Los autores desean agradecer a todos los miembros del laboratorio Balboula por su valiosa ayuda y discusiones. Los autores agradecen a Melina Schuh por compartir amablemente la construcción mCherry-Cep192. Este estudio fue apoyado por R35GM142537 (NIGMS, NIH) a AZB.

Todos los métodos descritos aquí fueron aprobados por la Universidad de Missouri (Animal Care Quality Assurance Ref. Number 9695). En el presente estudio se utilizaron ratones hembra reporteros Cep192-eGFP de 6 a 8 semanas de edad. Para generar ratones reporteros Cep192-eGFP , se utilizó la reparación dirigida por homología mediada por CRISPR / Cas9 para integrar el gen reportero EGFP en el genoma del ratón CF-1. El reportero del EGFP se fusionó en el extremo C del CEP192 (un componente integral de los MTOC)15. Para mantener la colonia de ratones, se utilizaron ratones reporteros homocigotos Cep192-eGfp . Todos los animales se mantuvieron en jaulas (hasta cuatro animales/jaula) a 21 °C y 55% de humedad, con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h y acceso ad libitum a alimentos y agua.
1. Recolección de ovocitos de ratón
<ol><li>Preparar el medio de cultivo (Chatot, Ziomek y Bavister, CZB19, ver la Tabla de materiales) e incubarlo a 37 °C y 5% deCO2 durante la noche. NOTA: El medio CZB puede almacenarse a 4 °C durante 1 mes (consulte el archivo complementario 1 para la composición del soporte).</li>
	<li>Complemente el medio CZB con glutamina (1 mM) y milrinona (2.5 mM) (CZB + M) (ver Tabla de materiales), y colóquelo en la incubadora. NOTA: La milrinona es un inhibidor de la fosfodiesterasa que mantiene los ovocitos detenidos en la profase I y previene la reanudación meiótica20.</li>
	<li>Prepare el medio de recolección (medio esencial mínimo libre de bicarbonato, MEM) que contiene 3 mg/ml de polivinilpirodona (PVP), 25 mM HEPES (pH 7.3) (Archivo complementario 1) y milrinona (2.5 mM) (MEM/PVP + M, consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Prepare las placas de recolección y cultivo, haga cuatro microgotas (100 μL) de medio de recolección (MEM / PVP + M) y dos microgotas (100 μL) de medio de cultivo (CZB + M) en placas de Petri de 60 mm y 35 mm, respectivamente, y cúbralas con aceite mineral (ver Tabla de materiales). Mantenga el plato de recolección en el calentador de portaobjetos y coloque el plato de cultivo en la incubadora a 37 °C y 5% deCO2.</li>
	<li>Inyecte por vía intraperitoneal 5 UI de gonadotropina sérica de yegua embarazada (PMSG, consulte la Tabla de materiales) en ratones hembra reporteros Cep192-eGFP sexualmente maduros (6-8 semanas de edad) 44-48 h antes de la recolección de ovocitos.</li>
	<li>Sacrificar los ratones por luxación cervical, identificar y extraer los ovarios21, y transferirlos a un cristal de reloj que contenga medio de recolección precalentado (MEM/PVP + M) a 37 °C.</li>
	<li>Fije el ovario tocando una jeringa de 1 ml en el fondo del vidrio del reloj y perforándolo varias veces (~ 40 veces por ovario) con agujas de coser agrupadas para liberar los ovocitos en el medio.</li>
	<li>Utilizando una pipeta de transferencia de plástico, transfiera todo el medio que contiene los complejos cúmulo-ovocitos (AOC) del paso 1.7 a una placa de Petri de plástico vacía de 100 mm.</li>
	<li>Bajo un microscopio estereoscópico, recoja los AOC con una pipeta de vidrio Pasteur y transfiéralos al plato de recolección que contenga MEM/PVP + M.</li>
	<li>Con una pipeta de vidrio Pasteur estrecha (aproximadamente 100 μm de diámetro), desnudar los ovocitos mecánicamente mediante un suave pipeteo repetitivo, seguido de transferirlos y lavarlos en cuatro microgotas de (100 μL) MEM/PVP + M (la placa de recolección) antes de su transferencia a la placa de cultivo CZB + M.</li>
	<li>Incubar los ovocitos desnudos durante 1 h a 37 °C con un 5% deCO2 en el aire.</li>
</ol>2. Microinyección de ovocitos
<ol><li>Coloque una gota de 250 μL de MEM/PVP + M en una tapa de placa de Petri de plástico de 100 mm y cúbrala con aceite mineral. NOTA: La tapa de la placa de Petri tiene un borde inferior que proporciona más espacio para ajustar el micromanipulador.</li>
	<li>Encienda el sistema de microinyección (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Coloque la placa de microinyección en la etapa de calentamiento (37 °C) del microscopio.</li>
	<li>Cargue la aguja de inyección con 0,5 μL de ARNc mCh-Cep192utilizando puntas de pipeta de microcargador (consulte la Tabla de materiales) y fije la aguja de inyección al micromanipulador.</li>
	<li>Transfiera los ovocitos desnudos (paso 1.11) a la microgota de 250 μL (paso 2.1).</li>
	<li>Bajo una lente de objetivo 20x o 40x, ajuste la posición y el enfoque de las agujas de inyección y sujeción de acuerdo con la posición del ovocito (Figura 1).</li>
	<li>Configure la unidad de microinyección y establezca la presión de inyección (p i), la presión de compensación (pc) y el tiempo de inyección (ti) para poder inyectar 5-10 pl de ARNc mCh-Cep192 (para etiquetar exógenamente los MTOC).</li>
	<li>Inyectar cuidadosamente los ovocitos sin tocar el núcleo.</li>
	<li>Una vez inyectados todos los ovocitos, lavarlos en tres microgotas de CZB+M, transferirlos a la placa de cultivo (CZB+M), e incubarlos durante 3 h a 37 °C para permitir la expresión de mCh-Cep192.</li>
</ol>3. Maduración de los ovocitos
