Este trabajo se llevó a cabo en el laboratorio de Richard M. Schultz &#39;s. Los autores también desean agradecer a Michael Lampson para la conceptualización de la prueba de recuento de centrómero y el acceso a su microscopio confocal. Teresa Chiang y Duncan Francesca ayuda en la optimización de la prueba de recuento de centrómero. Paula Stein con el apoyo de HD022681 (a RMS) y Karen Schindler con el apoyo de HD055822.

1. Recogida de ovocitos de ratón <ol><li> Para maximizar el número de folículos antrales aislado de cada ratón, por vía intraperitoneal se inyectan ratones hembras sexualmente maduras (usamos 6 semanas de edad ratones CF-1 de Harlan) con 5 UI de gonadotropina sérica de yegua preñada (PMSG). </li><li> Preparar el medio de recolección (MEM / PVP) (3 ml / ratón) mediante la adición de milrinona a 2,5 M y calentarlo a 37 º C. La milrinona es un inhibidor de la fosfodiesterasa, que mantiene una detención meiótica de ovocitos se extraen de los folículos. Por otra parte, 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) (0,2 mM) o dibutiril-monofosfato cíclico de adenosina (dbcAMP) (100 mg / ml) se puede utilizar. Preparar el medio de cultivo mediante la adición de glutamina (1 mM) y milrinona (2,5 M) a 1 ml de CZB y deje que se equilibre en la incubadora por lo menos una hora. Establecer las microgotas de cada uno en una placa de Petri y la superposición con aceite mineral. El plato CZB se coloca en la incubadora, mientras que el plato MEM / PVP queda fuera de una diapositiva más cálido. Otra colección y medio de cultivo que están disponibles en el mercado (M2 y M16 de soportes especiales o Sigma) también se utilizan habitualmente. </li><li> Aproximadamente 48 horas después de la PMSG cebado, el sacrificio del ratón usando CO 2 sedación seguido por dislocación cervical, disección de los ovarios y los situará en un vidrio de reloj que contiene pre-calentado MEM / PVP + milrinona (MEM / PVP + M). </li><li> Con una jeringa de insulina de 1 ml, de anclaje de los ovarios al plato y la liberación de los folículos antrales por punción de ellos en varias ocasiones con el de calibre 27 (o de coser) agujas que se unen entre sí. </li><li> Mientras mira a través de un microscopio de disección, recoger cumulus-ovocito complejos usando una pipeta de boca de cristal. Es útil contar con un microscopio con mucho contraste. Como alternativa, el medio que contiene el tejido y las células pueden ser una pipeta a una tapa de una placa Petri de plástico. Sólo recogemos los folículos grandes antral y no menor pre-antral folículos o oocitos desnudos. Una vez recogidos, la transferencia de los complejos de una microgota de MEM / PVP + M que se encuentra en la diapositiva más caliente y con aceite. </li><li> Con una pipeta pequeña (poco más grande que el diámetro de los ovocitos), pipeta de arriba y abajo de los complejos de separar las células del cúmulo. La transferencia de los ovocitos denudados con una pipeta más grande en una microgota de CZB + milrinona (CZB + M) y el lugar en la incubadora. </li><li> Permita que los ovocitos para recuperar por lo menos durante 1 h en la incubadora antes de la manipulación. </li></ol> 2. Microinyección de ovocitos <ol><li> Hacer pipetas de inyección tirando de vidrio borosilicato tubo capilar en un extractor mecánico. Utilizamos un Flaming-Brown micropipeta extractor (Modelo P-97) con los siguientes valores: P = 500, Heat = 300, = 150 Tire, Vel = 100, Tiempo = 150. </li><li> Preparar la plataforma de microinyección mediante la colocación de una caída de 5 l de MEM / PVP + M lo más cerca posible a una caída de 0,5 l de inyección de material de elección (siRNA, por ejemplo, cRNA, oligonucleótidos morfolino, etc) en un portaobjetos de la cámara de 1-bien que tiene la cámara de los medios de comunicación eliminado. Cubrir con aceite mineral y el lugar en la platina del microscopio (Fig. 1). </li><li> Lugar de la inyección y pipetas de explotación en los titulares y la posición en la caída del MEM / PVP + M. A su vez en los tanques de nitrógeno que están conectados a la mesa de picoinjector y anti-vibración. Abrir la punta de la pipeta de inyección de él con cuidado golpeando contra la pipeta de sujeción, mientras que el llenado con el medio. Si la abertura es demasiado grande, el medio se mueven dentro y fuera de forma rápida y la aguja va a matar la célula. Pipetas con demasiado pequeño de una apertura con frecuencia se obstruyen fácilmente. </li><li> Transferencia de ovocitos (5-10) de la incubadora para el MEM / PVP + M caída en la plataforma. Antes de inyectar, la configuración de la picoinjector. Nosotros utilizamos los siguientes parámetros en nuestro picoinjector (PLI-100 Modelo de Harvard Apparatus): PBal = 2.5-3.5 psi, PInj = 7,8 psi, PClear = 10-12 psi, tiempo = 3s. Esto se traduce en un volumen de inyección de 5-10 pL. </li><li> Mientras presiona CLEAR, mover la aguja de la inyección a la caída de materiales y relleno. Volver a la caída de mediano plazo. </li><li> Use la pipeta de sujeción a la captura de un ovocito y alinear la aguja de inyección, óvulos y pipeta de sujeción a lo largo del eje-x. </li><li> A mayor aumento, el avance de la pipeta de inyección a través de los ovocitos con cuidado para evitar que el núcleo. Una vez que la membrana plasmática se perfora, pulse la inyección. Después de la inyección, retire la aguja. Liberación del ovocito y repetir. Una vez que todos los ovocitos se inyectan, a volver a la incubadora. Mantenga en CZB + M para la cantidad de tiempo deseado, y esta vez depende de la finalidad experimental (siRNA es decir, caída y morfolino (hasta 24 h), la sobreexpresión (03.12 h)). Tenga en cuenta que las incubaciones más de 24 horas pondrá en peligro la maduración meiótica. </li></ol> 3. Maduración de ovocitos <ol><li> Después