Estamos muy agradecidos a T. Sturner para correcciones votos, discusiones y comentarios sobre el manuscrito; SL Zipursky para proporcionar poblaciones de moscas; M Schölling para tareas de procesamiento. Parte del análisis de imágenes se realizó en el laboratorio de A. Kakita. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Alexander von Humboldt y JSP Becas para la Investigación en el Extranjero (AS), JSP Fellows (SH-S.), Grant-In-Ayuda para la puesta en marcha (24800024), en áreas innovadoras (25110713), Mochida, Takeda, Inamori, Daiichi Sankyo-, Fundamentos Toray (TS), la financiación básica DZNE (GT) y el Fondo para DZNE Microscopía de Luz (CM).

Los procedimientos experimentales descritos en el presente Protocolo se refieran exclusivamente trabajan con Drosophila y no están sometidos a las leyes de bienestar animal en Alemania y Japón. 1. Condiciones de exposición a la luz <ol><li> Preparar las moscas que llevan sensless-flipasa (sens-flp) y Bruchpilot-FRT-STOP-FRT-GFP (BRP-FSF-GFP) 15 para la visualización de BRP-GFP en las neuronas fotorreceptoras (R8) r8s. El locus genómico que codifica BRP dentro de un cromosoma artificial bacteriano (BAC) se modificó para generar esta construcción BRP-FSF-GFP. En las moscas que llevan este BAC modificado la expresión de Brp-GFP está bajo el control de las secuencias reguladoras endógenas, pero limitado a los fotorreceptores R8 después sensless-flipasa eliminación mediada de la casete FRT-STOP-FRT 15. Tenga en cuenta que sens-flp rara vez se expresa en flipasa R7s. </li><li> Mantener las moscas en un 12 h lilucha / 12 h oscuridad ciclo (LD) a 25 ° C desde la etapa de larva hasta la eclosión (Figura 1A). </li><li> Recoger las moscas 0 - 6 h después de la eclosión y colocarlos en un nuevo vial que contiene alimentos mosca. </li><li> Establecer los viales en un bastidor transparente hecha de resina acrílica con tres pasos (una altura de 41 cm, una base de 21 cm, un espesor de 4 cm y una altura de 13 cm para cada paso) (Figura 1B). </li><li> Ajustar la distancia entre la cremallera y un panel LED para proporcionar la iluminación con una intensidad media de 1.000 lux usando un medidor de luz digital (Figura 1C). </li><li> Mantener las moscas por 1 - 3 d bajo una de las siguientes condiciones: oscuridad constante (DD), 12 h luz / 12 h oscuridad ciclo (LD), o la luz constante (LL) a 25 ° C en un incubador pequeño (Figuras 1A y 1C). </li></ol> 2. Disección, inmunohistoquímica e Imagen <ol><li> Diseccionar el cerebro de moscas con una pinza, fijarlas con el 4% formaldehyde y inmunotinción con el anticuerpo primario contra Chaoptin (01:50) y un segundo anticuerpo para la visualización de los fotorreceptores en base a los procedimientos experimentales anteriores 25. Brevemente: <ol><li> Preparar 0,1% de Triton X-100 en PBS (0,1% PBT). Esta solución se utiliza para mejorar la penetración del tejido de anticuerpos. </li><li> Anestesiar las moscas en un cojín de CO 2, resolver el genotipo correcto y transferirlos a una placa de Petri llena con 0,1% de PBT. </li><li> Se adhieren las pinzas debajo de la trompa y salga de los ojos derecho e izquierdo, respectivamente, con los otros fórceps. </li><li> Retire la trompa y la tráquea adherida al cerebro. </li><li> Transferir el cerebro con las pinzas en un tubo de 1,5 ml que contenía 150 l de 0,1% PBT a TA. </li><li> Dentro de 10 minutos de repetición de 2.1.3 - 2.1.5 para obtener la mayor cantidad posible de cerebros. </li><li> Añadir 50 l de 16% de formaldehído en el tubo y mezclar mediante pipeteo. </li><li> Incubar el cerebro en fijador en la salatemperatura durante 50 min. </li><li> Lavar tres veces con 200 l de 0,1% PBT con una micropipeta, prestando atención a dejar el cerebro en el tubo. </li><li> Después del último lavado, retire el PBT 0,1% y añadir la solución de anticuerpo primario, preparado de la siguiente manera: añadir a 196 l de 0,3% PBT (0,3% de Triton X-100 en PBS) 4 l de anti-Chaoptin anticuerpo (dilución final 1 : 50) para la visualización de los fotorreceptores. </li><li> Incubar los cerebros en la solución de anticuerpos primarios a 4 ° CO / N. </li><li> Lavar 3 veces con 200 l de 0,1% PBT con una micropipeta. </li><li> Después del último lavado, eliminar el PBT 0,1% y añadir 200 l de las PBT 0,3% que contiene un anticuerpo secundario. </li><li> Incubar en la oscuridad a 4 ° CO / N. </li><li> Lavar tres veces con 200 l de 0,1% PBT con una micropipeta. </li></ol></li><li> Para el montaje, poner dos pequeñas gotas (2 l cada una) de un medio de montaje con una micropipeta en el centro de un portaobjetos de microscopio en aproximadamente 2 cm distana vez que el uno del otro. </li><li> Coloque dos cubreobjetos, uno en cada gota y dejar un hueco estrecho entre los cubreobjetos de aproximadamente 0,2 mm. </li><li> Colocar 