Yazarlar, Balboula laboratuvarının tüm üyelerine değerli yardımları ve tartışmaları için teşekkür eder. Yazarlar, Melina Schuh'a mCherry-Cep192 yapısını nazikçe paylaştığı için teşekkür ediyor. Bu çalışma AZB'ye R35GM142537 (NIGMS, NIH) ile desteklenmiştir.

Burada açıklanan tüm yöntemler Missouri Üniversitesi tarafından onaylanmıştır (Hayvan Bakımı Kalite Güvencesi Referans Numarası 9695). Bu çalışmada 6-8 haftalık Cep192-eGFP muhabiri dişi fareler kullanılmıştır. Cep192-eGFP muhabir fareleri üretmek için, EGFP muhabir genini CF-1 fare genomuna entegre etmek için CRISPR / Cas9 aracılı homoloji yönelimli onarım kullanıldı. EGFP muhabiri, Cep192'nin (MTOC'lerin ayrılmaz bir bileşeni) C-ucunda kaynaştırıldı15. Fare kolonisini korumak için, homozigot Cep192-eGfp muhabir fareleri kullanıldı. Tüm hayvanlar, 21 ° C ve% 55 nemde, 12 saatlik açık / karanlık döngü ve yiyecek ve suya ad libitum erişimi ile kafeslerde (dört hayvana / kafese kadar) tutuldu.
1. Fare oosit koleksiyonu
<ol><li>Kültür ortamını hazırlayın (Chatot, Ziomek ve Bavister, CZB19, Malzeme Tablosuna bakın) ve gece boyunca 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübe edin. NOT: CZB ortamı 1 ay boyunca 4 °C'de saklanabilir (ortam kompozisyonu için Ek Dosya 1'e bakınız).</li>
	<li>CZB ortamını glutamin (1 mM) ve milrinon (2,5 mM) (CZB + M) ile destekleyin (bakınız Malzeme Tablosu) ve inkübatöre yerleştirin. NOT: Milrinon, faz I'de tutuklanan oositleri koruyan ve mayotik yeniden başlama20'yi önleyen bir fosfodiesteraz inhibitörüdür.</li>
	<li>3 mg/mL polivinilpirolidon (PVP), 25 mM HEPES (pH 7.3) (Ek Dosya 1) ve milrinon (2,5 mM) (MEM/PVP + M) içeren toplama ortamını (bikarbonatsız minimal esansiyel ortam, MEM) hazırlayın.</li>
	<li>Toplama ve kültür yemeklerini hazırlayın, sırasıyla 60 mm ve 35 mm Petri kaplarında dört mikrodamla (100 μL) toplama ortamı (MEM / PVP + M) ve iki mikrodamla (100 μL) kültür (CZB + M) ortamı yapın ve bunları mineral yağ ile örtün (bkz. Toplama kabını kaydırakta daha sıcak tutun ve kültür kabını inkübatöre 37 ° C ve% 5 CO2'de koyun.</li>
	<li>İntraperitoneal olarak 5 IU hamile kısrak serum gonadotropini (PMSG, Materyaller Tablosuna bakınız) cinsel olarak olgun (6-8 haftalık) Cep192-eGFP muhabiri dişi farelere oosit toplanmasından 44-48 saat önce enjekte edin.</li>
	<li>Fareleri servikal çıkık ile kurban edin, yumurtalıkları tanımlayın ve çıkarın21 ve bunları 37 ° C'de önceden ısıtılmış toplama ortamı (MEM / PVP + M) içeren bir saat camına aktarın.</li>
	<li>Saat camının dibine 1 mL'lik bir şırıngaya dokunarak ve yumurtaları ortama bırakmak için bir araya getirilmiş dikiş iğnelerini kullanarak birkaç kez (yumurtalık başına ~ 40 kez) delerek yumurtalığı sabitleyin.</li>
	<li>Plastik bir transfer pipeti kullanarak, kümülüs-oosit komplekslerini (COC'ler) içeren tüm ortamları adım 1.7'den boş bir 100 mm plastik Petri kabına aktarın.</li>
	<li>Bir stereomikroskop altında, COC'leri bir Pasteur cam pipet kullanarak toplayın ve bunları MEM / PVP + M içeren toplama kabına aktarın.</li>
	<li>Dar bir Pasteur cam pipet (yaklaşık 100 μm çapında) kullanarak, oositleri nazik tekrarlayan pipetleme ile mekanik olarak denüde edin, ardından CZB + M kültür kabına aktarılmadan önce dört mikrodamla (100 μL) MEM / PVP + M (toplama kabı) içinde aktarın ve yıkayın.</li>
	<li>İnkar edilen oositleri 37 ° C'de 1 saat boyunca havada CO2'nin % 5'i ile inkübe edin.</li>
</ol>2. Yumurta mikroenjeksiyonu
<ol><li>100 mm'lik plastik Petri kabı kapağına 250 μL'lik bir MEM/PVP + M damlası yerleştirin ve mineral yağ ile örtün. NOT: Petri çanak kapağı, mikromanipülatörün ayarlanması için daha fazla alan sağlayan daha düşük bir kenara sahiptir.</li>
	<li>Mikroenjeksiyon sistemini açın ( Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>Mikroenjeksiyon kabını mikroskobun ısınma aşamasına (37 °C) yerleştirin.</li>
	<li>Enjeksiyon iğnesini mikroyükleyici pipet uçlarını kullanarak 0,5 μL mCh-Cep192cRNA ile yükleyin ( bkz. Malzeme Tablosu) ve enjeksiyon iğnesini mikromanipülatöre sabitleyin.</li>
	<li>Reddedilen oositleri (adım 1.11) 250 μL mikrodamlaya (adım 2.1) aktarın.</li>
	<li>20x veya 40x objektif lens altında, enjeksiyon ve tutma iğnelerinin konumunu ve odağını oosit pozisyonuna göre ayarlayın (Şekil 1).</li>
	<li>Mikroenjeksiyon ünitesini kurun ve 5-10 pl mCh-Cep192 cRNA enjekte edebilmek için enjeksiyon basıncını (pi), kompanzasyon basıncını (p c) ve enjeksiyon süresini (ti) ayarlayın (MTOC'leri eksojen olarak etiketlemek için).</li>
	<li>Çekirdeğe dokunmadan yumurtaları dikkatlice enjekte edin.</li>
	<li>Tüm yumurtalar enjekte edildikten sonra, üç mikrodamla CZB + M içinde yıkayın, kültür kabına (CZB + M) aktarın ve mCh-Cep192 ekspresyonuna izin vermek için 37 ° C'de 3 saat boyunca inkübe edin.</li>
</ol>3. Yumurta olgunlaşması
<ol><li>Olgunlaşma ortamını, en az 3 saat boyunca 37 ° C'de havada% 5 CO2 bulunan bir inkübatörde önceden dengelenmiş CZB ortamına glutamin (1 mM) ekleyerek hazırlayın.</li>
	<li>35 mm'lik bir Petri kabında olgunlaşma ortamının iki mikrodamlasını (100 μL) yapın ve bunları mineral yağ (olgunlaşma kabı) ile örtün.</li>
	<li>Milrinonu tamamen çıkarmak ve mayotik yeniden başlamaya izin vermek için faz I ile tutuklanmış oositleri 100 μL milrinon içermeyen CZB mikrodamlalarında en az üç kez yıkayın.</li>
	<li>Yumurtaları olgunlaşma kabına aktarın ve 37 ° C'de havada% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde 5 saat (prometafaz I aşaması) inkübe edin.</li>
</ol>4. Ablasyon ve görüntüleme için oosit hazırlığı
<ol><li>Prometafaz I oositlerini (adım 3.4), mineral yağ ile kaplı 100 μL olgunlaşma ortamı (adım 3.1) içeren cam tabanlı bir kültür kabına aktarın.</li>
</ol>5. Ablasyon için mikroskop hazırlığı
<ol><li>Ablasyondan en az 30 dakika önce, sahne inkübatörü için sıcaklık kontrol cihazını açın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 37 ° C'ye ayarlayın.</li>
	<li>CO2 kontrol cihazını açın ve %5 CO2 olarak ayarlayın.</li>
