La dispersión mejorada con nanoplasmón, o nPES, es una alternativa simple y no invasiva a la biopsia quirúrgica que puede omitir pasos de purificación de exosomas que consumen mucho tiempo y trabajan laborioso, expandiendo la aplicación del análisis de exosomas a entornos clínicos. Este ensayo nPES es un procedimiento rápido para analizar biomarcadores específicos en la membrana externa de los exosomas que no requieren pasos de aislamiento y purificación separados. Sólo necesitamos una muestra clínica muy pequeña para este ensayo.
Por lo tanto, este método puede ampliar el uso de nPES para estudiar modelos de ratón DE ingeniería genética o PDX. Hay algunos pasos en este protocolo que pueden parecer desalentadors. Sin embargo, con algunas carreras de práctica, todos los usuarios con habilidades básicas de laboratorio húmedo pueden aprender a realizar con éxito nPES.
Para iniciar el procedimiento, combine 40 microlitros de una suspensión de nanorods de oro funcionalizados por NeutrAvidin con 200 microlitros de solución salina fría y con pH siete tampones en fosfato. Centrifugar la mezcla a 8500 veces g a cuatro grados Centígrados durante 10 minutos, y retire el sobrenadante. Repita este proceso de lavado dos veces más, y luego resuspender las nanorods en 40 microlitros de PBS frío.
A continuación, añada 150 microlitros de PBS frío y 10 microlitros de una solución de 0,5 miligramos por mililitro de los anticuerpos biotinilados adecuados para la suspensión. Mezclar a cuatro grados Celsius durante dos horas para obtener nanorods de oro conjugados con anticuerpos. Lavar las nanorods tres veces por centrifugación en porciones de 200 microlitros de PBS frío a 6500 veces g a cuatro grados Celsius durante 10 minutos cada una.
Después, resuspender las nanorods conjugadas con anticuerpos lavados en 200 microlitros de PBS frío, y almacenarlos en cuatro grados Celsius durante un máximo de 24 horas. Para comenzar a preparar la diapositiva, diluya los anticuerpos de captura de exosoma deseados a 025 miligramos por mililitro en PBS. Pipetear un microlitro de esta solución en cada pozo de una diapositiva tratada con proteína A/G respaldada con vidrio de grado óptico.
A continuación, transfiera el portaobjetos a una caja humidificadora para asegurarse de que los pozos no se sequen durante la incubación. Incubar el portaobjetos a 37 grados centígrados durante una hora para inmovilizar los anticuerpos de captura. A continuación, aspirar la solución restante para eliminar los anticuerpos no unidos.
Lave los pozos añadiendo y aspirando un microlitro de PBS tres veces. A continuación, cargue rápidamente cada pozo con un microlitro de búfer de bloqueo basado en PBS, e incubar la diapositiva a 37 grados Celsius durante dos horas. Cuando se ejecutan alrededor de 15 muestras, debemos utilizar una pipeta de un solo canal para cargar el búfer de bloqueo en 120 pozos en menos de cinco minutos para evitar la evaporación del agente de bloqueo.
Comience a preparar una solución de nanorods de oro conjugados con anticuerpos durante el bloqueo de diapositivas. Unos 30 minutos antes de bloquear los acabados, descongele rápidamente muestras de plasma o suero en un baño de agua a temperatura ambiente. Vórtice las muestras descongeladas durante 30 segundos para garantizar que las suspensiones sean homogéneas.
Luego, centrifugar las muestras a 500 veces g durante 15 minutos para precipitar agregados proteicos y otros desechos. Transfiera alícuotas de 10 microlitros del sobrenadante a tubos frescos y haga diluciones uno a uno con PBS. Mezclar las muestras diluidas por vórtices suaves o inversión según corresponda.
Cuando el bloqueo de diapositivas haya terminado, aspire el búfer de bloqueo y lave los pozos tres veces con porciones de un microlitro de PBS. Cargue inmediatamente las muestras en los pozos con un microlitro por pozo y ocho réplicas por muestra. Cargue los estándares de exosoma en los pozos apropiados de la misma manera.