15 l de un medio de montaje en la parte superior del cubreobjetos y añadir los cerebros con una micropipeta en el medio de montaje. </li><li> Bajo un microscopio de disección, coloque el cerebro con el lado ventral hacia arriba en el espacio estrecho entre los dos cubreobjetos (Figura 2). </li><li> Colocar un cubreobjetos en la parte superior y sellar los bordes del cubreobjetos usando esmalte de uñas transparente para fijar la muestra (Figura 2). </li><li> Obtener imágenes de los cerebros con un microscopio confocal. Utilice un objetivo de inmersión en aceite 63X objetivo (1,4 NA) y un zoom digital de 2.6X. Generar más de 20 secciones ópticas de la segunda médula del ganglio óptica con un tamaño de paso de 0,5 micras. </li></ol> 3. Generación de los lugares, objetos de superficie, puesta en puntos y Puntos terminales <ol><li> Para cuantificar el número, distribution y el nivel de deslocalización de BRP-GFP puntos lagrimales, abren la pila obtenida por microscopía confocal en el software de análisis de imágenes y reconstituir las imágenes en 3D (Figura 3A). Tenga en cuenta que el paso en este estudio se realizó con Imaris. </li><li> Identificar los puntos lagrimales BRP-GFP por el módulo de detección de puntos para cada terminal del axón R8. <ol><li> Seleccione &quot;Añadir nuevos puntos&quot;. </li><li> Seleccione &quot;Segmento solamente una zona de interés&quot; en la configuración del algoritmo. Seleccionar un terminal del axón R8 en la médula manualmente. </li><li> Seleccione el canal de la fuente de la señal de BRP-GFP. NOTA: Los axones fotorreceptoras R7 y R8 se immunolabeled con anti-Chaoptin (Figura 3A). Sólo R8, sin embargo, contiene Brp-GFP puntos lagrimales y por lo tanto se puede distinguir fácilmente (Figura 3A). Además, el punto final de R8 puede ser identificado por el adelgazamiento de los axones anti-Chaoptin-positivos en el punto de entrada en la capa de médula M3. </li><li> Ajuste el diámetro XY t estimadoo 0,35 micras y marque &quot;sustracción de fondo&quot; en la detección de puntos. </li><li> Seleccione &quot;Calidad&quot; en el tipo de filtro y el filtro de forma automática. A continuación, haga clic en Finalizar. </li><li> Repita desde el 3.2.1 t- 3.2.5 para otros axones R (Figura 3B). </li></ol></li><li> Para medir el nivel de deslocalización de BRP-GFP en los axones R8, generar objetos de superficie con la función de &quot;Surface&quot; para cada axón (Figura 3C). <ol><li> Seleccione &quot;Añadir nuevas superficies&quot;. </li><li> Seleccione &quot;Segmento solamente una zona de interés&quot; en la configuración del algoritmo. A continuación, seleccione una terminales de los axones en la médula R8 manualmente. </li><li> Seleccione el canal de origen de los fotorreceptores. </li><li> Marque &quot;Smooth&quot;. </li><li> Seleccione &quot;intensidad absoluta&quot; en el umbral. </li><li> Marque &quot;Activar&quot;. &quot;Semilla Puntos&quot; de diámetro es de 0,5 micras. </li><li> Elija un filtro de tipo &quot;Calidad&quot; y &quot;Número de voxels&quot; y, a continuación, filtrar automáticamente. </li><li> Ir a &quot;Editar&quot; y eliminar las piezas de las superficies generadas en otros axones no interesantes. </li><li> Repita desde el 3.3.1 - 3.3.8 para otros axones R (Figura 3C). Nota Algunos objetos de superficie fueron interrumpidos debido a la delgadez y la señal débil en los fotorreceptores en la capa M2, pero seguían siendo considerados como un único objeto de principio a puntos finales. </li></ol></li><li> Para identificar la distribución de los puntos lagrimales Brp-GFP a lo largo de cada neurona en el neuropilo médula, definir el punto de inicio y punto final con la función de punto de medición (Figura 3D). <ol><li> Seleccione &quot;Añadir nuevos puntos de medición&quot;. A continuación, seleccione &quot;Editar&quot; y seleccione &quot;Superficie de objeto&quot; para intersectar con la parte superior de los objetos de superficie. </li><li> Ponga puntos de medición en la parte superior de los objetos de la superficie de los axones R de capa M1 en orden. Estos se definen ahora como puesta en puntos (Figura 3D). </li><li> Seleccione &quot;Añadir nuevos puntos de medición&quot;.A continuación, seleccione &quot;Editar&quot; y seleccione &quot;Superficie de objeto&quot; para intersectar con la parte inferior de los objetos de superficie. </li><li> Ponga puntos de medición en la parte inferior de los objetos de superficie de axones R en capa M3 en orden. Estos se definen ahora como puntos finales (Figura 3D). </li></ol></li><li> Para restar la señal de fondo del canal de GFP, generar objetos superficiales, manchas, comienzo de puntos y los puntos finales de dos axones R en la capa de M6 (Figura 3E). <ol><li> Seleccione &quot;Añadir nuevas superficies&quot;. </li><li> Seleccione &quot;Segmento solamente una zona de interés&quot; en la configuración del algoritmo. A continuación, seleccione un terminal del axón R7 entre M5 y M6 capa manualmente. </li><li> Seleccione el canal de origen del fotorreceptor. </li><li> Marque &quot;Smooth&quot;. </li><li> Seleccione &quot;intensidad absoluta&quot; en el umbral. </li><li> Seleccionar el tipo de filtro &quot;Calidad&quot; y &quot;Número de voxels&quot;, luego filtrar de forma automática. </li><li> Seleccione &quot;Añadir nuevos puntos&quot;;. </li><li> Seleccione &quot;Omitir la creación automática, editar manualmente&quot;. </li><li> Seleccione &quot;Centro de objeto&quot; y añadir un punto en la zona interna del objeto superficie generada a partir de 3.5.1 - 3.5.6. </li><li> Repita desde el 3.5.1 - 3.5.9 para otro terminal del axón R7. </li><li> Seleccione &quot;Añadir nuevos puntos de medición&quot;. A continuación, seleccione &quot;Editar&quot; y poner puntos de medición en la parte superior de los dos objetos en la superficie de la punta de la terminal del axón R7 en la capa M6. Estos se definen ahora como puesta en puntos. </li><li> Seleccione &quot;Añadir nuevos puntos de medición&quot;. A continuación, seleccione &quot;Editar&quot; y poner puntos de medición en la parte inferior de los dos objetos en la superficie de la punta de la terminal del axón R7 en la capa M6. Estos se definen ahora como puntos finales (Figura 3E). </li></ol></li></ol> 4. Cálculo del número de manchas, Distribución de la frecuencia puntual y nivel de enriquecimiento de BRP-GFP con una imagen personalizada de software de análisis de datos <ol><li> Copiar el archivo&quot;XtquantifySynapseSNR.m&quot; y la carpeta &quot;funciones&quot; en la carpeta de MATLAB Imaris XT. Tenga en cuenta que el cálculo en este estudio se realizó con un plugin personalizado implementado en Matlab. Descargar el plugin desde la página web ( <a href="https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo" target="_blank">https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo</a> ). </li><li> Abrir un conjunto de datos con n puntos, n superficies y objetos de punto de medición 2, cada uno con puntos de medición (n preparados a partir de 3.1 - 3.4). El primer objeto punto de medición define las posiciones de inicio para todos los axones. El segundo objeto de punto de medición define la posición final de todos los axones. Ambos objetos de puntos de medición deben tener el mismo número de puntos de medición (es decir el número de axones). </li><li> Ejecutar el procesamiento de imágenes &gt;&gt; CUSTOM&gt; atsushis detección de sinapsis Vs 6. </li><li> Compruebe metadatos y cambiar el tamaño de píxel en el software de análisis de imágenes en caso de que no es correcto. </li><li> Elija un canal para la perforaciónormance del análisis intensidad de las manchas y las regiones citoplásmicas (el canal con BRP-GFP). </li><li> Definir el nombre del archivo para exportar los resultados. </li><li> Definir el número de contenedores y la longitud del axón en por ciento. Introduce el número de contenedores como &quot;10&quot; y la gama de contenedores como &quot;100%&quot; (Figuras 4A y 4B). </li><li> Definir las regiones de las manchas y las otras regiones citoplásmicas para el análisis deslocalización Brp-GFP. Introduce los puntos RADIUS como &quot;0,35 m&quot; y el ancho del área como &quot;50 micras&quot; circundante. El radio de los puntos define la región para la señal de puntos lagrimales GFP (0,35 m de diámetro, centrado en un punto lagrimal). La anchura de la zona circundante define la región de la señal de GFP en la zona citoplasmática (50 m de diámetro, centrado en el punto lagrimal, pero incluyendo sólo R8 y excluyendo todas las áreas de punto en el citoplasma) (Figuras 4A y 4C). </li><li> Espere hasta que todas las máscaras de neuronas se procesany exportados como archivos PDF (Figuras 4B y 4C) y una tabla CSV para su posterior análisis en una hoja de cálculo. La tabla csv incluye el número de las manchas, la intensidad media de la señal en el &quot;área citoplasmática&quot; y la intensidad máxima de la señal en el &quot;punto&quot; en cada bin para todos los axones R8. </li><li> Abrir un conjunto de datos preparado en 3.5 para la sustracción de la señal de fondo. </li><li> Realizar el procesamiento de imágenes como descrito desde el 4.3 - 4.9. </li><li> Calcular el promedio del número total y la distribución de los puntos lagrimales Brp-GFP en una hoja de cálculo (Figuras 4D y 4E). </li><li> Calcular el promedio de la deslocalización de señal Brp-GFP en una hoja de cálculo por la relación de la intensidad media en la &quot;zona citoplasmática&quot; dividido por la intensidad máxima en el &quot;punto&quot; restado por la intensidad media de la señal de fondo (Figura 4F) . </li></ol>