	<li>40x yağ daldırma apokromatik hedefi seçin ve daldırma yağından küçük bir damla uygulayın.</li>
	<li>Cam tabanlı kültür kabını oositlerle birlikte bir sahne üstü inkübatöre monte edin ve inkübatörü bir gaz kapağıyla örtün.</li>
	<li>Görüntü alma yazılımında ( bkz. Malzeme Tablosu), birden fazla aşama konumunun kaydedilmesini sağlayan bir seçenek belirleyin (örneğin; "İşareti tanımla ve deneyi bul"). İletilen ışık parlak alan aydınlatmasını kullanarak, bireysel oositleri ortalayın ve konumlarını kaydedin.</li>
	<li>Görüntü alma yazılımında, XYZ tarama modunu seçin, görüntü formatını 256 x 256 piksel olarak ayarlayın, yakınlaştırma faktörünü 2,5x - 3,0x olarak ayarlayın ve 600 Hz'lik bir tarama frekansı seçin. Bu, yaklaşık 1,6 μs'lik bir piksel bekleme süresine karşılık gelir.</li>
	<li>Lazer gücünün yaklaşık% 10'unda (örnek düzeyde 4.0 μW'a karşılık gelir) 488 nm uyarma lazer çizgisi ayarlayın ( bkz. Malzeme Tablosu) ve MTOC'lerden GFP sinyalini gözlemlemek için 500-550 nm'lik bir spektral bant genişliği kullanın. mCherry etiketli Cep192'den floresanın eşzamanlı gözlemi için, lazer gücünün yaklaşık% 8'inde (örnek seviyesinde 10.7 μW'ye karşılık gelir) 585 nm'lik bir uyarma lazer çizgisi ayarlayın ve 595-645 nm'lik spektral bant genişliğine ayarlanmış başka bir dedektör kullanın. NOT: Oosit sınırlarını eşzamanlı olarak tespit etmek için konfokal mikroskobun iletilen ışık dedektörünü (TLD) kullanmak yararlıdır.</li>
	<li>Canlı tarama modunu ve z-drive'ın manuel kontrolünü kullanarak, oositi MTOC'ler için tarayın.</li>
	<li>Bir mcMTOC algılandıktan sonra, etrafına kare bir ilgi alanı (ROI) çizin.</li>
</ol>6. mcMTOC'lerin ablasyonu
<ol><li>Bir femtosaniye lazeri 740 nm dalga boyuna ayarlayın. NOT: Lazer dalga boyu mikroskop ve lazer koşullarına göre değiştirilebilir.</li>
	<li>Lazer gücünü, numune düzleminde 60-70 mW güce karşılık gelen% 70-80'e ayarlamak için çoklu foton mikroskobunun elektro-optik modülatörünü kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız). NOT: Lazer bir femtosaniye darbe kompansatörü ile donatılmışsa, grup gecikme dağılımını (GDD) düzeltmek için kullanın. GDD düzeltmesi, verimli mcMTOC ablasyonu için gereken lazer gücü miktarını azaltır ve oositte fotohasarı en aza indirir. GDD kontrolü genellikle ticari çoklu foton mikroskoplarının görüntü yakalama yazılımı ile entegre edilir.</li>
	<li>Adım 5.6'dakiyle aynı görüntü formatını, yakınlaştırma faktörünü ve tarama sıklığını kullanın. Çizgi ve kare ortalaması parametrelerini 1 olarak ayarlayın.</li>
	<li>Seçilen ROI'nin tek bir lazer taramasını yaparak mcMTOC'nin ablasyonunu gerçekleştirmek için yazılımdaki Tara düğmesine tıklayın.</li>
	<li>Çoklu foton lazer pozlamasından önce ve sonra çekilen GFP etiketli yapıların görüntülerini karşılaştırarak ablasyonun sonuçlarını gözden geçirmek için adım 5.7'deki kanal ayarlarını kullanın. Ablasyon başarılı olursa, hedeflenen mcMTOC'deki GFP floresansının yoğunluğu arka planda gözlenen seviyelere düşer.</li>
	<li>GFP etiketleme yapısının bazı parçaları kalırsa, mcMTOC'nin çeşitli z düzlemlerine odaklanarak adım 6.4'ü bir veya daha fazla kez tekrarlayın.</li>
	<li>Ablasyon verimliliğini mcMTOC ile ilişkili mCherry sinyallerinin (mCh-Cep192) tamamen kaybolmasıyla doğrulamak için adım 5.7'deki kanal ayarlarını kullanın.</li>
	<li>Bir yumurtanın tüm MTOC'leri (çeşitli odak düzlemlerinde) ablatlanana kadar adım 5.8 ila adım 6.7'yi tekrarlayın. NOT: Bu protokol, çoklu foton lazer maruziyetini takiben mcMTOC tükenmesini doğrulamak ve GFP floresan kaybının GFP fotobeyazlatmadan kaynaklanma olasılığını dışlamak için bir strateji olarak mCh-Cep192 mikroenjeksiyonunu kullanır. Bununla birlikte, bu probun mikroenjeksiyonu isteğe bağlıdır ve ablasyon prosedürü için gerekli değildir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bennabi, I., Terret, M. E., Verlhac, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+spindle+assembly+and+chromosome+segregation+in+oocytes.">Meiotic spindle assembly and chromosome segregation in oocytes.</a> Journal of Cell Biology. 215 (5), 611-619 (2016).</li><li>Hashimoto, N., Kishimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+meiotic+metaphase+by+a+cytoplasmic+maturation-promoting+factor+during+mouse+oocyte+maturation.">Regulation of meiotic metaphase by a cytoplasmic maturation-promoting factor during mouse oocyte maturation.</a> Development Biology. 126 (2), 242-252 (1988).</li><li>Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+kinetochore+tracking+reveals+error-prone+homologous+chromosome+biorientation+in+mammalian+oocytes.">Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes.</a> Cell. 146 (4), 568-581 (2011).</li><li>Azoury, J., Verlhac, M. H., Dumont, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+filaments:+Key+players+in+the+control+of+asymmetric+divisions+in+mouse+oocytes.">Actin filaments: Key players in the control of asymmetric divisions in mouse oocytes.</a> Biology of the Cell. 101 (2), 69-76 (2009).</li><li>Li, H., Guo, F., Rubinstein, B., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-driven+chromosomal+motility+leads+to+symmetry+breaking+in+mammalian+meiotic+oocytes.">Actin-driven chromosomal motility leads to symmetry breaking in mammalian meiotic oocytes.</a> Nature Cell Biology. 10 (11), 1301-1308 (2008).</li><li>Schuh, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+for+asymmetric+spindle+positioning+in+mouse+oocytes.">A new model for asymmetric spindle positioning in mouse oocytes.</a> Current Biology. 18 (24), 1986-1992 (2008).</li><li>Pimenta-Marques, A., Bettencourt-Dias, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericentriolar+material.">Pericentriolar material.</a> Current Biology. 30 (12), 687-689 (2020).</li><li>Hinchcliffe, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosome+and+bipolar+spindle+assembly:+Does+one+have+anything+to+do+with+the+other.">The centrosome and bipolar spindle assembly: Does one have anything to do with the other.