de incubación, lavar los ovocitos a través de varias gotas de CZB (medio de maduración) y traslado a una microgota de medio de maduración con aceite y colocar en la incubadora. </li><li> Permita 16 horas para completar la maduración de t<html> o metafase de la meiosis II. </li></ol> 4. Ploidía análisis <ol><li> Prepare CZB + monastrol (100 M) y el lugar 750 l en el pozo de una placa de cultivo de órganos que tiene el agua en el anillo exterior. </li><li> Lavar los huevos a través de varias gotas de CZB + monastrol y transferirlos a la placa de cultivo de órganos. Lugar en la incubadora durante 1 h. </li><li> Fijar los huevos, transfiriéndolos a un vidrio de reloj que contiene 2% de paraformaldehído en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Transferencia a otro vidrio de reloj con solución de bloqueo. Este plato se puede almacenar a 4 ° C hasta su transformación. </li><li> Traslado a la solución de permeabilización (PBS + 0,3% BSA + TritonX-100 0,1% + 0,02% NaN 3) en un vidrio de reloj durante 15 minutos a temperatura ambiente. Enjuague a través de varios grandes volúmenes de solución de bloqueo (PBS + 0,3% BSA + 0,01 Tween-20 + 0,02% NaN 3). </li><li> El resto del procedimiento se realiza en la tapa de una placa de 96 pozos en una cámara húmeda a temperatura ambiente protegido de la luz. Las gotas (~ 25 l) se colocan dentro de las hendiduras circulares. Transferencia de huevos a la solución de bloqueo durante 15 minutos. </li><li> Los centrómeros etiqueta, los huevos de transferencia a una gota de solución de bloqueo que contienen CREST anti-suero a las 1:40. Incubar durante al menos 1 h. Lavar a 3 gotas de solución de bloqueo, incubación de 15 minutos cada uno. </li><li> La transferencia de los huevos de una gota de solución de bloqueo que contienen-o Cy5 Alexa-flúor-594-conjugado anti-IgG humana (1:200) y se incuba durante 1 hora. Repita la limpieza de los pasos que el anterior excepto para el último paso, incluyen Sytox Verde (1:5000) en la solución de bloqueo para detectar los cromosomas. Montaje en 5 l de Vectashield. Para evitar el aplastamiento de los huevos, poner 4 puntos poco de vaselina en las esquinas del lugar donde el cubreobjetos se. Coloque un cubreobjetos encima y sellar con esmalte de uñas. Conservar en una caja de diapositivas a 4 ° C hasta su procesamiento a través de microscopía confocal. </li><li> Mientras que las imágenes con un objetivo de 100X, la captura de 0,4 micras medidas en el plano Z y la imagen de toda la región del eje de la metafase. Conde centrómeros utilizando el software de imagen como Image J (NIH). </li></ol> 5. Los resultados representativos: La figura 2 es una proyección de Z-de un huevo euploides. En la metafase de la MII, los huevos euploides ratón contienen 20 pares de cromosomas y por lo tanto tiene 40 centrómeros. De vez en cuando los cromosomas no difundir a pesar del tratamiento monastrol. Esta situación hace que sea difícil contar con fiabilidad los centrómeros y por lo tanto, no incluyen los huevos en nuestros análisis. En ocasiones, puede ser difícil determinar si un CREST-inmunorreactiva &quot;spot&quot; es de 1 o 2 centrómeros. El uso de programas tales como J de la imagen es útil porque se puede analizar cada sección Z, mientras que observando cuidadosamente la orientación de los cromosomas, el número de secciones en las que se detecta un &quot;punto&quot; y la intensidad de los píxeles de la &quot;spots&quot; tiene. Dependiendo de donde el huso meiótico se posiciona en relación con el cuerpo polar, las regiones de ADN se pueden superponer y estas muestras no deben ser incluidos en el análisis. No manipulado, en vivo huevos ovularon de ratones jóvenes reproductivamente tienen bajas tasas de aneuploidía (~ 1.2%). Sin embargo, por razones que no entiende, la microinyección y en los procedimientos de maduración in vitro puede aumentar este índice al alza de 10%. Por lo tanto, es fundamental que los ovocitos control inyectados están incluidos en cualquier estudio de microinyección. <img src="/files/ftp_upload/2851/2851fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Plato microinyección establecido. Una diapositiva de cámara con 5 gotas de l MEM / PVP + M justo por encima de las gotas 0.5μl de solución inyectable. Cubrir con aceite mineral. En este ejemplo hay 3 gotas de tres soluciones diferentes de inyección y la tapa está sentado en el escenario de un microscopio. A la izquierda está la aguja de microinyección y la derecha es la pipeta de sujeción. Tenga en cuenta que no es un reflejo de los titulares de la aguja. <img src="/files/ftp_upload/2851/2851fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Los resultados de ploidía. A a la Z-proyección de un huevo euploides metafase II. ADN es de color verde y cinetocoros son de color rojo. Las flechas apuntan a dos armas distintas de cromátidas que indica que cinetocoros (# 17 y # 18) se superponen. Huevos euploides ratón contienen 20 pares cinetocoro (40 en total &quot;spots&quot;). Un huevo aneuploides contener cualquier variación en este número. Si este procedimiento se llevó a cabo en metafase MI, habría 40 pares cinetocoro (80 total de &quot;puntos&quot;). <img src="/files/ftp_upload/2851/2851table1.jpg" alt="Tabla 1"/> Tabla 1. Receta para el medio de recolección y la microinyección (MEM / PVP + M). Todos los materiales son embrión de la cultura y el grado de Sigma-Aldrich. Filtro de esterilización a través de filtros de 0.22μm PVDF (usamos Stericups miliporo) y almacenar a 4 ° C. iles/ftp_upload/2851/2851table2.jpg &quot;alt =&quot; Tabla 2 &quot;/&gt; Tabla 2. Receta para el medio CZB. Todos los materiales son embrión de la cultura y el grado de Sigma-Aldrich. Filtro de esterilización a través de filtros de 0.22μm PVDF (usamos Stericups miliporo) y almacenar a 4 ° C.