<ol><li>Preparar el medio de maduración añadiendo glutamina (1 mM) al medio CZB preequilibrado en una incubadora con un 5% deCO2 en el aire a 37 °C durante al menos 3 h.</li>
	<li>Hacer dos microgotas (100 μL) del medio de maduración en una placa de Petri de 35 mm, y cubrirlas con aceite mineral (placa de maduración).</li>
	<li>Lave los ovocitos detenidos con profase I al menos tres veces en microgotas CZB sin milrinona de 100 μL para eliminar completamente la milrinona y permitir la reanudación meiótica.</li>
	<li>Transfiera los ovocitos a la placa de maduración e incube durante 5 h (etapa prometafase I) en una incubadora humidificada con 5% deCO2 en el aire a 37 °C.</li>
</ol>4. Preparación de ovocitos para ablación e imagen
<ol><li>Transferir los ovocitos de prometafase I (paso 3.4) a una placa de cultivo con fondo de vidrio que contenga 100 μL de medio de maduración (paso 3.1) cubierta con aceite mineral.</li>
</ol>5. Preparación del microscopio para la ablación
<ol><li>Al menos 30 minutos antes de la ablación, encienda el regulador de temperatura de la incubadora de escenarios (consulte la Tabla de materiales) y configúrelo a 37 °C.</li>
	<li>Encienda el controlador de CO2 y configúrelo en 5% deCO2.</li>
	<li>Seleccione un objetivo apocromático de inmersión en aceite 40x y aplique una pequeña gota del aceite de inmersión.</li>
	<li>Monte el plato de cultivo con fondo de vidrio con los ovocitos en una incubadora de etapa y cubra la incubadora con una tapa de gas.</li>
	<li>En el software de adquisición de imágenes (consulte la Tabla de materiales), seleccione una opción que permita guardar varias posiciones de etapa (por ejemplo, "Definir marcar y encontrar experimento"). Usando iluminación de campo claro de luz transmitida, céntrate en los ovocitos individuales y guarda sus posiciones.</li>
	<li>En el software de adquisición de imágenes, seleccione el modo de escaneo XYZ , establezca el formato de imagen en 256 x 256 píxeles, establezca el factor de zoom en 2.5x - 3.0x y seleccione una frecuencia de escaneo de 600 Hz. Esto corresponde a un tiempo de permanencia de píxeles de aproximadamente 1,6 μs.</li>
	<li>Establezca una línea láser de excitación de 488 nm a aproximadamente el 10% de la potencia del láser (que corresponde a 4.0 μW a nivel de muestra) (consulte la Tabla de materiales) y use un ancho de banda espectral de 500-550 nm para observar la señal GFP de los MTOC. Para la observación simultánea de la fluorescencia del Cep192 marcado con mCherry, configure una línea láser de excitación de 585 nm en aproximadamente el 8% de la potencia del láser (que corresponde a 10.7 μW a nivel de muestra) y use otro detector configurado con un ancho de banda espectral de 595-645 nm. NOTA: Es útil utilizar el detector de luz transmitida (TLD) del microscopio confocal para detectar simultáneamente los límites de los ovocitos.</li>
	<li>Usando un modo de escaneo en vivo y el control manual del z-drive, examine el ovocito en busca de MTOC.</li>
	<li>Una vez que se detecta un mcMTOC, dibuje una región cuadrada de interés (ROI) a su alrededor.</li>
</ol>6. Ablación de mcMTOCs
<ol><li>Ajuste un láser de femtosegundo a una longitud de onda de 740 nm. NOTA: La longitud de onda del láser se puede cambiar de acuerdo con el microscopio y las condiciones del láser.</li>
	<li>Utilice el modulador electroóptico del microscopio multifotón (consulte la Tabla de materiales) para ajustar la potencia del láser al 70% -80%, correspondiente a la potencia de 60-70 mW en el plano de muestra. NOTA: Si el láser está equipado con un compensador de pulso de femtosegundo, utilícelo para corregir la dispersión de retardo de grupo (GDD). La corrección GDD reduce la cantidad de potencia láser requerida para una ablación mcMTOC eficiente y minimiza el fotodaño al ovocito. El control GDD generalmente se integra con el software de adquisición de imágenes de microscopios multifotónicos comerciales.</li>
	<li>Utilice el mismo formato de imagen, factor de zoom y frecuencia de escaneo que en el paso 5.6. Establezca los parámetros de promedio de línea y fotograma en 1.</li>
	<li>Haga clic en el botón Escanear en el software para realizar la ablación del mcMTOC realizando un solo escaneo láser del ROI seleccionado.</li>
	<li>Utilice la configuración de canal del paso 5.7 para revisar los resultados de la ablación comparando las imágenes de las estructuras marcadas con GFP tomadas antes y después de la exposición al láser multifotón. Si la ablación es exitosa, la intensidad de la fluorescencia GFP en el mcMTOC objetivo disminuye a los niveles observados en el fondo.</li>
	<li>Si quedan algunos fragmentos de una estructura de etiquetado GFP, repita el paso 6.4 una o más veces centrándose en varios planos z del mcMTOC.</li>
	<li>Utilice la configuración de canal del paso 5.7 para verificar la eficiencia de ablación mediante la pérdida completa de señales mCherry asociadas a mcMTOC (mCh-Cep192).</li>
	<li>Repita los pasos 5.8 a 6.7 hasta que se ablacionen todos los MTOC de un ovocito (en varios planos focales). NOTA: Este protocolo utiliza la microinyección mCh-Cep192 como estrategia para confirmar el agotamiento de mcMTOC después de la exposición al láser multifotón y excluir la posibilidad de que la pérdida de fluorescencia GFP sea causada por el fotoblanqueo de GFP. Sin embargo, la microinyección de esta sonda es opcional y no es necesaria para el procedimiento de ablación.</li>
</ol>