</a> Cell Cycle. 10 (22), 3841-3848 (2011).</li><li>Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+centrioles+in+the+first+and+second+meiotic+spindles+of+mouse+oocytes.">Absence of centrioles in the first and second meiotic spindles of mouse oocytes.</a> Journal of Cell Science. 11 (2), 521-541 (1972).</li><li>Schuh, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+MTOCs+replaces+centrosome+function+during+acentrosomal+spindle+assembly+in+live+mouse+oocytes.">Self-organization of MTOCs replaces centrosome function during acentrosomal spindle assembly in live mouse oocytes.</a> Cell. 130 (3), 484-498 (2007).</li><li>Clift, D., Schuh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-step+MTOC+fragmentation+mechanism+facilitates+bipolar+spindle+assembly+in+mouse+oocytes.">A three-step MTOC fragmentation mechanism facilitates bipolar spindle assembly in mouse oocytes.</a> Nature Communications. 6, 7217 (2015).</li><li>Luksza, M., Queguigner, I., Verlhac, M. H., Brunet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+MTOCs+upon+centriole+loss+during+mouse+oogenesis.">Rebuilding MTOCs upon centriole loss during mouse oogenesis.</a> Developmental Biology. 382 (1), 48-56 (2013).</li><li>Balboula, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haspin+kinase+regulates+microtubule-organizing+center+clustering+and+stability+through+Aurora+kinase+C+in+mouse+oocytes.">Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes.</a> Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).</li><li>Breuer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HURP+permits+MTOC+sorting+for+robust+meiotic+spindle+bipolarity,+similar+to+extra+centrosome+clustering+in+cancer+cells.">HURP permits MTOC sorting for robust meiotic spindle bipolarity, similar to extra centrosome clustering in cancer cells.</a> Journal of Cell Biology. 191 (7), 1251-1260 (2010).</li><li>Londo&#241;o-V&#225;squez, D., Rodriguez-Lukey, K., Behura, S. K., Balboula, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+organizing+centers+regulate+spindle+positioning+in+mouse+oocytes.">Microtubule organizing centers regulate spindle positioning in mouse oocytes.</a> Developmental Cell. 57 (2), 197-211 (2022).</li><li>Konig, K., Riemann, I., Fischer, P., Halbhuber, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+nanosurgery+with+near+infrared+femtosecond+laser+pulses.">Intracellular nanosurgery with near infrared femtosecond laser pulses.</a> Cellular and Molecular Biology. 45 (2), 195-201 (1999).</li><li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation.">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).</li><li>Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+of+the+microtubule+cytoskeleton:+Setting+up+and+working+with+an+ablation+system.">Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: Setting up and working with an ablation system.</a> Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).</li><li>Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+culture+medium+supports+development+of+random-bred+1-cell+mouse+embryos+in+vitro.">An improved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 86 (2), 679-688 (1989).</li><li>Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+maturation+involves+compartmentalization+and+opposing+changes+of+cAMP+levels+in+follicular+somatic+and+germ+cells:+Studies+using+selective+phosphodiesterase+inhibitors.">Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: Studies using selective phosphodiesterase inhibitors.</a> Developmental Biology. 178 (2), 393-402 (1996).</li><li>Greaney, J., Subramanian, G. N., Ye, Y., Homer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+culture+of+mouse+oocytes.">Isolation and in vitro culture of mouse oocytes.</a> Bio Protocol. 11 (15), 4104 (2021).</li><li>Khodjakov, A., Cole, R. W., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synergy+of+technologies:+Combining+laser+microsurgery+with+green+fluorescent+protein+tagging.">A synergy of technologies: Combining laser microsurgery with green fluorescent protein tagging.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 38 (4), 311-317 (1997).</li><li>Pavin, N., Tolic, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+the+mitotic+spindle.">Mechanobiology of the mitotic spindle.</a> Developmental Cell. 56 (2), 192-201 (2021).</li><li>Khodjakov, A., Cole, R. W., Oakley, B. R., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome-independent+mitotic+spindle+formation+in+vertebrates.">Centrosome-independent mitotic spindle formation in vertebrates.</a> Current Biology. 10 (2), 59-67 (2000).</li><li>Aist, J. R., Liang, H., Berns, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astral+and+spindle+forces+in+PtK2+cells+during+anaphase+B:+a+laser+microbeam+study.">Astral and spindle forces in PtK2 cells during anaphase B: a laser microbeam study.</a> Journal of Cell Science. 104, 1207-1216 (1993).</li><li>Bennabi, I., Manil-Segalen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Ablation+of+microtubule-chromosome+attachment+in+mouse+oocytes.">Laser Ablation of microtubule-chromosome attachment in mouse oocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1818, 153-161 (2018).</li><li>Milas, A., Jagric, M., Martincic, J., Tolic, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+reversible+knocksideways,+laser+ablation,+and+photoactivation+on+the+mitotic+spindle+in+human+cells.">Optogenetic reversible knocksideways, laser ablation, and photoactivation on the mitotic spindle in human cells.</a> Methods in Cell Biology. 145, 191-215 (2018).</li><li>Warzych, E., Lipinska, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+follicular+environment+during+oocyte+growth+and+maturation.">Energy metabolism of follicular environment during oocyte growth and maturation.</a> Journal of Reproduction and Development. 66 (1), 1-7 (2020).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li></ol>

Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.

22,23,24,25 hücrelerindeki hücre iskeleti ile ilişkili yapıları bozmak için farklı yöntemler mevcuttur. Bununla birlikte, hücre canlılığından ödün vermeden hedeflenen yapıyı seçici olarak bozmak için etkili teknikler bulmak zordur. Burada sunulan çoklu fotonlu lazer ablasyon yöntemi, oosit canlılığını değiştirmeden oosit içindeki mcMTOC'lere seçici bir mekanik pertürbasyon indüklemek için etkili bir stratejidir.
Lazer ablasyon, mitoz ve mayoz22,23,26,27 sırasında kromozom ayrışmasını kontrol eden moleküler mekanizmaları anlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Somatikhücrelere kıyasla memeli oositlerinin nispeten büyük boyutu (>80 mm çapında) nedeniyle, hücre içi yapılarının ablasyonu bir meydan okumayı temsil eder. Ayrıca, metafaz I oositlerindeki ortalama mcMTOC hacmi ~ 20 μm15'tir ve bu da ek bir zorluğu temsil eder. Bu zorlukların üstesinden gelmek için daha derin doku penetrasyonu sağlayan etkili bir yöntem benimsenmelidir. Ablasyon için çoklu foton lazeri kullanmanın temel avantajı, hedef dışı etkileri en aza indirirken hücrenin derinliklerine ulaşma yeteneğidir29.
Lazer ablasyon yönteminin hedeflenen yapıyı tüketmek için etkinliğini ve verimliliğini doğrulamak için, hedeflenen yapıyı zaman içinde (ablasyondan önce ve sonra) tanımlamak için floresan etiketli bir protein kullanılması önerilir23. Lazer ablasyonunun tüm mcMTOC'yi bir yapı olarak tükettiğini fark etmek önemlidir ve daha küçük mcMTOC'lerin tükenmesi için yalnızca tek bir lazer maruziyeti gerektirmesine rağmen, daha büyük mcMTOC'ler farklı odak düzlemlerinde birden fazla lazer pozlaması gerektirebilir. Ayrıca, mcMTOC ablasyonunun etkinliğini daha da doğrulamak için bir kontrol ve mcMTOC-ablatlı oositlerin bir MTOC belirteci (γ-tübülin, perisentrin veya Cep192 gibi) ile sabitlenmesi ve immüno-etiketlenmesi önerilir. Kontrol oositlerinde, sitoplazmanın mcMTOC'lere bitişik ancak onlarla örtüşmeyen alanları lazere maruz kalacaktır.
Bu deney, oositler içindeki farklı odak düzlemleri arasında hareket ederken birkaç mcMTOC ablasyonu gerektirir. Bu nedenle, deney süresini en aza indirmek ve böylece yumurta canlılığını artırmak için deneyi gerçekleştirmeden önce bu tekniğin birkaç kez uygulanması şiddetle tavsiye edilir. Ayrıca, oosit canlılığını etkilemeden mcMTOC'leri tüketmek için yeterli olan minimum lazer gücünü kullanmak önemlidir.
Bu tekniğin bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, çoklu foton konfokal mikroskoplar normal konfokal mikroskoplardan nispeten daha pahalıdır. İkincisi, tüm mcMTOC'leri farklı odak düzlemlerinde rahatsız etmek, kimyasal veya genetik karışıklıklardan daha fazla zaman alıcıdır. Üçüncüsü, bu protokol tüm mcMTOC'leri mümkün olan en kısa sürede ortadan kaldırmak için teknik beceriler gerektirir. Bununla birlikte, bir kez ustalaşıldığında, çoklu foton lazerin kullanımı, mcMTOC'ler de dahil olmak üzere fare oositlerindeki çeşitli hücre içi yapıları bozmak için mükemmel bir strateji sağlar ve iğ konumlandırmasını düzenleyen moleküler mekanizmaların anlaşılmasına ve memeli oositlerinde zamanında göçüne katkıda bulunur.

