Os autores gostariam de agradecer a todos os membros do laboratório Balboula por sua valiosa ajuda e discussões. Os autores agradecem a Melina Schuh por gentilmente compartilhar o construto mCherry-Cep192. Este estudo foi apoiado pelo R35GM142537 (NIGMS, NIH) para AZB.

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pela Universidade do Missouri (Animal Care Quality Assurance Ref. Number 9695). Camundongos repórteres Cep192-eGFP fêmeas com idades entre 6-8 semanas de idade foram utilizados no presente estudo. Para gerar camundongos repórteres Cep192-eGFP , o reparo dirigido por homologia mediado por CRISPR/Cas9 foi usado para integrar o gene repórter EGFP no genoma do camundongo CF-1. O repórter do EGFP foi fundido no terminal C do Cep192 (componente integrante dos MTOCs)15. Para manter a colônia de camundongos, foram utilizados camundongos repórteres homozigotos Cep192-eGfp . Todos os animais foram mantidos em gaiolas (até quatro animais/gaiola) a 21 °C e 55% de umidade, com ciclo claro/escuro de 12 h e acesso ad libitum a alimentos e água.
1. Coleção de ovócitos do rato
<ol><li>Preparar o meio de cultura (Chatot, Ziomek e Bavister, CZB19, ver Tabela de Materiais) e incubá-lo a 37 °C e 5% de CO2 durante a noite. NOTA: O meio CZB pode ser armazenado a 4 °C durante 1 mês (consulte o arquivo suplementar 1 para a composição da mídia).</li>
	<li>Complementar o meio CZB com glutamina (1 mM) e milrinona (2,5 mM) (CZB + M) (ver Tabela de Materiais) e colocá-lo na incubadora. NOTA: A milrinona é um inibidor da fosfodiesterase que mantém os ovócitos presos na prófase I e impede a retomada meiótica20.</li>
	<li>Prepare o meio de coleta (meio essencial mínimo livre de bicarbonato, MEM) contendo 3 mg/mL de polivinilpirolidona (PVP), 25 mM HEPES (pH 7,3) (Arquivo Suplementar 1) e milrinona (2,5 mM) (MEM/PVP + M, consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Preparar os pratos de coleta e cultura, fazer quatro microgotas (100 μL) de meio de coleta (MEM/PVP + M) e duas microgotas (100 μL) de meio de cultura (CZB + M) em placas de Petri de 60 mm e 35 mm, respectivamente, e cobri-las com óleo mineral (ver Tabela de Materiais). Mantenha o prato de coleta na lâmina mais quente e coloque o prato de cultura na incubadora a 37 °C e 5% de CO2.</li>
	<li>Injetar por via intraperitoneal 5 UI de gonadotrofina sérica de égua grávida (PMSG, ver Tabela de Materiais) em ratas fêmeas Cep192-eGFP sexualmente maduras (6-8 semanas de idade) 44-48 h antes da recolha de ovócitos.</li>
	<li>Sacrificar os camundongos por luxação cervical, identificar e remover os ovários21 e transferi-los para um vidro de relógio contendo meio de coleta pré-aquecido (MEM/PVP + M) a 37 °C.</li>
	<li>Fixe o ovário tocando uma seringa de 1 ml no fundo do vidro do relógio e perfurando-o várias vezes (~ 40 vezes por ovário) usando agulhas de costura agrupadas para liberar os oócitos no meio.</li>
	<li>Usando uma pipeta de transferência de plástico, transfira todo o meio que contém os complexos cumulus-ovócitos (COCs) da etapa 1.7 para uma placa de Petri de plástico vazia de 100 mm.</li>
	<li>Sob um estereomicroscópio, colete os COCs usando uma pipeta de vidro Pasteur e transfira-os para o prato de coleta que contém MEM / PVP + M.</li>
	<li>Usando uma pipeta de vidro Pasteur estreita (aproximadamente 100 μm de diâmetro), desnude os oócitos mecanicamente por pipetagem repetitiva suave, seguida de transferi-los e lavá-los em quatro microgotas de (100 μL) MEM/PVP + M (o prato de coleta) antes de sua transferência para o prato de cultura CZB + M.</li>
	<li>Incubar os ovócitos desnudados durante 1 h a 37 °C com 5% de CO2 no ar.</li>
</ol>2. Microinjeção de ovócitos
<ol><li>Coloque uma gota de 250 μL de MEM/PVP + M em uma tampa de placa de Petri de plástico de 100 mm e cubra-a com óleo mineral. NOTA: A tampa da placa de Petri tem um aro inferior que fornece mais espaço para ajustar o micromanipulador.</li>
	<li>Ligue o sistema de microinjeção (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Colocar a placa de microinjeção na fase de aquecimento (37 °C) do microscópio.</li>
	<li>Carregue a agulha de injeção com 0,5 μL de cRNA mCh-Cep192usando as pontas da pipeta do microcarregador (consulte Tabela de Materiais) e prenda a agulha de injeção ao micromanipulador.</li>
	<li>Transferir os ovócitos desnudos (etapa 1.11) para a microgota de 250 μL (etapa 2.1).</li>
	<li>Sob uma lente objetiva de 20x ou 40x, ajuste a posição e o foco das agulhas de injeção e de retenção de acordo com a posição do ovócito (Figura 1).</li>
	<li>Configure a unidade de microinjeção e defina a pressão de injeção (p i), a pressão de compensação (pc) e o tempo de injeção (ti) para poder injetar 5-10 pl de cRNA mCh-Cep192 (para rotular exogenamente os MTOCs).</li>
	<li>Injete cuidadosamente os oócitos sem tocar no núcleo.</li>
	<li>Uma vez que todos os ovócitos são injetados, lave-os em três microgotas de CZB + M, transfira-os para a placa de cultura (CZB + M) e incube-os por 3 h a 37 °C para permitir a expressão de mCh-Cep192.</li>
</ol>3. Maturação dos ovócitos
<ol><li>Preparar o meio de maturação adicionando glutamina (1 mM) a um meio CZB pré-equilibrado numa incubadora com 5% de CO2 no ar a 37 °C durante, pelo menos, 3 h.</li>
	<li>Faça duas microgotas (100 μL) do meio de maturação em uma placa de Petri de 35 mm e cubra-as com óleo mineral (placa de maturação).</li>
	<li>Lave os ovócitos presos à prófase I pelo menos três vezes em microgotas de CZB isentas de milrinona de 100 μL para remover completamente a milrinona e permitir a retomada meiótica.</li>
	<li>Transferir os ovócitos para a placa de maturação e incubá-los por 5 h (estágio de prometáfase I) em incubadora umidificada com 5% de CO2 em ar a 37 °C.</li>
</ol>4. Preparação de ovócitos para ablação e imagem
<ol><li>Transferir os ovócitos da prometáfase I (etapa 3.4) para uma placa de cultura com fundo de vidro contendo 100 μL de meio de maturação (etapa 3.1) coberto com óleo mineral.</li>
</ol>5. Preparação do microscópio para ablação
<ol><li>Pelo menos 30 min antes da ablação, ligue o controlador de temperatura da incubadora de palco (ver Tabela de Materiais) e fixe-o a 37 °C.</li>
	<li>Ligue o controlador de CO 2 e defina-o em 5% de CO2.</li>
	<li>Selecione uma objetiva apocromática de imersão em óleo de 40x e aplique uma pequena gota do óleo de imersão.</li>
	<li>Monte o prato de cultura com fundo de vidro com os oócitos em uma incubadora de topo de palco e cubra a incubadora com uma tampa de gás.</li>
	<li>No software de aquisição de imagens (consulte a Tabela de Materiais), selecione uma opção que permita salvar várias posições de estágio (por exemplo, "Definir marca e encontrar experimento"). Usando a iluminação de campo brilhante de luz transmitida, centralize nos ovócitos individuais e salve suas posições.</li>
	<li>No software de aquisição de imagens, selecione o modo de digitalização XYZ , defina o formato da imagem como 256 x 256 pixels, defina o fator de zoom como 2,5x - 3,0x e selecione uma frequência de digitalização de 600 Hz. Isso corresponde a um tempo de permanência de pixels de aproximadamente 1,6 μs.</li>
	<li>Defina uma linha de laser de excitação de 488 nm a aproximadamente 10% da potência do laser (o que corresponde a 4,0 μW no nível da amostra) (veja Tabela de Materiais) e use uma largura de banda espectral de 500-550 nm para observar o sinal GFP dos MTOCs. Para a observação simultânea da fluorescência do Cep192 marcado com mCherry, defina uma linha de laser de excitação de 585 nm em aproximadamente 8% da potência do laser (o que corresponde a 10,7 μW no nível da amostra) e use outro detector ajustado para uma largura de banda espectral de 595-645 nm. NOTA: É útil usar o detector de luz transmitida (TLD) do microscópio confocal para detectar simultaneamente os limites dos ovócitos.</li>
	<li>Usando um modo de varredura ao vivo e o controle manual da unidade z, filtre o ovócito para MTOCs.</li>
	<li>Uma vez que um mcMTOC é detectado, desenhe uma região quadrada de interesse (ROI) em torno dele.</li>
</ol>6. Ablação de mcMTOCs
<ol><li>Defina um laser de femtossegundo para um comprimento de onda de 740 nm. NOTA: O comprimento de onda do laser pode ser alterado de acordo com o microscópio e as condições do laser.</li>
	<li>Use o modulador eletro-óptico do microscópio multifóton (ver Tabela de Materiais) para definir a potência do laser para 70%-80%, correspondendo à potência de 60-70 mW no plano da amostra. NOTA: Se o laser estiver equipado com um compensador de pulso de femtossegundos, use-o para corrigir a dispersão de atraso de grupo (GDD). A correção de GDD reduz a quantidade de energia do laser necessária para uma ablação eficiente do mcMTOC e minimiza os fotodanos ao ovócito. O controle GDD é geralmente integrado com o software de aquisição de imagem de microscópios multifótons comerciais.</li>
	<li>Use o mesmo formato de imagem, fator de zoom e frequência de digitalização como na etapa 5.6. Defina os parâmetros de média de linha e quadro como 1.</li>
	<li>Clique no botão Scan no software para realizar a ablação do mcMTOC realizando uma única varredura a laser do ROI selecionado.</li>