<ol>
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Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.

Existen diferentes métodos para perturbar las estructuras relacionadas con el citoesqueleto dentro de las células22,23,24,25. Sin embargo, encontrar técnicas eficientes para perturbar selectivamente la estructura objetivo sin comprometer la viabilidad celular es un desafío. El método de ablación con láser multifotón presentado aquí es una estrategia eficiente para inducir una perturbación mecánica selectiva a los mcMTOCs dentro del ovocito sin alterar la viabilidad del ovocito.
La ablación con láser se ha utilizado ampliamente para comprender los mecanismos moleculares que controlan la segregación cromosómica durante la mitosis y la meiosis22,23,26,27. Debido al tamaño relativamente grande (>80 mm de diámetro) de los ovocitos de mamíferos en comparación con las células somáticas28, la ablación de sus estructuras intracelulares representa un desafío. Además, el volumen promedio de mcMTOC en ovocitos en metafase I es ~ 20 μm15, lo que representa un desafío adicional. Se debe adoptar un método eficiente que ofrezca una penetración más profunda del tejido para superar estos desafíos. La principal ventaja de utilizar el láser multifotón para la ablación es su capacidad para penetrar más profundamente en la célula y minimizar los efectos fuera del objetivo29.
Para verificar la eficacia y eficiencia del método de ablación láser para agotar la estructura objetivo, se recomienda utilizar una proteína marcada fluorescentemente para identificar la estructura objetivo a lo largo del tiempo (antes y después de la ablación)23. Es importante notar que la ablación con láser agota todo el mcMTOC como estructura, y aunque los mcMTOC más pequeños requieren solo una exposición al láser para agotarse, los mcMTOC más grandes pueden requerir más de una exposición al láser en diferentes planos focales. También se recomienda fijar e inmunomarcar un subconjunto de ovocitos control y ablacionados con mcMTOC con un marcador MTOC (como γ-tubulina, pericentrina o Cep192) para confirmar aún más la eficiencia de la ablación de mcMTOC. En los ovocitos de control, las áreas del citoplasma adyacentes pero que no se superponen con los mcMTOC estarán expuestas al láser.
Este experimento requiere varias ablaciones de mcMTOC mientras se mueve entre diferentes planos focales dentro de los ovocitos. Por lo tanto, es muy recomendable practicar esta técnica varias veces antes de ejecutar el experimento para minimizar el tiempo del experimento, aumentando así la viabilidad de los ovocitos. Además, es importante utilizar la potencia mínima del láser que sea suficiente para agotar los mcMTOC sin afectar la viabilidad de los ovocitos.
Esta técnica tiene algunas limitaciones. En primer lugar, los microscopios confocales multifotónicos son relativamente más caros que los microscopios confocales regulares. En segundo lugar, perturbar todos los mcMTOC en diferentes planos focales requiere más tiempo que las perturbaciones químicas o genéticas. En tercer lugar, este protocolo requiere habilidades técnicas para extirpar todos los mcMTOC en el menor tiempo posible. Sin embargo, una vez dominado, el uso del láser multifotón proporciona una excelente estrategia para perturbar varias estructuras intracelulares en ovocitos de ratón, incluidos los mcMTOC, contribuyendo a la comprensión de los mecanismos moleculares que regulan el posicionamiento del huso y su migración oportuna en ovocitos de mamíferos.