Haploid gametler (sperm ve oosit) mayoz yoluyla üretilir, bu da bir tur DNA replikasyonunu ve ardından döllenmeden önce kromozom sayısının azaltılması için gerekli olan iki ardışık bölünmeyi gerektirir. Memelilerde, erken fetal yaşam boyunca, yumurta, germinal vezikül (GV) aşaması olarak adlandırılan bir aşama olan ilk mayotik bölünmenin faz I'inin diploten aşamasında (ergenliğe kadar) uzun bir tutuklamaya maruz kalır. Mayotik yeniden başlatmayı takiben, GV oosit nükleer zarf parçalanmasına (NEBD) maruz kalır ve iş mili esas olarak oosit merkezi 1,2,3'te monte edilir. Daha sonra, F-aktin tarafından tahrik edilen iğ, yüksek asimetrik bölünmeyi sağlamak için oosit merkezinden kortekse zamanında göç eder ve küçük bir polar gövdeye (PB) sahip bir yumurta ile sonuçlanır4,5,6.
Mitotik hücrelerde, sentrozomlar, perisentrin, γ-tübülin, Cep152 ve Cep1927 gibi peri-sentriyolar malzeme bileşenleri (PMC) ile çevrili bir çift sentriyollerden oluşur. Bu sentriol içeren sentrozomlar, bipolar iğ oluşumunun doğruluğuna katkıda bulunur8. Bununla birlikte, sentriyoller kemirgenler9 dahil olmak üzere çeşitli türlerde erken oogenez sırasında kaybolur. Bu nedenle, fare oositleri çok sayıda acentriolar mikrotübül (MT) düzenleme merkezi (MTOC) kullanarak sentriyol-bağımsız bir iğ montaj yolunu benimser9,10. Mayotik yeniden başlatma üzerine, perinükleer MTOC'ler üç ayrı yeniden yoğunlaşma, gerilme ve parçalanma adımından çok sayıda daha küçük MTOC'ye11,12 girer. Parçalanmış MTOC'ler daha sonra kümelenir ve bipolar bir iş mili 10,13,14 düzenlemek için sıralanır. Başka bir MTOC havuzu, NEBD sırasında sitoplazmada bulunur. Bu sitoplazmik MTOC'lerin bazıları göç eder ve iğ kutupları oluşturur (polar MTOC'ler, pMTOC'ler)10,11. Son zamanlarda, sitoplazmik MTOC'lerin metafaz sitoplazmik MTOC'ler (mcMTOC'ler) olarak adlandırılan, iğ kutbu oluşumuna katkıda bulunmayan, ancak metafaz I (Met I) sırasında yumurta sitoplazmasında kalan başka bir alt kümesi keşfedilmiştir. Çoklu foton lazer ablasyonu ile mcMTOC'lerin tükenmesi veya otofaji inhibisyonu ile sayılarının anormal şekilde arttırılması, iğ pozisyonunu ve migrasyonunu bozar ve metafaz II oositlerinde anöploidi insidansını arttırır15.
İlginç bir şekilde, mcMTOC'ler pMTOC'lerden birçok açıdan farklıdır15. Örneğin, esas olarak perinükleer MTOC'lerden kaynaklanan pMTOC'lerin aksine, mcMTOC'ler oosit korteksinden kaynaklanır. İş mili hala oosit merkezindeyken, mcMTOC'ler PB ekstrüzyon15 için iğin göç ettiği tarafa asimetrik olarak zıt olarak lokalize edilir. Astral benzeri MTs, nispeten büyük oosit hücresindeki kortekse ulaşamaz. Bu nedenle, bu mcMTOC'ler iş milini (astral benzeri MTOC'ler aracılığıyla ) kortekse sabitlemek için MT'leri çekirdeklendirir. Bu bulgular, mcMTOC çekirdekli MT kuvvetinin, kortekse doğru mil göçünü yönlendiren F-aktin aracılı kuvvete karşı koyduğu bir model önermektedir. Bu iki karşıt kuvvet arasındaki denge, merkezi iş mili konumlandırmasını ve zamanında iş mili göçünü düzenlemek için gereklidir15.
Bugüne kadar, incelenen tüm PMC proteinleri (perisentrin, g-tübülin, Cep192 ve Aurora kinaz A) her iki MTOC havuzuna lokalize olur: mcMTOC'ler ve pMTOC'ler15. Bu nedenle, pMTOC'leri rahatsız etmeden mcMTOC'leri seçici olarak rahatsız etmek için kimyasal veya genetik bir yaklaşım yoktur. Bu sınırlamalar, lazer ablasyon ile mcMTOC'leri seçici olarak hedefleyerek aşılabilir. Mikroablasyon için geliştirilen lazer tabanlı teknolojiler arasında, darbeli çok fotonlu femtosaniye lazerler, odak düzlemi ile sınırlı hassas etkileri, yakın kızılötesi ışığın yüksek penetrasyon derinliği ve hücreye karşı azaltılmış fototoksisite ve termal hasar nedeniyle büyük potansiyel göstermektedir16,17,18. Bu çalışma, ters çevrilmiş bir mikroskopla birleştirilmiş çoklu foton lazer kullanarak fare oositlerindeki mcMTOC'leri ablate etmek için seçici bir yaklaşımı açıklamaktadır.