	<li>Use as configurações de canal da etapa 5.7 para revisar os resultados da ablação comparando as imagens das estruturas marcadas com GFP tiradas antes e depois da exposição ao laser multifóton. Se a ablação for bem-sucedida, a intensidade da fluorescência da GFP no mcMTOC alvo diminui para os níveis observados no fundo.</li>
	<li>Se alguns fragmentos de uma estrutura de marcação GFP permanecerem, repita a etapa 6.4 uma ou mais vezes, concentrando-se em vários planos z do mcMTOC.</li>
	<li>Use as configurações de canal da etapa 5.7 para verificar a eficiência da ablação pela perda completa de sinais mCherry associados ao mcMTOC (mCh-Cep192).</li>
	<li>Repita a etapa 5.8 para a etapa 6.7 até que todos os MTOCs de um ovócito (em vários planos focais) sejam ablados. NOTA: Este protocolo usa a microinjeção mCh-Cep192 como uma estratégia para confirmar a depleção de mcMTOC após a exposição ao laser multifóton e excluir a possibilidade de que a perda de fluorescência de GFP seja causada pelo fotobranqueamento de GFP. No entanto, a microinjeção desta sonda é opcional e não é necessária para o procedimento de ablação.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bennabi, I., Terret, M. E., Verlhac, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+spindle+assembly+and+chromosome+segregation+in+oocytes.">Meiotic spindle assembly and chromosome segregation in oocytes.</a> Journal of Cell Biology. 215 (5), 611-619 (2016).</li><li>Hashimoto, N., Kishimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+meiotic+metaphase+by+a+cytoplasmic+maturation-promoting+factor+during+mouse+oocyte+maturation.">Regulation of meiotic metaphase by a cytoplasmic maturation-promoting factor during mouse oocyte maturation.</a> Development Biology. 126 (2), 242-252 (1988).</li><li>Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+kinetochore+tracking+reveals+error-prone+homologous+chromosome+biorientation+in+mammalian+oocytes.">Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes.</a> Cell. 146 (4), 568-581 (2011).</li><li>Azoury, J., Verlhac, M. H., Dumont, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+filaments:+Key+players+in+the+control+of+asymmetric+divisions+in+mouse+oocytes.">Actin filaments: Key players in the control of asymmetric divisions in mouse oocytes.</a> Biology of the Cell. 101 (2), 69-76 (2009).</li><li>Li, H., Guo, F., Rubinstein, B., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-driven+chromosomal+motility+leads+to+symmetry+breaking+in+mammalian+meiotic+oocytes.">Actin-driven chromosomal motility leads to symmetry breaking in mammalian meiotic oocytes.</a> Nature Cell Biology. 10 (11), 1301-1308 (2008).</li><li>Schuh, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+for+asymmetric+spindle+positioning+in+mouse+oocytes.">A new model for asymmetric spindle positioning in mouse oocytes.</a> Current Biology. 18 (24), 1986-1992 (2008).</li><li>Pimenta-Marques, A., Bettencourt-Dias, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericentriolar+material.">Pericentriolar material.</a> Current Biology. 30 (12), 687-689 (2020).</li><li>Hinchcliffe, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosome+and+bipolar+spindle+assembly:+Does+one+have+anything+to+do+with+the+other.">The centrosome and bipolar spindle assembly: Does one have anything to do with the other.</a> Cell Cycle. 10 (22), 3841-3848 (2011).</li><li>Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+centrioles+in+the+first+and+second+meiotic+spindles+of+mouse+oocytes.">Absence of centrioles in the first and second meiotic spindles of mouse oocytes.</a> Journal of Cell Science. 11 (2), 521-541 (1972).</li><li>Schuh, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+MTOCs+replaces+centrosome+function+during+acentrosomal+spindle+assembly+in+live+mouse+oocytes.">Self-organization of MTOCs replaces centrosome function during acentrosomal spindle assembly in live mouse oocytes.</a> Cell. 130 (3), 484-498 (2007).</li><li>Clift, D., Schuh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-step+MTOC+fragmentation+mechanism+facilitates+bipolar+spindle+assembly+in+mouse+oocytes.">A three-step MTOC fragmentation mechanism facilitates bipolar spindle assembly in mouse oocytes.</a> Nature Communications. 6, 7217 (2015).</li><li>Luksza, M., Queguigner, I., Verlhac, M. H., Brunet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+MTOCs+upon+centriole+loss+during+mouse+oogenesis.">Rebuilding MTOCs upon centriole loss during mouse oogenesis.</a> Developmental Biology. 382 (1), 48-56 (2013).</li><li>Balboula, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haspin+kinase+regulates+microtubule-organizing+center+clustering+and+stability+through+Aurora+kinase+C+in+mouse+oocytes.">Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes.</a> Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).</li><li>Breuer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HURP+permits+MTOC+sorting+for+robust+meiotic+spindle+bipolarity,+similar+to+extra+centrosome+clustering+in+cancer+cells.">HURP permits MTOC sorting for robust meiotic spindle bipolarity, similar to extra centrosome clustering in cancer cells.</a> Journal of Cell Biology. 191 (7), 1251-1260 (2010).</li><li>Londo&#241;o-V&#225;squez, D., Rodriguez-Lukey, K., Behura, S. K., Balboula, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+organizing+centers+regulate+spindle+positioning+in+mouse+oocytes.">Microtubule organizing centers regulate spindle positioning in mouse oocytes.</a> Developmental Cell. 57 (2), 197-211 (2022).</li><li>Konig, K., Riemann, I., Fischer, P., Halbhuber, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+nanosurgery+with+near+infrared+femtosecond+laser+pulses.">Intracellular nanosurgery with near infrared femtosecond laser pulses.</a> Cellular and Molecular Biology. 45 (2), 195-201 (1999).</li><li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation.">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).</li><li>Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+of+the+microtubule+cytoskeleton:+Setting+up+and+working+with+an+ablation+system.">Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: Setting up and working with an ablation system.</a> Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).</li><li>Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+culture+medium+supports+development+of+random-bred+1-cell+mouse+embryos+in+vitro.">An improved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 86 (2), 679-688 (1989).</li><li>Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+maturation+involves+compartmentalization+and+opposing+changes+of+cAMP+levels+in+follicular+somatic+and+germ+cells:+Studies+using+selective+phosphodiesterase+inhibitors.">Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: Studies using selective phosphodiesterase inhibitors.</a> Developmental Biology. 178 (2), 393-402 (1996).</li><li>Greaney, J., Subramanian, G. N., Ye, Y., Homer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+culture+of+mouse+oocytes.">Isolation and in vitro culture of mouse oocytes.</a> Bio Protocol. 11 (15), 4104 (2021).</li><li>Khodjakov, A., Cole, R. W., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synergy+of+technologies:+Combining+laser+microsurgery+with+green+fluorescent+protein+tagging.">A synergy of technologies: Combining laser microsurgery with green fluorescent protein tagging.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 38 (4), 311-317 (1997).</li><li>Pavin, N., Tolic, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+the+mitotic+spindle.">Mechanobiology of the mitotic spindle.</a> Developmental Cell. 56 (2), 192-201 (2021).</li><li>Khodjakov, A., Cole, R. W., Oakley, B. R., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome-independent+mitotic+spindle+formation+in+vertebrates.">Centrosome-independent mitotic spindle formation in vertebrates.</a> Current Biology. 10 (2), 59-67 (2000).</li><li>Aist, J. R., Liang, H., Berns, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astral+and+spindle+forces+in+PtK2+cells+during+anaphase+B:+a+laser+microbeam+study.">Astral and spindle forces in PtK2 cells during anaphase B: a laser microbeam study.</a> Journal of Cell Science. 104, 1207-1216 (1993).</li><li>Bennabi, I., Manil-Segalen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Ablation+of+microtubule-chromosome+attachment+in+mouse+oocytes.">Laser Ablation of microtubule-chromosome attachment in mouse oocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1818, 153-161 (2018).</li><li>Milas, A., Jagric, M., Martincic, J., Tolic, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+reversible+knocksideways,+laser+ablation,+and+photoactivation+on+the+mitotic+spindle+in+human+cells.">Optogenetic reversible knocksideways, laser ablation, and photoactivation on the mitotic spindle in human cells.</a> Methods in Cell Biology. 145, 191-215 (2018).</li><li>Warzych, E., Lipinska, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+follicular+environment+during+oocyte+growth+and+maturation.">Energy metabolism of follicular environment during oocyte growth and maturation.</a> Journal of Reproduction and Development. 66 (1), 1-7 (2020).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li></ol>