Los gametos haploides (espermatozoides y ovocitos) se producen a través de la meiosis, que implica una ronda de replicación del ADN seguida de dos divisiones consecutivas que son necesarias para la reducción del número de cromosomas antes de la fertilización. En los mamíferos, durante la vida fetal temprana, el ovocito sufre un paro prolongado (hasta la pubertad) en la etapa diploteno de la profase I de la primera división meiótica, una etapa llamada etapa de vesícula germinal (GV). Después de la reanudación meiótica, el ovocito GV sufre una ruptura de la envoltura nuclear (NEBD), y el huso se ensambla principalmente en el centro ovocitario 1,2,3. Más tarde, impulsado por la actina F, el huso migra de manera oportuna desde el centro del ovocito a la corteza para asegurar una división altamente asimétrica, lo que resulta en un huevo con un pequeño cuerpo polar (PB)4,5,6.
En las células mitóticas, los centrosomas consisten en un par de centriolos rodeados por componentes de material pericentriolar (PMC), como pericentrina, γ-tubulina, Cep152 y Cep1927. Estos centrosomas que contienen centriolo contribuyen a la fidelidad de la formación del huso bipolar8. Sin embargo, los centriolos se pierden durante la ovogénesis temprana en varias especies, incluidos los roedores9. Por lo tanto, los ovocitos de ratón adoptan una vía de ensamblaje del huso independiente del centríolo utilizando numerosos centros organizadores de microtúbulos acentriolares (MT) (MTOC)9,10. Tras la reanudación meiótica, los MTOC perinucleares experimentan tres pasos distintos de recondensación, estiramiento y fragmentación en un gran número de MTOC más pequeños11,12. Los MTOC fragmentados se agrupan y ordenan para organizar un huso bipolar10,13,14. Otro grupo de MTOC se encuentra en el citoplasma durante NEBD. Algunos de estos MTOC citoplasmáticos migran y forman polos fusiformes (MTOCs polares, pMTOCs)10,11. Recientemente, se descubrió otro subconjunto de MTOCs citoplasmáticos, denominados MTOCs citoplasmáticos metafásicos (mcMTOCs), que no contribuyen a la formación del polo fusiforme pero permanecen en el citoplasma ovocitario durante la metafase I (Met I)15. El agotamiento de los mcMTOC por ablación con láser multifotón o el aumento anormal de su número por inhibición de la autofagia perturba el posicionamiento y la migración del huso y aumenta la incidencia de aneuploidía en ovocitos metafase II15.
Curiosamente, los mcMTOC difieren de los pMTOC en muchos aspectos15. Por ejemplo, a diferencia de los pMTOC, que se originan principalmente en los MTOC perinucleares, los mcMTOC se originan en la corteza ovocitaria. Cuando el husillo todavía está en el centro del ovocito, los mcMTOC se localizan asimétricamente opuestos al lado al que migra el husillo para la extrusión de PB15. Las MT de tipo astral no pueden alcanzar la corteza en la célula de ovocitos relativamente grande. Por lo tanto, estos mcMTOC nuclean MT para anclar el huso (a través de MTOC astrales) a la corteza. Estos hallazgos sugieren un modelo en el que la fuerza MT nucleada por mcMTOC contrarresta la fuerza mediada por la actina F que impulsa la migración del huso hacia la corteza. El equilibrio entre estas dos fuerzas opuestas es esencial para regular el posicionamiento del husillo central y la migración oportuna del husillo15.
Hasta la fecha, todas las proteínas PMC examinadas (pericentrina, g-tubulina, Cep192 y Aurora quinasa A) se localizan en ambos grupos MTOC: mcMTOCs y pMTOCs15. Por lo tanto, no existe un enfoque químico o genético para perturbar selectivamente los mcMTOC sin perturbar los pMTOC. Estas limitaciones se pueden eludir dirigiéndose selectivamente a los mcMTOC con ablación láser. Entre las tecnologías basadas en láser desarrolladas para la microablación, los láseres de femtosegundo multifotón pulsados muestran un gran potencial debido a su impacto de precisión limitado al plano focal, la alta profundidad de penetración de la luz infrarroja cercana y la reducción de la fototoxicidad y el daño térmico a la célula16,17,18. Este trabajo describe un enfoque selectivo para extirpar mcMTOCs en ovocitos de ratón utilizando un láser multifotón acoplado a un microscopio invertido.