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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-Resolution+Mapping+of+Neuronal+Circuitry+With+an+Index-Optimized+Clearing+Agent.">Super-Resolution Mapping of Neuronal Circuitry With an Index-Optimized Clearing Agent.</a> Cell Rep. 14 (11), 2718-2732 (2016).</li><li>Ehmann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+super-resolution+imaging+of+Bruchpilot+distinguishes+active+zone+states.">Quantitative super-resolution imaging of Bruchpilot distinguishes active zone states.</a> Nat Commun. 5, 4650 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

En este estudio, mostramos cómo preparar las condiciones de luz para exponer las moscas a una intensidad de luz igual. Hemos cuantificado no sólo el número de puntos lagrimales sináptica marcador, pero también podríamos resolver espacialmente la densidad de las sinapsis a lo largo de los axones y medir el nivel de deslocalización de la proteína marcadora en zonas citoplasmáticos. Estos tres evaluaciones nos permiten evaluar los detalles de la dinámica sináptica de las neuronas a nivel individual en diferentes condiciones ambientales. El protocolo se puede adaptar a diferentes proteínas sinápticas, sino también a cualquier dato que contenga señales punteadas. Un paso crítico en el protocolo es el montaje de los cerebros. Fotorreceptores de Drosophila proyectan sus axones a la segunda médula del ganglio óptico. Cada axón fotorreceptor puede ser escaneado sin rodeos si los cerebros montados fueron colocados correctamente en un portaobjetos de microscopio. El montaje correcto también hace que la selección de los fotorreceptores con el análisis de imágenes software funciones más fáciles. Cada región fotorreceptor tiene que ser seleccionado manualmente para contar el número y la deslocalización nivel de puntos lagrimales. Los de inicio y puntos finales también se seleccionan manualmente. Estas preparaciones requieren un tiempo relativamente largo hasta que se pueda proceder a la cuantificación. La ventaja de R8 axones es que son no ramificado y cada axón R8 es separada. Se recomienda una neurona aislado sencillo como este para estas aplicaciones, ya que es necesario definir el área exacta de la neurona. Además, esto ayuda a deshacerse de los puntos lagrimales y las superficies de derivados de otras neuronas no específica. Una limitación de este enfoque, sin embargo, es la profundidad de la proyección z. La intensidad de señal de puntos lagrimales recibe menos en capas más profundas de la pila de z. Preparación de cerebros transparentes por métodos de compensación de tejido-a SeeDB2 tales 29 podría ayudar a superar esta limitación y permitir que la imagen de una señal clara punteada aún más profundamente en el cerebro. nuestra protocol potencialmente se puede utilizar para el análisis de la organización sináptica en una escala nano y con imágenes en directo. La combinación de formación de imágenes de super-resolución (por ejemplo, estimula el agotamiento de emisión (STED) microscopía, microscopía estocástico reconstrucción óptica (STORM), foto activado microscopía de localización (PALM), microscopía de iluminación estructurada (SIM), etc.) con el modelado teórico ha avanzado nuestra comprensión de la la estructura y la dinámica molecular de sinapsis. Por ejemplo, la organización de nanoscópico Brp se evaluó con una resolución de un solo molecular con super-resolución de imagen directa por la tormenta (d STORM) en la Drosophila NMJ 30. El protocolo fue adaptado para la cuantificación de la dinámica de una sola molécula de zona activa en una zona activa presináptica y de un solo receptor postsináptico en una zona postsináptica para entender mejor cómo las sinapsis están regulados a un nivel mecanicista. Por otra parte, el protocolo podría ser utilizado para visualizar molecularmovimiento en las sinapsis en animales vivos. De hecho, Brp-GFP puede visualizarse sin depender de inmunotinción. Por lo tanto, el desarrollo presináptica en los axones R8 ha sido fotografiado en animales vivos con microscopía de dos fotones 15. Es posible realizar un seguimiento de la señal punteada de componentes de la zona activa en animales de vida mediante la detección y el análisis de manchas en diferentes puntos de tiempo ya que las superficies y las posiciones de neuronas específicas se definen en el protocolo.