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Existem diferentes métodos para perturbar as estruturas relacionadas ao citoesqueleto dentro das células22,23,24,25. No entanto, encontrar técnicas eficientes para perturbar seletivamente a estrutura alvo sem comprometer a viabilidade celular é um desafio. O método de ablação a laser multifóton aqui apresentado é uma estratégia eficiente para induzir uma perturbação mecânica seletiva aos mcMTOCs dentro do ovócito sem alterar a viabilidade do ovócito.
A ablação a laser tem sido amplamente utilizada para compreender os mecanismos moleculares que controlam a segregação cromossômica durante a mitose e meiose22,23,26,27. Devido ao tamanho relativamente grande (>80 mm de diâmetro) dos ovócitos de mamíferos em comparação com as células somáticas28, a ablação de suas estruturas intracelulares representa um desafio. Além disso, o volume médio de mcMTOC em ovócitos de metáfase I é de ~20 μm15, representando um desafio adicional. Um método eficiente que ofereça uma penetração tecidual mais profunda deve ser adotado para superar esses desafios. A principal vantagem do uso do laser multifóton para ablação é sua capacidade de penetrar mais profundamente na célula, minimizando os efeitos fora do alvo29.
Para verificar a eficácia e a eficiência do método de ablação a laser para esgotar a estrutura alvo, recomenda-se o uso de uma proteína marcada fluorescentemente para identificar a estrutura alvo ao longo do tempo (antes e após a ablação)23. É importante notar que a ablação a laser esgota todo o mcMTOC como estrutura e, embora mcMTOCs menores exijam apenas uma única exposição ao laser para serem esgotados, mcMTOCs maiores podem exigir mais de uma exposição a laser em diferentes planos focais. Recomenda-se também fixar e imunomarcar um subconjunto de oócitos ablados-mcMTOC e de controle com um marcador MTOC (como γ-tubulina, pericentrina ou Cep192) para confirmar ainda mais a eficiência da ablação mcMTOC. Nos ovócitos de controle, áreas do citoplasma adjacentes, mas não sobrepostas aos mcMTOCs, serão expostas ao laser.
Este experimento requer várias ablações mcMTOC enquanto se move entre diferentes planos focais dentro dos ovócitos. Portanto, é altamente recomendável praticar essa técnica várias vezes antes de executar o experimento para minimizar o tempo de experimento, aumentando assim a viabilidade dos ovócitos. Além disso, é importante usar a potência mínima do laser que seja suficiente para esgotar os mcMTOCs sem afetar a viabilidade dos ovócitos.
Esta técnica tem algumas limitações. Primeiro, os microscópios confocais multifótons são relativamente mais caros do que os microscópios confocais regulares. Em segundo lugar, perturbar todos os mcMTOCs em diferentes planos focais é mais demorado do que perturbações químicas ou genéticas. Em terceiro lugar, este protocolo requer habilidades técnicas para ablar todos os mcMTOCs no menor tempo possível. No entanto, uma vez dominado, o uso do laser multifóton fornece uma excelente estratégia para perturbar várias estruturas intracelulares em ovócitos de camundongos, incluindo mcMTOCs, contribuindo para a compreensão dos mecanismos moleculares que regulam o posicionamento do fuso e sua migração oportuna em ovócitos de mamíferos.