<table><tbody><tr><td>4 IN thinwall GL 1.0 OD/.75 ID</td><td>World precision instrument&amp;nbsp;</td><td>TW100F-4</td><td>Injection needles&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Borosilicate glass&amp;nbsp;</td><td>Fisherbrand&amp;nbsp;</td><td>Cat# 13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillarities&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instrument&amp;nbsp;</td><td>Cat# TW100-6</td><td>Holding needles&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bovine serum albumine&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# A4503</td><td></td></tr><tr><td>Cage incubator for Leica DMI6000 B microscope</td><td>Life Imaging Services GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcium chlrode dihydrate</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# C7902</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; controller&amp;nbsp;</td><td>Pecon</td><td># 0506.000</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Cover HP</td><td>Pecon</td><td># 0506.020</td><td></td></tr><tr><td>DL-Lactic acid&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# L7900</td><td></td></tr><tr><td>DMi8</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>Microscope&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# E5134</td><td></td></tr><tr><td>Femtojet 4i</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>Microinjector&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Femtotips Microloader</td><td>Fisher scientific&amp;nbsp;</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# G1272</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# 1272</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom dish&amp;nbsp;</td><td>Mat Tek Corporation</td><td>Cat# P35G-1.0-20-C&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hepes&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# H3784</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Sodium Salt</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat # H3784</td><td></td></tr><tr><td>Hera Cell vios 160i</td><td>Thermo&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Leica TCP SP8 spectral laser scanning confocal micorscope with inverted stand DMI6000 B</td><td>Leica Microsystems, Inc</td><td>N/A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat#G8540</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate dihydrate</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# M7774</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai DeepSee Ti-Sapphire femtosecond laser</td><td>Spectra-Physics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>mCH-Cep192 cRNA</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Medium Essential Medium Eagle - MEM</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat #M0258</td><td></td></tr><tr><td>Milrinone</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat# M4659</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat# M5310</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essential medium eagle (MEM)</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# M0268 - 1L</td><td></td></tr><tr><td>Mouse: Cep192-eGFP reporter CF-1</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (100 mm)</td><td>Fisherbrand&amp;nbsp;</td><td>Cat# FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (35 mm)</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>Cat# 430165</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (60 mm)</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>Cat# 351007</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# P5530</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrolidone</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat# P2307</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrolidone (PVP)</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# P2307</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# P5405</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# P5655</td><td></td></tr><tr><td>Pregnant mare&amp;acute;s serum gonadotropin&amp;nbsp;</td><td>Lee BioSolutions</td><td>Cat# 493-10-10&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvic acid&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# P4562</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvic acid&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# P4562</td><td></td></tr><tr><td>Sewing needles&amp;nbsp;</td><td>D.M.C</td><td>N/A</td><td>N&amp;deg; 5 * 16 Needles&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# S5761</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# S5886</td><td></td></tr><tr><td>Stage-top heating insert P</td><td>Pecon</td><td># 0426.300</td><td></td></tr><tr><td>Sterezoom S9i</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>Stereomicroscope&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Syringe 1 mL</td><td>BD company&amp;nbsp;</td><td>Cat# 309597</td><td></td></tr><tr><td>Taurine&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# T0625</td><td></td></tr><tr><td>Temperature controller Tempcontrol 37-2 &lt;em&gt;digital&lt;/em&gt;</td><td>Pecon</td><td># 0503.000</td><td></td></tr><tr><td>The Cube temperature controller for the cage incubator</td><td>Life Imaging Services GmbH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