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Microinyección de ovocitos es un poderoso método para estudiar los mecanismos que regulan la maduración meiótica 10,11, 12, 13. Este método ofrece una forma económica de probar las hipótesis antes de hacer una gran inversión en el desarrollo de modelos de ratones transgénicos y de destino. Recolección de los ovocitos y las técnicas de microinyección requieren más tiempo para dominar a los procedimientos típicos de la biología celular. Obstáculos específicos con la colección a menudo incluyen el control de la pipeta de la boca, tirando de la pipeta de vidrio de tamaño adecuado para la recolección y extracción de las células somáticas y el aumento de la velocidad de recogida para reducir al mínimo el tiempo en que los ovocitos se encuentran fuera de la incubadora. Se recomienda la práctica muchas veces antes de hacer experimentos. La transferencia de ovocitos entre microgotas, manteniendo el mismo número de células es una buena manera de sentirse cómodo con este método. La muerte celular ocurre comúnmente mientras aprenden microinyección. Esto puede ocurrir por varias razones, incluyendo la inyección de demasiado grande de un volumen de material (es decir, la abertura de la aguja de la inyección es demasiado grande), alcanzando el núcleo con la aguja de inyección, la perforación del otro lado de los ovocitos o que el material inyectado es tóxico para el ovocito. Practicar con la inyección de buffer en oocitos hasta que su tasa de supervivencia es de al menos el 50% es la clave para dominar esta técnica. Si no maduran los ovocitos es probable que la milrinona no se diluye bastante. Se recomienda enjuagar los ovocitos a través de muchas gotas grandes de milrinona sin CZB antes de la maduración. La microinyección siguiente análisis de ploidía es uno de los muchos ensayos para evaluar la maduración meiótica. Otros análisis de rutina que utilizamos en el laboratorio incluyen el control de la cinética en la que el progreso a través de los ovocitos de la meiosis, la inmunofluorescencia para analizar la formación del huso y la alineación de los cromosomas y la activación del huevo o la fertilización in vitro para evaluar las consecuencias del desarrollo de la manipulación de los ovocitos 14,15, 16, 17.