Os gametas haploides (espermatozoides e ovócitos) são produzidos através da meiose, o que implica uma rodada de replicação do DNA seguida por duas divisões consecutivas que são necessárias para a redução do número cromossômico antes da fertilização. Em mamíferos, durante o início da vida fetal, o ovócito sofre uma longa parada (até a puberdade) no estágio diploteno da prófase I da primeira divisão meiótica, um estágio chamado estágio vesícula germinal (GV). Após a retomada meiótica, o ovócito GV sofre quebra do envelope nuclear (NEBD), e o fuso é montado principalmente no centro do ovócito 1,2,3. Posteriormente, impulsionado pela F-actina, o fuso migra em tempo hábil do centro do ovócito para o córtex para garantir uma divisão altamente assimétrica, resultando em um ovo com um minúsculo corpo polar (PB)4,5,6.
Nas células mitóticas, os centrossomos consistem em um par de centríolos circundados por componentes de material pericentríolo (PMC), como pericentrina, γ-tubulina, Cep152 e Cep1927. Esses centrossomos contendo centríolos contribuem para a fidelidade da formação do fuso bipolar8. No entanto, os centríolos são perdidos durante a oogênese precoce em várias espécies, incluindo roedores9. Portanto, os ovócitos de camundongos adotam uma via de montagem de fuso independente de centríolo utilizando numerosos centros organizadores de microtúbulos acentriolares (MTOCs)9,10. Após a retomada meiótica, os MTOCs perinucleares passam por três etapas distintas de recondensação, alongamento e fragmentação em um grande número de MTOCs menores11,12. Os MTOCs fragmentados são então agrupados e classificados para organizar um fuso bipolar10,13,14. Outro pool de MTOCs está localizado no citoplasma durante o NEBD. Alguns desses MTOCs citoplasmáticos migram e formam polos fusiformes (MTOCs polares, pMTOCs)10,11. Recentemente, outro subconjunto de MTOCs citoplasmáticos foi descoberto, denominado MTOCs citoplasmáticos de metáfase (mcMTOCs), que não contribuem para a formação de polos fusiformes, mas permanecem no citoplasma de ovócitos durante a metáfase I (Met I)15. O esgotamento dos mcMTOCs pela ablação a laser multifótons ou o aumento anormal de seu número pela inibição da autofagia perturba o posicionamento e a migração do fuso e aumenta a incidência de aneuploidia em ovócitos da metáfase II15.
Curiosamente, os mcMTOCs diferem dos pMTOCs em muitos aspectos15. Por exemplo, em contraste com os pMTOCs, que se originam principalmente de MTOCs perinucleares, os mcMTOCs se originam do córtex de ovócitos. Quando o fuso ainda está no centro do ovócito, os mcMTOCs estão localizados assimetricamente opostos ao lado para o qual o fuso migra para extrusão PB15. Os MTs semelhantes a astrais não podem alcançar o córtex na célula de ovócitos relativamente grande. Portanto, esses mcMTOCs nucleam MTs para ancorar o fuso (via MTOCs astrais) ao córtex. Essas descobertas sugerem um modelo no qual a força MT nucleada por mcMTOC neutraliza a força mediada por F-actina que impulsiona a migração do fuso em direção ao córtex. O equilíbrio entre essas duas forças opostas é essencial para regular o posicionamento do fuso central e a migração oportuna dofuso 15.
Até o momento, todas as proteínas PMC examinadas (pericentrina, g-tubulina, Cep192 e Aurora quinase A) localizam-se em ambos os pools MTOC: mcMTOCs e pMTOCs15. Portanto, não há abordagem química ou genética para perturbar seletivamente os mcMTOCs sem perturbar os pMTOCs. Essas limitações podem ser contornadas visando seletivamente os mcMTOCs com ablação a laser. Dentre as tecnologias baseadas em laser desenvolvidas para microablação, os lasers de femtossegundos multifótons pulsados apresentam grande potencial devido ao seu impacto de precisão limitado ao plano focal, à alta profundidade de penetração da luz infravermelha próxima e à fototoxicidade e danos térmicos reduzidos à célula16,17,18. Este trabalho descreve uma abordagem seletiva para ablar mcMTOCs em ovócitos de camundongos usando um laser multifóton acoplado a um microscópio invertido.