multi-photon laser ablation of cytoplasmic microtubule organizing centers in mouse oocytes

La fidelidad de la meiosis ovocitaria es crítica para generar óvulos euploides competentes para el desarrollo. En los mamíferos, el ovocito sufre un largo paro en la profase I de la primera división meiótica. Después de la pubertad y tras la reanudación meiótica, la membrana nuclear se desmonta (ruptura de la envoltura nuclear), y el huso se ensambla principalmente en el centro de los ovocitos. El posicionamiento inicial del huso central es esencial para proteger contra las uniones anormales de cinetocoro-microtúbulos (MT) y la aneuploidía. El huso colocado centralmente migra de una manera sensible al tiempo hacia la corteza, y este es un proceso necesario para extruir un pequeño cuerpo polar. En las células mitóticas, el posicionamiento del huso se basa en la interacción entre las MT astrales mediadas por el centrosoma y la corteza celular. Por el contrario, los ovocitos de ratón carecen de centrosomas clásicos y, en cambio, contienen numerosos centros organizadores de MT acentriolares (MTOC). En la etapa de metafase I, los ovocitos de ratón tienen dos conjuntos diferentes de MTOC: (1) MTOC que se agrupan y clasifican para ensamblar polos del huso (MTOC polares) y (2) MTOC citoplasmáticos de metafase (mcMTOC) que permanecen en el citoplasma y no contribuyen directamente a la formación del huso, pero desempeñan un papel crucial en la regulación del posicionamiento del huso y la migración oportuna del huso. Aquí, se describe un método de ablación con láser multifotón para agotar selectivamente los mcMTOC marcados endógenamente en ovocitos recolectados de ratones reporteros Cep192-eGfp . Este método contribuye a la comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes al posicionamiento y la migración del huso en ovocitos de mamíferos.

La ablación con láser multifotón proporciona un método eficiente para extirpar selectivamente las estructuras intracelulares. El estudio actual empleó la ablación con láser multifotón para agotar los mcMTOC en ovocitos de ratón de forma selectiva. La ablación con láser agotó los mcMTOC de manera eficiente, como lo demuestra la reducción de la fluorescencia endógena de GFP en los mcMTOC específicos a un nivel comparable al de fondo. El mCh-Cep192 exógeno en los mcMTOC específicos también se abolió después de la ablación con láser. La ablación con láser de los mcMTOC debe realizarse en diferentes planos focales dentro del ovocito (donde se encuentran los mcMTOC, Figura 2) para garantizar que todos los mcMTOC dentro del ovocito se agoten (Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig01.jpg"> Figura 1: Microinyección de ovocitos. Microinyección de un ovocito de ratón detenido en profase I con ARNc mCh-Cep192 . Barra de escala: 10 μm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64439/64439fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig02.jpg"> Figura 2: Agotamiento de mcMTOCs en ovocitos de ratón. Imágenes representativas de planos focales individuales. Los cuadrados blancos indican un mcMTOC antes y después de la ablación con láser multifotón. Barra de escala: 40 μm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64439/64439fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig03.jpg"> Figura 3: Agotamiento de mcMTOCs en diferentes planos focales en un ovocito de ratón. Imágenes representativas de máxima proyección de un ovocito de ratón ablacionado por mcMTOC. Barra de escala: 20 μm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64439/64439fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Archivo complementario 1: Composiciones de Chatot, Ziomek y Bavister (CZB) y medio esencial mínimo libre de bicarbonato (MEM/PVP). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64439/64439_Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes

Se presenta un protocolo optimizado que permite el agotamiento de los centros organizadores de microtúbulos citoplasmáticos en ovocitos de ratón durante la metafase I utilizando un láser de femtosegundo de infrarrojo cercano.

Ablación con láser multifotón de centros organizadores de microtúbulos citoplasmáticos en ovocitos de ratón

The fidelity of oocyte meiosis is critical for generating developmentally competent euploid eggs. In mammals, the oocyte undergoes a lengthy arrest at ...

multi-photon-laser-ablation-cytoplasmic-microtubule-organizing

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

1.6K vistas.  University of Missouri. Se presenta un protocolo optimizado que permite el agotamiento de los centros organizadores de microtúbulos citoplasmáticos en ovocitos de ratón durante la metafase I utilizando un láser de femtosegundo de infrarrojo cercano. 

Video: Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Here we present a protocol for the characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar organization.

Aislamiento y caracterización de ratón antral Los ovocitos Sobre la base de organización de la cromatina nucleolar

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

Uso de ovocitos de ratón para evaluar la función humana del Gene durante la Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Genética

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that take place in the cytoplasm in preparation for fertilization and acquisition of totipotency. During oocyte maturation, changes in gene expression depend exclusively on the translation and degradation of maternal messenger RNAs (mRNAs) rather than on transcription. Execution of the translational program, therefore, plays a key role in establishing oocyte developmental competence to sustain embryo development. This paper is part of a focus on defining the program of maternal mRNA translation that takes place during meiotic maturation and at the oocyte-to-zygote transition. In this method paper, a strategy is presented to study the regulation of translation of target mRNAs during in vitro oocyte maturation. Here, a Ypet reporter is fused to the 3&#39; untranslated region (UTR) of the gene of interest and then micro-injected into oocytes together with polyadenylated mRNA encoding for mCherry to control for injected volume. By using time-lapse microscopy to measure reporter accumulation, translation rates are calculated at different transitions during oocyte meiotic maturation. Here, the protocols for oocyte isolation and injection, time-lapse recording, and data analysis have been described, using the Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3&#39; UTR reporter as an example.

This protocol describes a reporter assay to study the regulation of mRNA translation in single oocytes during in vitro maturation.

Definición del programa de traducción del ARNm materno durante la maduración in vitro utilizando un solo ensayo de reportero de ovocitos

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells entering meiotic prophase I are eliminated during Fetal Oocyte Attrition (FOA) and the first week of postnatal life. Three major mechanisms regulate the number of oocytes that survive during development and establish the ovarian reserve in females entering puberty. In the first wave of oocyte loss, 30-50% of the oocytes are eliminated during early FOA, a phenomenon that is attributed to high Long interspersed nuclear element-1 (LINE-1) expression. The second wave of oocyte loss is the elimination of oocytes with meiotic defects by a meiotic quality checkpoint. The third wave of oocyte loss occurs perinatally during primordial follicle formation when some oocytes fail to form follicles. It remains unclear what regulates each of these three waves of oocyte loss and how they shape the ovarian reserve in either mice or humans.
Immunofluorescence and 3D visualization have opened a new avenue to image and analyze oocyte development in the context of the whole ovary rather than in less informative 2D sections. This article provides a comprehensive protocol for whole ovary immunostaining and optical clearing, yielding preparations for imaging using multiphoton microscopy and 3D modeling using commercially available software. It shows how this method can be used to show the dynamics of oocyte attrition during ovarian development in C57BL/6J mice and quantify oocyte loss during the three waves of oocyte elimination. This protocol can be applied to prenatal and early postnatal ovaries for oocyte visualization and quantification, as well as other quantitative approaches. Importantly, the protocol was strategically developed to accommodate high-throughput, reliable, and repeatable processing that can meet the needs in toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Here, we present an optimized protocol for imaging entire ovaries for quantitative and qualitative analyses using whole-mount immunostaining, multiphoton microscopy, and 3D visualization and analysis. This protocol accommodates high-throughput, reliable, and repeatable processing that is applicable for toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Inmunofluorescencia de ovario completo, limpieza y microscopía multifotónica para el análisis cuantitativo en 3D de la reserva ovárica en desarrollo en ratones