<table><tbody><tr><td>4 IN thinwall GL 1.0 OD/.75 ID</td><td>World precision instrument&amp;nbsp;</td><td>TW100F-4</td><td>Injection needles&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Borosilicate glass&amp;nbsp;</td><td>Fisherbrand&amp;nbsp;</td><td>Cat# 13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillarities&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instrument&amp;nbsp;</td><td>Cat# TW100-6</td><td>Holding needles&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bovine serum albumine&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# A4503</td><td></td></tr><tr><td>Cage incubator for Leica DMI6000 B microscope</td><td>Life Imaging Services GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcium chlrode dihydrate</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# C7902</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; controller&amp;nbsp;</td><td>Pecon</td><td># 0506.000</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Cover HP</td><td>Pecon</td><td># 0506.020</td><td></td></tr><tr><td>DL-Lactic acid&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# L7900</td><td></td></tr><tr><td>DMi8</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>Microscope&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# E5134</td><td></td></tr><tr><td>Femtojet 4i</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>Microinjector&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Femtotips Microloader</td><td>Fisher scientific&amp;nbsp;</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# G1272</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# 1272</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom dish&amp;nbsp;</td><td>Mat Tek Corporation</td><td>Cat# P35G-1.0-20-C&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hepes&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# H3784</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Sodium Salt</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat # H3784</td><td></td></tr><tr><td>Hera Cell vios 160i</td><td>Thermo&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Leica TCP SP8 spectral laser scanning confocal micorscope with inverted stand DMI6000 B</td><td>Leica Microsystems, Inc</td><td>N/A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat#G8540</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate dihydrate</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# M7774</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai DeepSee Ti-Sapphire femtosecond laser</td><td>Spectra-Physics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>mCH-Cep192 cRNA</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Medium Essential Medium Eagle - MEM</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat #M0258</td><td></td></tr><tr><td>Milrinone</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat# M4659</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat# M5310</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essential medium eagle (MEM)</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# M0268 - 1L</td><td></td></tr><tr><td>Mouse: Cep192-eGFP reporter CF-1</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (100 mm)</td><td>Fisherbrand&amp;nbsp;</td><td>Cat# FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (35 mm)</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>Cat# 430165</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (60 mm)</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>Cat# 351007</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# P5530</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrolidone</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat# P2307</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrolidone (PVP)</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# P2307</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# P5405</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# P5655</td><td></td></tr><tr><td>Pregnant mare&amp;acute;s serum gonadotropin&amp;nbsp;</td><td>Lee BioSolutions</td><td>Cat# 493-10-10&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvic acid&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# P4562</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvic acid&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# P4562</td><td></td></tr><tr><td>Sewing needles&amp;nbsp;</td><td>D.M.C</td><td>N/A</td><td>N&amp;deg; 5 * 16 Needles&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# S5761</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# S5886</td><td></td></tr><tr><td>Stage-top heating insert P</td><td>Pecon</td><td># 0426.300</td><td></td></tr><tr><td>Sterezoom S9i</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>Stereomicroscope&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Syringe 1 mL</td><td>BD company&amp;nbsp;</td><td>Cat# 309597</td><td></td></tr><tr><td>Taurine&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# T0625</td><td></td></tr><tr><td>Temperature controller Tempcontrol 37-2 &lt;em&gt;digital&lt;/em&gt;</td><td>Pecon</td><td># 0503.000</td><td></td></tr><tr><td>The Cube temperature controller for the cage incubator</td><td>Life Imaging Services GmbH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

multi-photon laser ablation of cytoplasmic microtubule organizing centers in mouse oocytes

Oosit mayozunun sadakati, gelişimsel olarak yetkin öploid yumurtaların üretilmesinde kritik öneme sahiptir. Memelilerde, oosit ilk mayotik bölünmenin faz I'inde uzun bir tutuklamaya maruz kalır. Ergenlikten sonra ve mayotik yeniden başladıktan sonra, nükleer membran sökülür (nükleer zarf parçalanması) ve iş mili esas olarak oosit merkezinde monte edilir. İlk merkezi iş mili konumlandırması, anormal kinetochore-mikrotübül (MT) ataşmanlarına ve anöploidiye karşı korunmak için gereklidir. Merkezi olarak konumlandırılmış iğ, kortekse doğru zamana duyarlı bir şekilde göç eder ve bu, küçük bir kutup gövdesini ekstrüzyon yapmak için gerekli bir işlemdir. Mitotik hücrelerde, iğ konumlandırması, sentrozom aracılı astral MTs ve hücre korteksi arasındaki etkileşime dayanır. Aksine, fare oositleri klasik sentrozomlardan yoksundur ve bunun yerine çok sayıda acentriolar MT organizasyon merkezi (MTOC) içerir. Metafaz I aşamasında, fare oositleri iki farklı MTOC setine sahiptir: (1) iğ kutuplarını (polar MTOC'ler) birleştirmek için kümelenmiş ve sıralanmış MTOC'ler ve (2) sitoplazmada kalan ve doğrudan iğ oluşumuna katkıda bulunmayan, ancak iğ konumlandırmasını ve zamanında iğ göçünü düzenlemede çok önemli bir rol oynayan metafaz sitoplazmik MTOC'ler (mcMTOC'ler). Burada, Cep192-eGfp muhabir farelerinden toplanan oositlerde endojen olarak etiketlenmiş mcMTOC'leri seçici olarak tüketmek için çoklu fotonlu bir lazer ablasyon yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, memeli oositlerinde iğ pozisyonu ve migrasyonunun altında yatan moleküler mekanizmaların anlaşılmasına katkıda bulunur.