<html> La modulación de la función sináptica contribuye a la notable capacidad del sistema nervioso para responder con precisión o adaptarse al cambio de los estímulos ambientales. Ajuste de la probabilidad de liberación de la vesícula presináptica es una forma de controlar la fuerza sináptica 1. La liberación de vesículas sinápticas se lleva a cabo en la Zona Activa (AZ), una región especializada de la membrana presináptica 2. El AZ se caracteriza por un casete de proteínas específicas 3, 4. La mayoría de las proteínas que contribuyen a la asamblea AZ están muy conservadas en los nematodos, insectos y mamíferos 5. Estudios recientes sugieren que el nivel de actividad neuronal regula la composición molecular de la AZ, que a su vez contribuye a la regulación de la salida funcional tanto in vitro como in vivo 6, 7,&gt; 8. Hemos determinado anteriormente que AZS fotorreceptoras se someten a la remodelación molecular en Drosophila después de la exposición prolongada a la luz del ambiente natural de 9. En esta condición, se observó que el número de Bruchpilot (BRP) -positivo AZS se redujo en el axones fotorreceptoras. Las proteínas Brp / REPARTO familia / ELKS son bloques de construcción fundamentales de AZS en vertebrados e invertebrados sinapsis 10. En los mutantes de Drosophila BRP, evocó la liberación de vesículas se suprime 11, 12. Los 17 residuos de aminoácidos C-terminales de Brp son esenciales para la agrupación de vesículas sinápticas en la Drosophila unión neuromuscular (NMJ) 13, 14. Estos estudios demostraron el papel central de esta molécula en la organización y la función AZ. Con una herramienta genética desarrollada recientemente, Synaptic etiquetado con recombinación (estrella), Brppuede observarse in vivo en tipos celulares específicos, en los niveles de expresión endógenos y en una sola resolución sinapsis 15. Esta herramienta hace que sea factible para evaluar la dinámica endógenos de sinapsis cuantitativamente en el sistema nervioso central complejo. Se han realizado varios estudios que incluyen cuantificaciones sinápticas en base a los datos obtenidos de la microscopía confocal. alteraciones sinápticas se han evaluado mediante la medición de la longitud, el área, el volumen, la densidad y contando el número en base a aplicaciones de software sofisticados. Por ejemplo, el software gratuito ImageJ proporciona un método de cuantificación para el área sináptica total y medidas de densidad sináptica en la Drosophila NMJ 16. El número de sitios de colocalización de los marcadores pre y post-sinápticas se han cuantificado usando el plugin &quot;puntos lagrimales Analizador&quot; disponible en la plataforma de software ImageJ 17. Alternativamente, un multi-parprograma basado adigm entorno de computación numérica, Synapse Detector (SYND), puede rastrear automáticamente dendritas de las neuronas marcadas con un marcador fluorescente, y después cuantifica los niveles de proteína sináptica como una función de la distancia desde el cuerpo celular 18. El software de análisis de Synaptic puntos lagrimales (SynPAnal), ha sido diseñado para el análisis rápido de imágenes en 2D de las neuronas adquiridas de microscopía confocal o fluorescente. La función principal de este software es la cuantificación automática y rápida de la densidad y la intensidad de puntos lagrimales proteína 19. Recientemente, un algoritmo de detección automática de sinapsis basado en el aprendizaje ha sido generada para la cuantificación del número de sináptica en 3D 20, aprovechando el software asistida por visualización 3D Análisis (Vaa3D) 21. software de análisis de imagen comercial también son herramientas poderosas para cuantificaciones sinápticas. Por ejemplo, la fluorescenciareceptores de neurotransmisores marcado o un componente AZ presináptica se han cuantificado en tres dimensiones con la resolución de una sola sinapsis en C. elegans 22 o el sistema de Drosophila olfativo 23, 24, lo que permite cientos de sinapsis que se caracteriza rápidamente dentro de una sola muestra. A continuación, presentamos un método por un software de análisis de imagen personalizada de plug-in implementado en un entorno de computación numérica multi-paradigma que permite analizar de forma semiautomática múltiples aspectos de AZS, incluyendo su número, la distribución y el nivel de enriquecimiento de los componentes moleculares de el AZ. Por lo tanto, este análisis complejo nos permitió evaluar la dinámica de los componentes sinápticos en terminales de los axones en diferentes condiciones ambientales. Se investigó el efecto de la exposición a la luz en las sinapsis de salida de los fotorreceptores de moscas adultas. El procedimiento se realiza en tres pasos: 1)preparación para la exposición a la luz, 2) la disección, inmunohistoquímica y microscopía confocal, y 3) el análisis de imágenes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vial</td>
			<td>Hightech, Japan</td>
			<td>MKC-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plug</td>
			<td>Thermo Fisher Sciehtific, USA</td>
			<td>AS-275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Customized transparent rack made of acrylic resin&#160;</td>
			<td>Shin-Shin Corporation, Japan</td>
			<td></td>
			<td>a height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cool incubator</td>
			<td>MITSUBISHI ELECTRIC, Japan</td>
			<td>CN-40A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED panel</td>
			<td>MISUMI, Japan</td>
			<td>LEDXC170-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital light meter</td>
			<td>CEM</td>
			<td>DT-1301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly pad</td>
			<td>Tokken, Japan</td>
			<td>TK-HA03-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (35 x 10 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One International, Germany</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablet</td>
			<td>Takara, Japan</td>
			<td>T900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Wako, Japan</td>
			<td>160-24751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>A. 152X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 16%</td>
			<td>NEM, Japan</td>
			<td>3152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P-200</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P-20</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P-2</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-chaoptin antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>24B10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa568-conjugated anti-mouse antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories, Inc.</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide (76 x 26 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. &#38; Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm)</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td>474030-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Industrial Microscopes</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>SZ61-C-SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope Lighting</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>KL 1600 LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>confocal microscopy</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td>LSM780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td>Version 7.6.4 or above</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>The MathWorks, Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel for Mac&#160;</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing synaptic modulation of drosophila melanogaster photoreceptors after exposure to prolonged light