<table><tbody><tr><td>4 IN thinwall GL 1.0 OD/.75 ID</td><td>World precision instrument&amp;nbsp;</td><td>TW100F-4</td><td>Injection needles&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Borosilicate glass&amp;nbsp;</td><td>Fisherbrand&amp;nbsp;</td><td>Cat# 13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillarities&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instrument&amp;nbsp;</td><td>Cat# TW100-6</td><td>Holding needles&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bovine serum albumine&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# A4503</td><td></td></tr><tr><td>Cage incubator for Leica DMI6000 B microscope</td><td>Life Imaging Services GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcium chlrode dihydrate</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# C7902</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; controller&amp;nbsp;</td><td>Pecon</td><td># 0506.000</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Cover HP</td><td>Pecon</td><td># 0506.020</td><td></td></tr><tr><td>DL-Lactic acid&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# L7900</td><td></td></tr><tr><td>DMi8</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>Microscope&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# E5134</td><td></td></tr><tr><td>Femtojet 4i</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>Microinjector&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Femtotips Microloader</td><td>Fisher scientific&amp;nbsp;</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# G1272</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# 1272</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom dish&amp;nbsp;</td><td>Mat Tek Corporation</td><td>Cat# P35G-1.0-20-C&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hepes&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# H3784</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Sodium Salt</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat # H3784</td><td></td></tr><tr><td>Hera Cell vios 160i</td><td>Thermo&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Leica TCP SP8 spectral laser scanning confocal micorscope with inverted stand DMI6000 B</td><td>Leica Microsystems, Inc</td><td>N/A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat#G8540</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate dihydrate</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# M7774</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai DeepSee Ti-Sapphire femtosecond laser</td><td>Spectra-Physics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>mCH-Cep192 cRNA</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Medium Essential Medium Eagle - MEM</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat #M0258</td><td></td></tr><tr><td>Milrinone</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat# M4659</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat# M5310</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essential medium eagle (MEM)</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# M0268 - 1L</td><td></td></tr><tr><td>Mouse: Cep192-eGFP reporter CF-1</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (100 mm)</td><td>Fisherbrand&amp;nbsp;</td><td>Cat# FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (35 mm)</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>Cat# 430165</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (60 mm)</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>Cat# 351007</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# P5530</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrolidone</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat# P2307</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrolidone (PVP)</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# P2307</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# P5405</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# P5655</td><td></td></tr><tr><td>Pregnant mare&amp;acute;s serum gonadotropin&amp;nbsp;</td><td>Lee BioSolutions</td><td>Cat# 493-10-10&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvic acid&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# P4562</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvic acid&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# P4562</td><td></td></tr><tr><td>Sewing needles&amp;nbsp;</td><td>D.M.C</td><td>N/A</td><td>N&amp;deg; 5 * 16 Needles&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# S5761</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# S5886</td><td></td></tr><tr><td>Stage-top heating insert P</td><td>Pecon</td><td># 0426.300</td><td></td></tr><tr><td>Sterezoom S9i</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>Stereomicroscope&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Syringe 1 mL</td><td>BD company&amp;nbsp;</td><td>Cat# 309597</td><td></td></tr><tr><td>Taurine&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# T0625</td><td></td></tr><tr><td>Temperature controller Tempcontrol 37-2 &lt;em&gt;digital&lt;/em&gt;</td><td>Pecon</td><td># 0503.000</td><td></td></tr><tr><td>The Cube temperature controller for the cage incubator</td><td>Life Imaging Services GmbH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