Çoklu foton lazer ablasyonu, hücre içi yapıları seçici olarak ablate etmek için etkili bir yöntem sağlar. Bu çalışmada, fare oositlerindeki mcMTOC'leri seçici olarak tüketmek için çoklu foton lazer ablasyonu kullanılmıştır. Lazer ablasyon, hedeflenen mcMTOC'lerdeki endojen GFP floresansının arka planla karşılaştırılabilir bir seviyeye indirgenmesiyle gösterildiği gibi, mcMTOC'leri verimli bir şekilde tüketmiştir. Hedeflenen mcMTOC'lerdeki ekzojen mCh-Cep192 de lazer ablasyonunu takiben kaldırıldı. Oosit içindeki tüm mcMTOC'lerin tükenmesini sağlamak için mcMTOC'lerin lazer ablasyonu oosit içindeki farklı odak düzlemlerinde (mcMTOC'lerin bulunduğu yerde, Şekil 2) yapılmalıdır (Şekil 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig01.jpg"> Resim 1: Yumurta mikroenjeksiyonu. Bir faz I-arrested fare oositinin mCh-Cep192 cRNA ile mikroenjeksiyonu. Ölçek çubuğu: 10 μm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64439/64439fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig02.jpg"> Şekil 2: Fare oositlerinde mcMTOC'lerin tükenmesi. Tek odak düzlemlerinin temsili görüntüleri. Beyaz kareler, çoklu foton lazer ablasyonundan önce ve sonra bir mcMTOC'yi gösterir. Ölçek çubuğu: 40 μm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64439/64439fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig03.jpg"> Şekil 3: Bir fare oositinde mcMTOC'lerin farklı odak düzlemlerinde tükenmesi. Bir mcMTOC-ablated fare oositinin temsili maksimum projeksiyon görüntüleri. Ölçek çubuğu: 20 μm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64439/64439fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 1: Chatot, Ziomek ve Bavister (CZB) ve bikarbonatsız minimal esansiyel ortam (MEM/PVP) bileşimleri. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64439/64439_Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes at JoVE.com

Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes

Yakın kızılötesi femtosaniye lazer kullanılarak metafaz I sırasında fare oositlerinde sitoplazmik mikrotübül düzenleme merkezlerinin tükenmesini sağlayan optimize edilmiş bir protokol sunulmaktadır.

Fare Oositlerinde Sitoplazmik Mikrotübül Düzenleme Merkezlerinin Multi-Foton Lazer Ablasyonu

The fidelity of oocyte meiosis is critical for generating developmentally competent euploid eggs. In mammals, the oocyte undergoes a lengthy arrest at ...

multi-photon-laser-ablation-cytoplasmic-microtubule-organizing

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

1.6K Görüntüleme.  University of Missouri. Yakın kızılötesi femtosaniye lazer kullanılarak metafaz I sırasında fare oositlerinde sitoplazmik mikrotübül düzenleme merkezlerinin tükenmesini sağlayan optimize edilmiş bir protokol sunulmaktadır. 

Video: Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Here we present a protocol for the characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar organization.

Nucleolar Kromatin Teşkilatı dayanarak Fare Antral OOSİT İzolasyonu ve Karakterizasyonu

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Gelişim Biyolojisi

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

Mayoz sırasında insan gen işlevini değerlendirmek için fare yumurta kullanarak ben

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Genetik

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that take place in the cytoplasm in preparation for fertilization and acquisition of totipotency. During oocyte maturation, changes in gene expression depend exclusively on the translation and degradation of maternal messenger RNAs (mRNAs) rather than on transcription. Execution of the translational program, therefore, plays a key role in establishing oocyte developmental competence to sustain embryo development. This paper is part of a focus on defining the program of maternal mRNA translation that takes place during meiotic maturation and at the oocyte-to-zygote transition. In this method paper, a strategy is presented to study the regulation of translation of target mRNAs during in vitro oocyte maturation. Here, a Ypet reporter is fused to the 3&#39; untranslated region (UTR) of the gene of interest and then micro-injected into oocytes together with polyadenylated mRNA encoding for mCherry to control for injected volume. By using time-lapse microscopy to measure reporter accumulation, translation rates are calculated at different transitions during oocyte meiotic maturation. Here, the protocols for oocyte isolation and injection, time-lapse recording, and data analysis have been described, using the Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3&#39; UTR reporter as an example.

This protocol describes a reporter assay to study the regulation of mRNA translation in single oocytes during in vitro maturation.

Tek Bir Oocyte Reporter Tahlil Kullanarak In vitro Olgunlaşma Sırasında Maternal mRNA Çeviri Programını Tanımlama

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells entering meiotic prophase I are eliminated during Fetal Oocyte Attrition (FOA) and the first week of postnatal life. Three major mechanisms regulate the number of oocytes that survive during development and establish the ovarian reserve in females entering puberty. In the first wave of oocyte loss, 30-50% of the oocytes are eliminated during early FOA, a phenomenon that is attributed to high Long interspersed nuclear element-1 (LINE-1) expression. The second wave of oocyte loss is the elimination of oocytes with meiotic defects by a meiotic quality checkpoint. The third wave of oocyte loss occurs perinatally during primordial follicle formation when some oocytes fail to form follicles. It remains unclear what regulates each of these three waves of oocyte loss and how they shape the ovarian reserve in either mice or humans.
Immunofluorescence and 3D visualization have opened a new avenue to image and analyze oocyte development in the context of the whole ovary rather than in less informative 2D sections. This article provides a comprehensive protocol for whole ovary immunostaining and optical clearing, yielding preparations for imaging using multiphoton microscopy and 3D modeling using commercially available software. It shows how this method can be used to show the dynamics of oocyte attrition during ovarian development in C57BL/6J mice and quantify oocyte loss during the three waves of oocyte elimination. This protocol can be applied to prenatal and early postnatal ovaries for oocyte visualization and quantification, as well as other quantitative approaches. Importantly, the protocol was strategically developed to accommodate high-throughput, reliable, and repeatable processing that can meet the needs in toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Here, we present an optimized protocol for imaging entire ovaries for quantitative and qualitative analyses using whole-mount immunostaining, multiphoton microscopy, and 3D visualization and analysis. This protocol accommodates high-throughput, reliable, and repeatable processing that is applicable for toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Farede Gelişmekte Olan Yumurtalık Rezervinin Kantitatif 3D Analizi için Tüm Yumurtalık İmmünofloresansı, Temizleme ve Multifoton Mikroskobu