El sistema nervioso tiene la notable capacidad de adaptación y respuesta a diversos estímulos. Este ajuste neuronal se logra en gran medida a través de la plasticidad sináptica en el plano. La zona activa (AZ) es la región en la membrana presináptica que media la liberación de neurotransmisores y está compuesto de una densa colección de proteínas de andamiaje. AZS de Drosophila melanogaster (Drosophila) fotorreceptores se someten a la remodelación molecular después de la exposición prolongada a la luz del ambiente natural. Así, el nivel de actividad neuronal puede reorganizar la composición molecular de la AZ y contribuir a la regulación de la salida funcional. A partir de la exposición a la luz preparado mencionado arriba a la inmunohistoquímica, detalles de este protocolo la forma de cuantificar el número, la distribución espacial y el nivel de deslocalización de las moléculas sinápticas en AZS en fotorreceptores de Drosophila. El uso de análisis de imágenes software, se identificaron grupos de la componente de GFP fusionado AZ Bruchpilot para cada fotorreceptor R8 (R8) terminal del axón. Bruchpilot manchas detectadas fueron asignados automáticamente a los axones individuales R8. Para el cálculo de la distribución de frecuencia puntual a lo largo del axón, se implementó un software personalizado plugin. punto de inicio de cada axón y punto final se definieron de forma manual y la posición de cada punto Bruchpilot se proyectan en la línea de unión entre el inicio y el punto final. Además del número de grupos Bruchpilot, también cuantificó el nivel de deslocalización de Bruchpilot-GFP dentro de los grupos. Estas mediciones reflejan en detalle la dinámica sinápticas espacialmente resueltas en una sola neurona en condiciones ambientales diferentes a los estímulos.