multi-photon laser ablation of cytoplasmic microtubule organizing centers in mouse oocytes

A fidelidade da meiose de ovócitos é fundamental para a geração de ovos euploides competentes em termos de desenvolvimento. Nos mamíferos, o ovócito sofre uma longa prisão na prófase I da primeira divisão meiótica. Após a puberdade e após a retomada meiótica, a membrana nuclear se desmonta (quebra do envelope nuclear), e o fuso é montado principalmente no centro do ovócito. O posicionamento inicial do fuso central é essencial para proteger contra ligações anormais de cinetocócoro-microtúbulo (MT) e aneuploidia. O fuso posicionado centralmente migra de maneira sensível ao tempo em direção ao córtex, e esse é um processo necessário para extrudar um minúsculo corpo polar. Nas células mitóticas, o posicionamento do fuso depende da interação entre os MTs astrais mediados pelo centrossomo e o córtex celular. Pelo contrário, os ovócitos de camundongos não possuem centrossomos clássicos e, em vez disso, contêm numerosos centros organizadores de MT acentriolares (MTOCs). No estágio de metáfase I, os oócitos de camundongos têm dois conjuntos diferentes de MTOCs: (1) MTOCs que são agrupados e classificados para montar polos fusiformes (MTOCs polares) e (2) MTOCs citoplasmáticos de metáfase (mcMTOCs) que permanecem no citoplasma e não contribuem diretamente para a formação do fuso, mas desempenham um papel crucial na regulação do posicionamento do fuso e na migração oportuna do fuso. Aqui, um método de ablação a laser multifóton é descrito para esgotar seletivamente mcMTOCs endogenamente marcados em oócitos coletados de camundongos repórteres Cep192-eGfp . Este método contribui para a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes ao posicionamento e migração do fuso em ovócitos de mamíferos.