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. Traditional pharmacological disruption of the ubiquitous microtubule network using, for instance, nocodazole can have devastating consequences for any cell. Reversibly photoswitchable microtubule inhibitors have the potential to overcome the limitations by enabling drug effects to be implemented in a spatiotemporally-controlled manner. One such family of drugs is the azobenzene-based photostatins (PSTs). These compounds are inactive in dark conditions, and upon illumination with UV light, they bind to the colchicine-binding site of &#946;-tubulin and block microtubule polymerization and dynamic turnover. Here, the application of PSTs in the 3-dimensional (3D) live preimplantation mouse embryo is set out to disrupt the microtubule network on a subcellular level. This protocol provides instructions for the experimental setup, as well as light activation and deactivation parameters for PSTs using live-cell confocal microscopy. This ensures reproducibility and enables others to apply this procedure to their research questions. Innovative photoswitches like PSTs may evolve as powerful tools to advance the understanding of the dynamic intracellular microtubule network and to non-invasively manipulate the cytoskeleton in real-time. Furthermore, PSTs may prove useful in other 3D structures such as organoids, blastoids, or embryos of other species.

Typical microtubule inhibitors, used widely in basic and applied research, have far-reaching effects on cells. Recently, photostatins emerged as a class of photoswitchable microtubule inhibitors, capable of instantaneous, reversible, spatiotemporally precise manipulation of microtubules. This step-by-step protocol details the application of photostatins in a 3D live preimplantation mouse embryo.

Fotostatinler Kullanılarak Canlı Preimplantasyon Fare Embriyosundaki Mikrotübül Sitoiskeletinin Spatiotemporal Subcellular Manipülasyonu

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. ...

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

Fare Oositlerinde İş Mili Montaj Kontrol Noktası Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

Farelerin Profaz Tutuklu Oositlerinde DNA Hasarının Belirlenmesi

Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain arrested at the prophase of meiosis I. The quiescent state may last for years until the oocytes receive a stimulus to grow and obtain the competency to resume meiosis. This protracted state of arrest makes them extremely susceptible to accumulating DNA-damaging insults, which affect the genetic integrity of the female gametes and, therefore, the genetic integrity of the future embryo. 
Consequently, the development of an accurate method to detect DNA damage, which is the first step for the establishment of DNA damage response mechanisms, is of vital importance. This paper describes a common protocol to test the presence and progress of DNA damage in prophase-arrested oocytes during a period of 20 h. Specifically, we dissect mouse ovaries, retrieve the cumulus-oocyte complexes (COCs), remove the cumulus cells from the COCs, and culture the oocytes in &#924;2 medium containing 3-isobutyl-1-methylxanthine to maintain the state of arrest. Thereafter, the oocytes are treated with the cytotoxic, antineoplasmic drug, etoposide, to engender double-strand breaks (DSBs). 
By using immunofluorescence and confocal microscopy, we detect and quantify the levels of the core protein &#947;H2AX, which is the phosphorylated form of the histone H2AX. H2AX becomes phosphorylated at the sites of DSBs after DNA damage. The inability to restore DNA integrity following DNA damage in oocytes can lead to infertility, birth defects, and increased rates of spontaneous abortions. Therefore, the understanding of DNA damage response mechanisms and, at the same time, the establishment of an intact method for studying these mechanisms are essential for reproductive biology research.

Yazar Spotlight: Memeli Oositlerinde ve Preimplantasyon Embriyolarında DNA Hasar Tepkisini Anlamak 

Maintaining oocyte genome integrity is necessary to ensure the genetic fidelity in the resulting embryo. Here, we present an accurate protocol for detecting DNA double-strand breaks in mammalian female germ cells.

Fare Oositlerinde DNA Çift Sarmallı Kırılmaların Tespiti

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

Fare Oosit Mikroenjeksiyon, olgunlaşması ve ploidi Değerlendirmesi

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Fare Oositlerinde Sitoplazmik Mikrotübül Düzenleme Merkezlerinin Multi-Foton Lazer Ablasyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Nucleolar Kromatin Teşkilatı dayanarak Fare Antral OOSİT İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Mayoz sırasında insan gen işlevini değerlendirmek için fare yumurta kullanarak ben

Tek Bir Oocyte Reporter Tahlil Kullanarak In vitro Olgunlaşma Sırasında Maternal mRNA Çeviri Programını Tanımlama

Farede Gelişmekte Olan Yumurtalık Rezervinin Kantitatif 3D Analizi için Tüm Yumurtalık İmmünofloresansı, Temizleme ve Multifoton Mikroskobu

Fotostatinler Kullanılarak Canlı Preimplantasyon Fare Embriyosundaki Mikrotübül Sitoiskeletinin Spatiotemporal Subcellular Manipülasyonu

Fare Oositlerinde İş Mili Montaj Kontrol Noktası Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

Fare Oositlerinde DNA Çift Sarmallı Kırılmaların Tespiti

Fare Oositlerinde DNA Çift Sarmallı Kırılmaların Tespiti

Fare Oositlerinde DNA Çift Sarmallı Kırılmaların Tespiti

Fare Oosit Mikroenjeksiyon, olgunlaşması ve ploidi Değerlendirmesi