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. Traditional pharmacological disruption of the ubiquitous microtubule network using, for instance, nocodazole can have devastating consequences for any cell. Reversibly photoswitchable microtubule inhibitors have the potential to overcome the limitations by enabling drug effects to be implemented in a spatiotemporally-controlled manner. One such family of drugs is the azobenzene-based photostatins (PSTs). These compounds are inactive in dark conditions, and upon illumination with UV light, they bind to the colchicine-binding site of &#946;-tubulin and block microtubule polymerization and dynamic turnover. Here, the application of PSTs in the 3-dimensional (3D) live preimplantation mouse embryo is set out to disrupt the microtubule network on a subcellular level. This protocol provides instructions for the experimental setup, as well as light activation and deactivation parameters for PSTs using live-cell confocal microscopy. This ensures reproducibility and enables others to apply this procedure to their research questions. Innovative photoswitches like PSTs may evolve as powerful tools to advance the understanding of the dynamic intracellular microtubule network and to non-invasively manipulate the cytoskeleton in real-time. Furthermore, PSTs may prove useful in other 3D structures such as organoids, blastoids, or embryos of other species.

Typical microtubule inhibitors, used widely in basic and applied research, have far-reaching effects on cells. Recently, photostatins emerged as a class of photoswitchable microtubule inhibitors, capable of instantaneous, reversible, spatiotemporally precise manipulation of microtubules. This step-by-step protocol details the application of photostatins in a 3D live preimplantation mouse embryo.

Manipulación subcelular espaciotemporal del citoesqueleto de microtúbulos en el embrión de ratón vivo preimplantacional utilizando fotostatinas

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. ...

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

Evaluación de la integridad del punto de control del ensamblaje del husillo en ovocitos de ratón

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

Identificación del daño en el ADN en ovocitos de ratones con profase detenida

Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain arrested at the prophase of meiosis I. The quiescent state may last for years until the oocytes receive a stimulus to grow and obtain the competency to resume meiosis. This protracted state of arrest makes them extremely susceptible to accumulating DNA-damaging insults, which affect the genetic integrity of the female gametes and, therefore, the genetic integrity of the future embryo. 
Consequently, the development of an accurate method to detect DNA damage, which is the first step for the establishment of DNA damage response mechanisms, is of vital importance. This paper describes a common protocol to test the presence and progress of DNA damage in prophase-arrested oocytes during a period of 20 h. Specifically, we dissect mouse ovaries, retrieve the cumulus-oocyte complexes (COCs), remove the cumulus cells from the COCs, and culture the oocytes in &#924;2 medium containing 3-isobutyl-1-methylxanthine to maintain the state of arrest. Thereafter, the oocytes are treated with the cytotoxic, antineoplasmic drug, etoposide, to engender double-strand breaks (DSBs). 
By using immunofluorescence and confocal microscopy, we detect and quantify the levels of the core protein &#947;H2AX, which is the phosphorylated form of the histone H2AX. H2AX becomes phosphorylated at the sites of DSBs after DNA damage. The inability to restore DNA integrity following DNA damage in oocytes can lead to infertility, birth defects, and increased rates of spontaneous abortions. Therefore, the understanding of DNA damage response mechanisms and, at the same time, the establishment of an intact method for studying these mechanisms are essential for reproductive biology research.

Autor destacado: Comprensión de la respuesta al daño del ADN en ovocitos de mamíferos y embriones preimplantacionales 

Maintaining oocyte genome integrity is necessary to ensure the genetic fidelity in the resulting embryo. Here, we present an accurate protocol for detecting DNA double-strand breaks in mammalian female germ cells.

Detección de roturas de ADN bicatenario en ovocitos de ratón

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

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Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

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