surface shear across surface-flush coupons. The entire disk containing 18 coupons is placed in a 1000 mL glass side-arm reactor vessel. A liquid growth media is circulated through the vessel while the disk is rotated by a magnetic stirrer. The coupons are removed from the reactor vessel and then scraped to collect the biofilm sample for further study or microscopy imaging. Rotating disc reactors are designed for laboratory evaluations of biocide efficacy, biofilm removal, and performance of anti-fouling materials.9,11,12,13

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Protocols for utilizing open system flow biofilms with drip flow reactors and rotating disk reactors are presented in detail.

El uso de un flujo de goteo y la rotación del disco para reactores Staphylococcus aureus Análisis de Biofilm

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

Investigación

Inmunología e Infección

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the United States. Among soft-tissue infections, myositis, pyomyositis, and necrotizing fasciitis have been increasingly reported in association with MRSA arising from the community. To understand the interplay between MRSA and host immunity leading to more severe infection, the availability of animal models is critical, permitting the study of host and bacterial factors. Several infection models have been introduced to assess the pathogenesis of S. aureus during superficial skin infection. Here, we describe a subcutaneous infection model that examines the skin, subcutaneous, and muscle pathologies.

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

Murine skin and soft tissue infection model is utilized for assessing the virulence function of methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and the host immunological responses. Here, we presented a subcutaneous infection model for skin and soft tissue infection.

Subcutánea infección de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Rat

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause of such syndromes with unacceptably high morbidity and mortality even with appropriate antimicrobial agent treatments4-6. The increase in infections due to methicillin-resistant S. aureus (MRSA), the high rates of vancomycin clinical treatment failures and growing problems of linezolid and daptomycin resistance have all further complicated the management of patients with such infections, and led to high healthcare costs7, 8. In addition, it should be emphasized that most recent studies with antibiotic treatment outcomes have been based in clinical settings, and thus might well be influenced by host factors varying from patient-to-patient. Therefore, a relevant animal model of endovascular infection in which host factors are similar from animal-to-animal is more crucial to investigate microbial pathogenesis, as well as the efficacy of novel antimicrobial agents. Endocarditis in rat is a well-established experimental animal model that closely approximates human native valve endocarditis. This model has been used to examine the role of particular staphylococcal virulence factors and the efficacy of antibiotic treatment regimens for staphylococcal endocarditis. In this report, we describe the experimental endocarditis model due to MRSA that could be used to investigate bacterial pathogenesis and response to antibiotic treatment.

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus MRSA in Rat

Experimental rat endocarditis model due to methicillin-resistant S. aureus.

Modelo experimental de endocarditis Resistente a la Meticilina<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; (SARM) en la rata

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant reservoir of iron inside the human host is heme, which is the cofactor of hemoglobin. To acquire iron from hemoglobin, S. aureus utilizes an elaborate system known as the iron-regulated surface determinant (Isd) system1. Components of the Isd system first bind host hemoglobin, then extract and import heme, and finally liberate iron from heme in the bacterial cytoplasm2,3. This pathway has been dissected through numerous in vitro studies4-9. Further, the contribution of the Isd system to infection has been repeatedly demonstrated in mouse models8,10-14. Establishing the contribution of the Isd system to hemoglobin-derived iron acquisition and growth has proven to be more challenging. Growth assays using hemoglobin as a sole iron source are complicated by the instability of commercially available hemoglobin, contaminating free iron in the growth medium, and toxicity associated with iron chelators. Here we present a method that overcomes these limitations. High quality hemoglobin is prepared from fresh blood and is stored in liquid nitrogen. Purified hemoglobin is supplemented into iron-deplete medium mimicking the iron-poor environment encountered by pathogens inside the vertebrate host. By starving S. aureus of free iron and supplementing with a minimally manipulated form of hemoglobin we induce growth in a manner that is entirely dependent on the ability to bind hemoglobin, extract heme, pass heme through the bacterial cell envelope and degrade heme in the cytoplasm. This assay will be useful for researchers seeking to elucidate the mechanisms of hemoglobin-/heme-derived iron acquisition in S. aureus and possibly other bacterial pathogens.

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Here we describe a growth assay for Staphylococcus aureus using hemoglobin as the sole source of available nutrient iron. This assay establishes the role of bacterial factors involved in hemoglobin-derived iron acquisition.

Staphylococcus aureus Crecimiento con hemoglobina humana como una fuente de hierro

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and clonal strain relatedness of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), particularly with the emerging outbreaks of community-associated MRSA (CA-MRSA) occurring on a worldwide basis. Traditional PCR typing schemes classify SCCmec by targeting and identifying the individual mec and ccr gene complex types, but require the use of many primer sets and multiple individual PCR experiments. We designed and published a simple multiplex PCR assay for quick-screening of major SCCmec types and subtypes I to V, and later updated it as new sequence information became available. This simple assay targets individual SCCmec types in a single reaction, is easy to interpret and has been extensively used worldwide. However, due to the sophisticated nature of the assay and the large number of primers present in the reaction, there is the potential for difficulties while adapting this assay to individual laboratories. To facilitate the process of establishing a MRSA SCCmec assay, here we demonstrate how to set up our multiplex PCR assay, and discuss some of the vital steps and procedural nuances that make it successful.

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

We demonstrate a simple multiplex PCR assay for quick-screening and typing of Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) types I-V for methicillin-resistant Staphylococcus aureus, and provide some of the vital steps and procedural nuances that make it successful for adapting this assay to individual laboratories.

Multiplex PCR Ensayo para la tipificaci

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

El estudio de las interacciones de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Con neutrófilos mediante citometría de flujo y microscopía Tiempo Lapso

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.

Orientación de Biofilm Asociadas<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Uso de Ensayo de susceptibilidad a fármacos Basado resazurina

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

La detección de alto rendimiento de los patógenos respiratorios de especímenes animales por PCR nanoescala

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to antibiotics. Genomic studies reveal that S. aureus carries many virulence and resistance genes located in mobile genetic elements, suggesting that horizontal gene transfer (HGT) plays a critical role in S. aureus evolution. However, a full and detailed description of the methodology used to study HGT in S. aureus is still lacking, especially regarding natural transformation, which has been recently reported in this bacterium. This work describes three protocols that are useful for the in vitro investigation of HGT in S. aureus: conjugation, phage transduction, and natural transformation. To this aim, the cfr gene (chloramphenicol/florfenicol resistance), which confers the Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A (PhLOPSA)-resistance phenotype, was used. Understanding the mechanisms through which S. aureus transfers genetic materials to other strains is essential to comprehending the rapid acquisition of resistance and helps to clarify the modes of dissemination reported in surveillance programs or to further predict the spreading mode in the future.

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

We describe here three different protocols for the in vitro investigation of conjugation, transduction, and natural transformation in Staphylococcus aureus.

Metodología para el Estudio de la transferencia horizontal de genes en<em&gt; Staphylococcus aureus</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

Un modelo de ratón para evaluar respuesta inmune innata a la infección por Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...