Tabla de reactivos específicos: <table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Milrinona </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M4659 </td><td> Resuspender en DMSO a 2,5 mm </td></tr><tr><td> De aceite mineral </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5310 </td><td> Sólo el uso de embriones a prueba, esterilizada por filtración </td></tr><tr><td> CREST autoserum </td><td> Immunovision </td><td> HCT-0100 </td><td></td></tr><tr><td> Sytox Verde </td><td> Invitrogen </td><td> 57020 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humano Alexa 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A-11014 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-100 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehído </td><td> Polysciences </td><td> 577773 </td><td></td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3294 </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td> Monastrol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M8515 </td><td> Resuspender en DMSO a 100 mM </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 274348 </td><td></td></tr><tr><td> TritonX-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X-100 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla de equipos específicos: <table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del Equipo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Boquilla </td><td> Biodiseno </td><td> MP-001-Y </td><td></td></tr><tr><td> Vidrio de reloj </td><td> Microscopía electrónica de Ciencias </td><td> 70543-30 </td><td></td></tr><tr><td> Jeringa </td><td> BD </td><td> 309623 </td><td> 1 ml, 27 G 1 / 2 </td></tr><tr><td> 60 mm Petri </td><td> Halcón </td><td> 351007 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetas Pasteur de vidrio </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-200 </td><td></td></tr><tr><td> Lado más caliente </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Cualquier modelo estándar </td></tr><tr><td> Disección microscopio </td><td></td><td></td><td> Cualquier modelo estándar </td></tr><tr><td> Cámara de diapositivas </td><td> Nunc </td><td> 177372 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos capilares </td><td> Drummond </td><td> 1-000-0500 </td><td> Microcaps </td></tr><tr><td> Pipeta Extractor </td><td> Flaming-Brown micropipeta extractor </td><td></td><td> Modelo P-97 </td></tr><tr><td> Microscopio invertido </td><td> Nikon </td><td></td><td> Cualquier modelo estándar </td></tr><tr><td> Micromanipuladores </td><td> Eppendorf </td><td></td><td> Cualquier modelo estándar </td></tr><tr><td> Picoinjector </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Modelo PLI-100 </td><td> Cualquier modelo estándar </td></tr><tr><td> CO 2 tanques </td><td></td><td></td><td> De la incubadora </td></tr><tr><td> N2 tanque </td><td></td><td></td><td> Para la tabla y el inyector </td></tr><tr><td> Anti-vibración de mesa </td><td> Producción técnica </td><td></td><td> Cualquier modelo estándar </td></tr><tr><td> Incubadora </td><td></td><td></td><td> Cualquier modelo estándar </td></tr><tr><td> Pipetas de la celebración de </td><td> Eppendorf </td><td> 930001015 </td><td> Vacutip </td></tr><tr><td> Microscopio confocal </td><td> Leica </td><td></td><td> Cualquier modelo estándar </td></tr><tr><td> Herramientas de disección </td><td> Herramientas de Bellas ciencia </td><td></td><td> Cualquier modelo estándar </td></tr><tr><td> Cámara húmeda </td><td></td><td></td><td> Usamos tupperware </td></tr><tr><td> Tapa de placa de 96 pocillos </td><td> Nunc </td><td> 263339 </td><td></td></tr><tr><td> Portaobjetos de microscopio </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544-3 </td><td></td></tr><tr><td> Cubreobjetos </td><td> Thomas científica </td><td> 6663-F10 </td><td> De espesor puede variar para los microscopios en particular </td></tr><tr><td> Centro de órganos y placa de cultivo </td><td> Fisher Scientific </td><td> 353037 </td><td> 60 X 15 mm </td></tr></tbody></table>

mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment

Errores en la segregación cromosómica llevar a las células aneuploides. En las células somáticas, la aneuploidía se asocia con el cáncer, pero en los gametos, la aneuploidía lleva a la infertilidad, abortos involuntarios o trastornos del desarrollo como el síndrome de Down. Gametos haploides forma a través de las especies-programas de desarrollo específicos que se acoplan a la meiosis. La primera división meiótica (MI) es único a la meiosis, porque las cromátidas hermanas permanecen unidas, mientras que los cromosomas homólogos se separan. Por razones que no se entiende, esta división reduccional es propenso a errores y es más común la fuente de aneuploidía que los errores en la meiosis II (MII), o que los errores en la meiosis masculina 1,2. En los mamíferos, la detención ovocitos en profase de la MI con una vesícula grande, intacto germinal (GV; núcleo) y sólo reanudar la meiosis cuando se reciben señales de la ovulación. Una vez que se reanuda la meiosis, MI ovocitos completo y someterse a una división celular asimétrica, a arrestar de nuevo en la metafase de MII. Los huevos no se completará hasta MII son fertilizados por el esperma. Los ovocitos también pueden someterse a la maduración meiótica utilizando establecido en las condiciones de cultivo in vitro 3. Ya que la generación de mutantes de ratones transgénicos y de genes específicos-es costoso y puede tomar mucho tiempo, la manipulación de los gametos femeninos in vitro es una estrategia más económica y de ahorro de tiempo. Aquí se describen los métodos para aislar la profase detenido de los ovocitos de ratón y de microinyección. Cualquier material de elección puede ser introducido en el óvulo, sino porque meiotically-competente ovocitos son transcriptionally silencio cRNA 4,5, y no el ADN, se debe inyectar para los estudios de la expresión ectópica. Para evaluar la ploidía, describimos nuestras condiciones para la maduración in vitro de ovocitos MII a los huevos. Históricamente, el cromosoma de propagación se utilizan técnicas para contar el número de cromosomas 6. Este método es técnicamente difícil y se limita a la identificación de hyperploidies. Aquí se describe un método para determinar la hipo y la hyperploidies con huevos intactos 7-8. Este método utiliza monastrol, un inhibidor de la kinesina-5, que se derrumba el huso bipolar en un huso monopolar 9 cromosomas separando así como que cinetocoros individuales pueden ser fácilmente detectados y contados mediante el uso de un suero anti-CREST autoinmunes. Debido a que este método se lleva a cabo en huevos intactos, los cromosomas no se pierden debido a errores del operador.

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Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Los ovocitos son propensos a la aneuploidía debido a errores en la segregación cromosómica durante la maduración meiótica. Huevos aneuploides puede causar infertilidad, abortos involuntarios o trastornos del desarrollo como el síndrome de Down. Aquí se describen los métodos para introducir los materiales de elección en los ovocitos y los métodos para estudiar la maduración meiótica y evaluar la ploidía.

La microinyección de ovocitos de ratón, Maduración y Evaluación de ploidía

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

mouse-oocyte-microinjection-maturation-and-ploidy-assessment

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

29.7K vistas.  University of Pennsylvania. Los ovocitos son propensos a la aneuploidía debido a errores en la segregación cromosómica durante la maduración meiótica. Huevos aneuploides puede causar infertilidad, abortos involuntarios o trastornos del desarrollo como el síndrome de Down. Aquí se describen los métodos para introducir los materiales de elección en los ovocitos y los métodos para estudiar la maduración meiótica y evaluar la ploidía.

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Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

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Microinyección de A. aegypti embriones para obtener los mosquitos transgénicos

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Investigación

Biología

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinyección de oocitos de Xenopus laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

En vivo de imágenes y tratamientos terapéuticos en un modelo de ratón ortotópico de cáncer de ovario