El ojo compuesto de Drosophila comprende ~ 780 ommatidia, conteniendo cada uno de los ocho tipos de fotorreceptores (R1-8). R7 y R8 proyecto sus axones a la segunda ganglio óptico, la médula, donde forman sinapsis en capas M6 y M3, respectivamente 26. Para investigar el efecto de la exposición prolongada a la luz sobre la composición molecular de los fotorreceptores R8 zonas activas, tomamos ventaja del método STaR 15. Los niveles de expresión endógena de Brp fueron etiquetados con fluorescencia por voltear el codón de parada en BRP-FSF-GFP con una flipasa expresado en fotorreceptores R8 derivados de la sens-flp. Las moscas se mantuvieron por 1 - 3 d después de la eclosión en LL, LD o DD para el mismo período de tiempo a 25 ° C (Figura 1A). Para exponer las moscas a la luz de 1.000 lux, las moscas fueron fijados en un bastidor de resina acrílica (Figura 1B) y se mantuvieron a la misma distanciadesde la fuente de luz LED en una pequeña incubadora (Figura 1C). Después de la inmunotinción, los cerebros disecados se colocaron en el espacio estrecho entre dos cubreobjetos sobre un portaobjetos de microscopio con el lado ventral del cerebro hacia arriba para la visualización y cuantificación de los puntos lagrimales Brp-GFP (Figura 2). La señal Brp-GFP resultante localizada en puntos lagrimales distinto dentro de R8 en la médula (Figura 3A). Para contar el número y medir la distribución de BRP-GFP puntos lagrimales, y para evaluar el nivel de deslocalización de la señal de BRP-GFP en R8s, un personalizado de análisis de imágenes de software plug-in se desarrolló en un ambiente de computación numérica multi-paradigma 9, 27. Al principio, puntos lagrimales se detectaron por una función de detección de puntos para cada R8 (Figura 3B). Posteriormente, la superficies de cada R8 se generaron para la evaluación del nivel de deslocalización (Figura 3C). Por último, se definió la creación de puntos y puntos finales en la parte superior de la capa M1 y la parte inferior de la capa de M3 en cada uno de los fotorreceptores, respectivamente, para medir la distribución AZ (Figura 3D). Objetos de superficie, manchas, comienzo de puntos y los puntos finales de dos terminales de los axones en la capa R7 M6 también se generaron para sustraer la señal de fondo de canal GFP (Figura 3E). Los resultados de la serie (Figura 4D), la distribución (Figuras 4A, 4B y 4E) y el nivel de deslocalización (Figuras 4A, 4C y 4F) se calculan automáticamente por la costumbre conector escrito en un entorno de computación numérica multi-paradigma . Se encontró que el número de puntos lagrimales Brp discreta se redujo significativamente en los fotorreceptores R8 de moscas mantenidas en condiciones LL (Figuras 4D y 4E). Añadiritionally, encontramos que las sinapsis R8 se distribuyeron a lo largo del eje axonal de la M1 a la capa de M3, pero la densidad fue mayor en las capas M1 y M3 (Figura 4E). El nivel de deslocalización de BRP-GFP se mantuvo sin cambios en todas las condiciones de luz (Figura 4F). Esto está en contraste con la localización de una manera fluorescente etiquetada versión corta de Brp (BRP-corto cereza) 28, que, como ya se ha informado 9 se convierte claramente difundida en LL (Figura 4G). Sugerimos que la señal de BRP-corto cereza deslocalizada podría estar relacionado con el procesamiento inadecuado de la BRP-fragmento corto después de desmontaje de la AZ 9. Entre otras proteínas AZ probados, con fluorescencia etiquetados unión de proteínas (DRBP) construcciones DLiprin-alfa o Drosophila Rim muestran una reducción del número de puntos lagrimales y una deslocalización clara en LL. Por el contrario, con fluorescencia etiquetados Dsyd-1 o Cacophony (CAC) hacen<html> no muestra un aumento de la señal citoplasmática incluso después de LL (Figura 4G). Por lo tanto, la medición sistemática de si la señal se convierte en citoplasmática podría ser de relevancia para entender el procesamiento de las proteínas AZ. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55176/55176fig1.jpg" /> Figura 1: Preparación de Condiciones para la exposición a la intensidad de luz definida. (A) los protocolos de exposición a la luz después de la eclosión. DD, oscuridad continua; LD, 12 h luz / 12 h oscuridad; LL, la constante exposición a la luz. Volar cerebros fueron disecados en los tiempos indicados en los soportes (adaptado de una publicación anterior 9). (B) Los viales están alineados en un estante de acrílico transparente personalizado. (C) El estante de acrílico y dos paneles LED se ponen en una pequeña incubadora y se ajustaron a exponer las moscas a una intensidad de luz de 1.000 lux.s / ftp_upload / 55176 / 55176fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55176/55176fig2.jpg" /> Figura 2: Preparación de la muestra. Montado enteros preparados cerebrales (A). (B - D) Dibujo esquemático de las preparaciones. (C, D) Las secciones transversales de las preparaciones. El lado ventral de los cerebros es de hasta (C) entre cubreobjetos (D). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55176/55176fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55176/55176fig3.jpg" /> Figura 3: Generación de los lugares, objetos de superficie y puntos de medición. <strong&gt; (A) Proyección de una pila confocal a través de las capas de la médula M1 - M6, que muestran R8s BRP-GFP puntos lagrimales (blanco) generado con la estrella 15 usando la recombinasa FLP-sens. Anti-Chaoptin (azul) pone de relieve los axones fotorreceptoras R7 y R8. Barra de escala, 5 micras. (B) Identificación de BRP-GFP puntos lagrimales por el módulo de detección de puntos para cada terminal del axón R8. (C) Detectado axón regiones ( &quot;objetos de superficie&quot;, azul) y las regiones al contado ( &quot;spot&quot; objetos, blanco) para medir el nivel de deslocalización de BRP-GFP en los axones R8. (D) La puesta en puntos y los puntos finales se establecen manualmente con la función &quot;punto de medición&quot; para definir la orientación de cada axón en el espacio 3D y definir un sistema de coordenadas en el que se proyecta el punto de BRP-GFP. (E) La superficie de los objetos, puntos, comenzar-puntos y los puntos finales para dos terminales de los axones R7 en capa M6 que no incluyen R8 se generan para restar la señal de fondodel canal de GFP. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55176/55176fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55176/55176fig4.jpg" /> Figura 4: Cuantificación del número, la distribución y la deslocalización Nivel de BRP-GFP puntos lagrimales. (A) Representación esquemática del procedimiento utilizado para medir el nivel de señal de BRP-GFP deslocalizada en el R8. Los puntos lagrimales BRP-GFP se identifican y dos zonas se definen en torno a ellos: el área de &quot;punto&quot; y el área &quot;citoplasmática&quot;. La línea de conexión de inicio y puntos finales se subdivide en 10 particiones. (B, C) de salida del personalizado de análisis de imágenes de software plug-in escrito en un entorno de computación numérica multi-paradigma. Cada punto lagrimal BRP-GFP de coordenadas se proyecta a una línea que representa la neurona de principio-poInt a punto final (B). Barra de escala, 5 micras. Los puntos lagrimales BRP-GFP se identifican y dos zonas se definen en torno a ellos: el área de &quot;punto&quot; y el área &quot;citoplasmática&quot; (C), como se esquematiza en (A). (D - F) Los gráficos de barras que comparan el número total de puntos lagrimales (D), su distribución (E) y el nivel de deslocalización de BRP-GFP por R8 axón (F) en DD (83 axones / 7 cerebros), LD (107 axones / 5 cerebros) y LL (226 axones / 15 cerebros). Gráficas (G) de barras que compara el nivel de deslocalización de BRP-corto-cereza en LD (74 axones / 7 cerebros) y LL (70 axones / 5 cerebros), GFP-DLiprin-α en LD (67 axones / 7 cerebros) y LL (52 axones / 6 cerebros), GFP-DRBP en LD (70 axones / 7 cerebros) y LL (83 axones / 6 cerebros), GFP-Dsyd-1 en LD (48 axones / 5 cerebros) y LL (69 axones / 7 cerebros), y el CAC-GFP en LD (31/5 axones cerebros) y LL (27/5 axones cerebros). *** P &lt;0,0001, ** p &lt;0,001, * p &lt;0,0<html> 5, ns p&gt; 0,05; prueba de la t no apareado con corrección de Welch de dos colas. barra de error muestra el error estándar de la media. El dibujo esquemático en (A) y los datos en (D), (E) y (G) se han adaptado de una publicación anterior 9. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55176/55176fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Suplementario de vídeo 1" src="/files/ftp_upload/55176/55176mov1.jpg" /> Vídeo suplementario: Descripción del Proceso de Datos Realizada con el Imaris Plugin &quot;Synapse Trafo&quot;. Discusión de procesamiento de datos. Este video contiene una breve conferencia para ilustrar la transformación y procesamiento de datos etapas llevadas a cabo por el Imaris plug-in &quot;synapse_trafo&quot; coordenada.5176 / theory_data_analysis_withaudio.avi &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver el vídeo. (Haga clic aquí para descargar.)