A ablação a laser multifóton fornece um método eficiente para ablar seletivamente estruturas intracelulares. O presente estudo empregou a ablação a laser multifóton para esgotar mcMTOCs em oócitos de camundongos seletivamente. A ablação a laser esgotou os mcMTOCs de forma eficiente, como demonstrado pela redução da fluorescência endógena de GFP nos mcMTOCs alvo para um nível comparável ao fundo. O mCh-Cep192 exógeno nos mcMTOCs alvo também foi abolido após a ablação a laser. A ablação a laser de mcMTOCs deve ser realizada em diferentes planos focais dentro do ovócito (onde os mcMTOCs estão localizados, Figura 2) para garantir que todos os mcMTOCs dentro do ovócito estejam esgotados (Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig01.jpg"> Figura 1: Microinjeção de ovócitos. Microinjeção de um ovócito de camundongo preso por prófase I com cRNA mCh-Cep192 . Barra de escala: 10 μm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64439/64439fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig02.jpg"> Figura 2: Depleção de mcMTOCs em ovócitos de ratinhos. Imagens representativas de planos focais únicos. Os quadrados brancos indicam um mcMTOC antes e depois da ablação a laser multifóton. Barra de escala: 40 μm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64439/64439fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig03.jpg"> Figura 3: Depleção de mcMTOCs em diferentes planos focais em um ovócito de camundongo. Imagens de projeção máxima representativas de um ovócito de rato ablado-mcMTOC. Barra de escala: 20 μm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64439/64439fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Arquivo Suplementar 1: Composições de Chatot, Ziomek e Bavister (CZB) e meio essencial mínimo livre de bicarbonato (MEM/PVP). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64439/64439_Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes

Apresenta-se um protocolo otimizado que permite a depleção de centros organizadores de microtúbulos citoplasmáticos em ovócitos de camundongos durante a metáfase I utilizando um laser de femtossegundos no infravermelho próximo.

Ablação a Laser Multifóton de Centros Organizadores de Microtúbulos Citoplasmáticos em Oócitos de Camundongos

The fidelity of oocyte meiosis is critical for generating developmentally competent euploid eggs. In mammals, the oocyte undergoes a lengthy arrest at ...

multi-photon-laser-ablation-cytoplasmic-microtubule-organizing

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

1.6K visualizações.  University of Missouri. Apresenta-se um protocolo otimizado que permite a depleção de centros organizadores de microtúbulos citoplasmáticos em ovócitos de camundongos durante a metáfase I utilizando um laser de femtossegundos no infravermelho próximo. 

Vídeo: Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Here we present a protocol for the characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar organization.

Isolamento e Caracterização do mouse Antral Oócitos Baseado em Nucleolar organização da cromatina

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Biologia do Desenvolvimento

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

Usando oócitos de camundongo para avaliar a função de genes humanos durante a meiose I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Genética

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that take place in the cytoplasm in preparation for fertilization and acquisition of totipotency. During oocyte maturation, changes in gene expression depend exclusively on the translation and degradation of maternal messenger RNAs (mRNAs) rather than on transcription. Execution of the translational program, therefore, plays a key role in establishing oocyte developmental competence to sustain embryo development. This paper is part of a focus on defining the program of maternal mRNA translation that takes place during meiotic maturation and at the oocyte-to-zygote transition. In this method paper, a strategy is presented to study the regulation of translation of target mRNAs during in vitro oocyte maturation. Here, a Ypet reporter is fused to the 3&#39; untranslated region (UTR) of the gene of interest and then micro-injected into oocytes together with polyadenylated mRNA encoding for mCherry to control for injected volume. By using time-lapse microscopy to measure reporter accumulation, translation rates are calculated at different transitions during oocyte meiotic maturation. Here, the protocols for oocyte isolation and injection, time-lapse recording, and data analysis have been described, using the Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3&#39; UTR reporter as an example.

This protocol describes a reporter assay to study the regulation of mRNA translation in single oocytes during in vitro maturation.