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for regulating gene transcription1. DNA methylation is an epigenetic modification that acts predominantly as a repressive mark. Through the covalent addition of a methyl group onto cytosines in CpG dinucleotides, it can recruit additional repressive proteins and histone modifications to initiate processes involved in condensing chromatin and silencing genes2. DNA methylation is essential for normal development as it plays a critical role in developmental programming, cell differentiation, repression of retroviral elements, X-chromosome inactivation and genomic imprinting.
One of the most powerful methods for DNA methylation analysis is bisulfite mutagenesis. Sodium bisulfite is a DNA mutagen that deaminates cytosines into uracils. Following PCR amplification and sequencing, these conversion events are detected as thymines. Methylated cytosines are protected from deamination and thus remain as cytosines, enabling identification of DNA methylation at the individual nucleotide level3. Development of the bisulfite mutagenesis assay has advanced from those originally reported4-6 towards ones that are more sensitive and reproducible7. One key advancement was embedding smaller amounts of DNA in an agarose bead, thereby protecting DNA from the harsh bisulfite treatment8. This enabled methylation analysis to be performed on pools of oocytes and blastocyst-stage embryos9. The most sophisticated bisulfite mutagenesis protocol to date is for individual blastocyst-stage embryos10. However, since blastocysts have on average 64 cells (containing 120-720 pg of genomic DNA), this method is not efficacious for methylation studies on individual oocytes or cleavage-stage embryos.
Taking clues from agarose embedding of minute DNA amounts including oocytes11, here we present a method whereby oocytes are directly embedded in an agarose and lysis solution bead immediately following retrieval and removal of the zona pellucida from the oocyte. This enables us to bypass the two main challenges of single oocyte bisulfite mutagenesis: protecting a minute amount of DNA from degradation, and subsequent loss during the numerous protocol steps. Importantly, as data are obtained from single oocytes, the issue of PCR bias within pools is eliminated. Furthermore, inadvertent cumulus cell contamination is detectable by this method since any sample with more than one methylation pattern may be excluded from analysis12. This protocol provides an improved method for successful and reproducible analyses of DNA methylation at the single-cell level and is ideally suited for individual oocytes as well as cleavage-stage embryos.

Bisulfite mutagenesis is the gold standard for analyzing DNA methylation. Our modified protocol allows for DNA methylation analysis at the single-cell level and was specifically designed for individual oocytes. It can also be used for cleavage-stage embryos.

Único ovocito Mutagénesis bisulfito

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid family, type 4) is widely expressed in vertebrate tissues and is activated by several stimuli, including by mechanical forces. Certain TRPV4 mutations cause complex hereditary bone or neuronal pathologies in human. Wild-type or mutant TRPV4 transgenes are commonly expressed in cultured mammalian cells and examined by Fura-2 fluorometry and by electrodes. In terms of the mechanism of mechanosensitivity and the molecular bases of the diseases, the current literature is confusing and controversial. To complement existing methods, we describe two additional methods to examine the molecular properties of TRPV4. (1) Rat TRPV4 and an aequorin transgene are transformed into budding yeast. A hypo-osmtic shock of the transformant population yields a luminometric signal due to the combination of aequorin with Ca2+, released through the TRPV4 channel. Here TRPV4 is isolated from its usual mammalian partner proteins and reveals its own mechanosensitivity. (2) cRNA of TRPV4 is injected into Xenopus oocytes. After a suitable period of incubation, the macroscopic TRPV4 current is examined with a two-electrode voltage clamp. The current rise upon removal of inert osmoticum from the oocyte bath is indicative of mechanosensitivity. The microAmpere (10-6 to 10-4 A) currents from oocytes are much larger than the subnano- to nanoAmpere (10-10 to 10-9 A) currents from cultured cells, yielding clearer quantifications and more confident assessments. Microscopic currents reflecting the activities of individual channel proteins can also be directly registered under a patch clamp, in on-cell or excised mode. The same oocyte provides multiple patch samples, allowing better data replication. Suctions applied to the patches can activate TRPV4 to directly assess mechanosensitivity. These methods should also be useful in the study of other types of TRP channels.

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

To complement commonly used methods to study TRPV4&#8217;s, two methods are described: Its mechanosensitivity can be studied by Ca2+-aequorin luminometry in transgenic yeast upon hypo-osmotic challenge. It can also be examined in TRPV4-RNA injected Xenopus oocytes by whole-cell two-electrode voltage clamp or patch clamp in on-cell or excised mode.

Luminométricos levadura y<em&gt; Xenopus</em&gt; ovocitos electrofisiológicos Exámenes del mecanosensibilidad Molecular de TRPV4

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid family, type 4) is widely expressed in vertebrate tissues and is activated by several stimuli, including ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

En Vivo microinyección y electroporación del mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Generación de transgénicos<em&gt; Hydra</em&gt; Por microinyección de embriones

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

Evaluación del huso meiótico en ovocitos de ratón por silenciamiento siRNA mediada

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotoxina Microinyección en pez cebra para modelar la lesión renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

La microinyección de ovocitos de ratón, Maduración y Evaluación de ploidía

Resumen

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