Incubar el portaobjetos durante 12 a 18 horas en un refrigerador a cuatro grados centígrados. Luego, aspirar los pozos, y lavar cada uno bien una vez con un microlitro de PBS. Cargue un microlitro de la suspensión de nanorod de oro conjugado con anticuerpos en cada pozo, e incubar el portaobjetos a 37 grados Celsius durante dos horas.
Después, aspirar la suspensión de nanorod, y lavar el portaobjetos en PBS complementado con 1%polisorbato 20 durante 10 minutos usando un mezclador. A continuación, aspirar los pozos y lavar el tobogán en agua desionizada durante 10 minutos en una mezcladora giratoria. Retire el agua y deje que el portaobjetos se seque al aire en un plato limpio de Petri antes de llevar el portaobjetos al microscopio de campo oscuro.
Configure un microscopio invertido equipado con un condensador de inmersión de aceite de campo oscuro, un objetivo 4x y una etapa motorizada. Conecte el microscopio a un ordenador a través de una cámara digital y abra el software de imágenes. A continuación, coloque la diapositiva de la muestra boca abajo en la etapa del microscopio y aplique una pequeña gota de aceite de inmersión donde la lente del condensador entre en contacto con la diapositiva.
Muestre la vista a través del microscopio en el software de imágenes. Ajuste el tiempo de exposición con respecto a un pozo estándar de alta concentración para asegurarse de que la imagen no se saturará. A continuación, abra la herramienta para escanear imágenes grandes y establezca el aumento objetivo en 10x.
Elija cerrar el obturador activo durante el movimiento de la etapa y esperar 20 milisegundos antes de cada captura. Establezca la superposición de costura en 20% y seleccione la costura a través de la ruta óptima. Elija crear una imagen grande a partir del escaneo.
Configure la cámara para que se enfoque manualmente al inicio del escaneo y habilite el enfoque automático paso a paso cada 20 campos. A continuación, elija establecer límites izquierdo, derecho, superior e inferior para el campo de exploración de destino y defina el área de exploración moviendo la etapa del microscopio a cada uno de los límites deseados. A continuación, ajuste el enfoque, el condensador y la iluminación del área para obtener una imagen clara y bien iluminada.
Asigne un nombre al archivo de imagen que se va a crear e inicie el análisis. Cuando termine, abra la imagen y guárdela a escala 1/8. Abra el software de análisis de imágenes.
A continuación, abra el menú Plugins, haga clic en DSM Scan, defina el número de columnas y filas, establezca el porcentaje de cambio de tamaño en 25, establezca el diámetro del punto, en píxeles, en 190 a 200, establezca el rango de diámetro en 32 y establezca el diámetro de incremento, en píxeles, en ocho. Establezca los límites de DSM bajos y altos en cero y 62, la distancia adyacente a 100 y el sesgo de resta en cero. Ejecute el algoritmo DSM y guarde los datos resultantes.
La técnica de análisis de DSM mostró una buena reproducibilidad en muestras de exosoma PANC-1 diluidas en serie que oscilaban entre 0,24 y 1,2 microgramos por microlitro. Se observó una fuerte correlación lineal entre la respuesta de dispersión de las nanorods de oro y la concentración de proteínas exosomas. Se observó una diferencia significativa en la abundancia de exosomas séricos que expresan el biomarcador asociado al cáncer EphA2 entre pacientes con cáncer de páncreas y pacientes sanos.
A partir de la adición del agente de bloqueo, el pipeteo rápido y preciso es crucial para evitar la evaporación de las muestras, introducir la contaminación cruzada y rayar la superficie de la diapositiva. Siguiendo este procedimiento, realizamos análisis estadísticos para investigar cualquier correlación entre la expresión del biomarcador exosomal de interés y la etapa diferente de la enfermedad que se está estudiando. Después de establecer esta tecnología, y podemos encontrar biomarcadores exosomales para cánceres de páncreas en estadio temprano.
Actualmente, estamos expandiendo este descubrimiento a otros tipos de cánceres y enfermedades de infección. Por lo general, las muestras que se manejan en este ensayo son muestras de pacientes o muestras de exosomas purificadas de líneas celulares de cáncer, que requieren un entrenamiento de seguridad especial.