Definindo o Programa de Tradução materna mRNA durante a maturação in vitro usando um ensaio de repórter oócito único

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells entering meiotic prophase I are eliminated during Fetal Oocyte Attrition (FOA) and the first week of postnatal life. Three major mechanisms regulate the number of oocytes that survive during development and establish the ovarian reserve in females entering puberty. In the first wave of oocyte loss, 30-50% of the oocytes are eliminated during early FOA, a phenomenon that is attributed to high Long interspersed nuclear element-1 (LINE-1) expression. The second wave of oocyte loss is the elimination of oocytes with meiotic defects by a meiotic quality checkpoint. The third wave of oocyte loss occurs perinatally during primordial follicle formation when some oocytes fail to form follicles. It remains unclear what regulates each of these three waves of oocyte loss and how they shape the ovarian reserve in either mice or humans.
Immunofluorescence and 3D visualization have opened a new avenue to image and analyze oocyte development in the context of the whole ovary rather than in less informative 2D sections. This article provides a comprehensive protocol for whole ovary immunostaining and optical clearing, yielding preparations for imaging using multiphoton microscopy and 3D modeling using commercially available software. It shows how this method can be used to show the dynamics of oocyte attrition during ovarian development in C57BL/6J mice and quantify oocyte loss during the three waves of oocyte elimination. This protocol can be applied to prenatal and early postnatal ovaries for oocyte visualization and quantification, as well as other quantitative approaches. Importantly, the protocol was strategically developed to accommodate high-throughput, reliable, and repeatable processing that can meet the needs in toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Here, we present an optimized protocol for imaging entire ovaries for quantitative and qualitative analyses using whole-mount immunostaining, multiphoton microscopy, and 3D visualization and analysis. This protocol accommodates high-throughput, reliable, and repeatable processing that is applicable for toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Imunofluorescência total do ovário, compensação e microscopia multifotínica para análise quantitativa 3D da reserva ovariana em desenvolvimento em mouse

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. Traditional pharmacological disruption of the ubiquitous microtubule network using, for instance, nocodazole can have devastating consequences for any cell. Reversibly photoswitchable microtubule inhibitors have the potential to overcome the limitations by enabling drug effects to be implemented in a spatiotemporally-controlled manner. One such family of drugs is the azobenzene-based photostatins (PSTs). These compounds are inactive in dark conditions, and upon illumination with UV light, they bind to the colchicine-binding site of &#946;-tubulin and block microtubule polymerization and dynamic turnover. Here, the application of PSTs in the 3-dimensional (3D) live preimplantation mouse embryo is set out to disrupt the microtubule network on a subcellular level. This protocol provides instructions for the experimental setup, as well as light activation and deactivation parameters for PSTs using live-cell confocal microscopy. This ensures reproducibility and enables others to apply this procedure to their research questions. Innovative photoswitches like PSTs may evolve as powerful tools to advance the understanding of the dynamic intracellular microtubule network and to non-invasively manipulate the cytoskeleton in real-time. Furthermore, PSTs may prove useful in other 3D structures such as organoids, blastoids, or embryos of other species.

Typical microtubule inhibitors, used widely in basic and applied research, have far-reaching effects on cells. Recently, photostatins emerged as a class of photoswitchable microtubule inhibitors, capable of instantaneous, reversible, spatiotemporally precise manipulation of microtubules. This step-by-step protocol details the application of photostatins in a 3D live preimplantation mouse embryo.

Manipulação subcelular espiostemporal do Citoesqueleto microtubulo no embrião do rato de pré-implantação vivo usando Fotostatinas

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. ...

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

Avaliação da Integridade do Ponto de Verificação da Montagem do Fuso em Oócitos de Rato

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

Identificando danos ao DNA em oócitos de camundongos com prisão de prófase

Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain arrested at the prophase of meiosis I. The quiescent state may last for years until the oocytes receive a stimulus to grow and obtain the competency to resume meiosis. This protracted state of arrest makes them extremely susceptible to accumulating DNA-damaging insults, which affect the genetic integrity of the female gametes and, therefore, the genetic integrity of the future embryo. 
Consequently, the development of an accurate method to detect DNA damage, which is the first step for the establishment of DNA damage response mechanisms, is of vital importance. This paper describes a common protocol to test the presence and progress of DNA damage in prophase-arrested oocytes during a period of 20 h. Specifically, we dissect mouse ovaries, retrieve the cumulus-oocyte complexes (COCs), remove the cumulus cells from the COCs, and culture the oocytes in &#924;2 medium containing 3-isobutyl-1-methylxanthine to maintain the state of arrest. Thereafter, the oocytes are treated with the cytotoxic, antineoplasmic drug, etoposide, to engender double-strand breaks (DSBs). 
By using immunofluorescence and confocal microscopy, we detect and quantify the levels of the core protein &#947;H2AX, which is the phosphorylated form of the histone H2AX. H2AX becomes phosphorylated at the sites of DSBs after DNA damage. The inability to restore DNA integrity following DNA damage in oocytes can lead to infertility, birth defects, and increased rates of spontaneous abortions. Therefore, the understanding of DNA damage response mechanisms and, at the same time, the establishment of an intact method for studying these mechanisms are essential for reproductive biology research.

Autor em destaque: Compreendendo a resposta a danos no DNA em oócitos de mamíferos e embriões pré-implantação 

Maintaining oocyte genome integrity is necessary to ensure the genetic fidelity in the resulting embryo. Here, we present an accurate protocol for detecting DNA double-strand breaks in mammalian female germ cells.

Detecção de quebras de fita dupla de DNA em ovócitos de camundongos

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

Avaliação do mouse microinjeção de oócitos, maturação e ploidia

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