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Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Aquí mostramos cómo cuantificar el número y la distribución espacial de las zonas activas sinápticas en los fotorreceptores de Drosophila melanogaster, resaltada con un marcador molecular codificada genéticamente, y su modulación después de la exposición prolongada a la luz.

Analizando Synaptic Modulación de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Los fotorreceptores después de la exposición prolongada a la luz

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

analyzing-synaptic-modulation-drosophila-melanogaster-photoreceptors

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

6.5K vistas.  Niigata University.  Aquí mostramos cómo cuantificar el número y la distribución espacial de las zonas activas sinápticas en los fotorreceptores de Drosophila melanogaster, resaltada con un marcador molecular codificada genéticamente, y su modulación después de la exposición prolongada a la luz. 

Video: Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

Visualización en vivo de las vesículas sinápticas En Drosophila segmentaria axones larvas

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Investigación

Neurociencias

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenético estimulación de comportamiento de escape en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

Determinación de la actividad locomotora espontánea en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a straightforward manner. As we previously demonstrated 1, in a two-dimensional chamber, we first force the flies to form a tight group, subsequently allowing them to take their preferred distance from each other. After the flies have settled, we measure the distance to the closest neighbor (or social space), processing a static picture with free online software (ImageJ). The analysis of the distance to the closest neighbor allows researchers to determine the effects of genetic and environmental factors on social interaction, while controlling for potential confounding factors. Diverse factors such as climbing ability, time of day, sex, and number of flies, can modify social spacing of flies. We thus propose a series of experimental controls to mitigate these confounding effects. This assay can be used for at least two purposes. First, researchers can determine how their favorite environmental shift (such as isolation, temperature, stress or toxins) will impact social spacing 1,2. Second, researchers can dissect the genetic and neural underpinnings of this basic form of social behavior 1,3. Specifically, we used it as a diagnostic tool to study the role of orthologous genes thought to be involved in social behavior in other organisms, such as candidate genes for autism in humans 4.

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The effect of genes and environment on social space of Drosophila melanogaster can be quantified through a powerful but straightforward analytical paradigm. We show here different factors that can affect this social space, and thus need to be taken into consideration when designing experiments in this paradigm.

Condiciones que afectan Espacio Social en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

Ensayo de Alto Rendimiento para el Examen de Preferencias de la puesta de huevos individual<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral variation. The larval path-length assay was developed to measure individual differences in foraging behavior that were later linked to the foraging gene. Larval path-length is an easily scored trait that facilitates the collection of large sample sizes, at minimal cost, for genetic screens. Here we provide a detailed description of the current protocol for the larval path-length assay first used by Sokolowski. The protocol details how to reproducibly handle test animals, perform the behavioral assay and analyze the data. An example of how the assay can be used to measure behavioral plasticity in response to environmental change, by manipulating feeding environment prior to performing the assay, is also provided. Finally, appropriate test design as well as environmental factors that can modify larval path-length such as food quality, developmental age and day effects are discussed.

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

Forrajeo Protocolo Ruta de longitud de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Las larvas

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Método electrofisiológico para registrar las respuestas de voltaje intracelular<em&gt; Drosophila</em&gt; Los fotorreceptores y interneuronas a la luz Estímulos<em&gt; En Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.

Método electrofisiológico para grabaciones de abrazadera de voltaje de células enteras<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Desensitization and Recovery of Crayfish Photoreceptors Upon Delivery of a Light Stimulus

A method to study desensitization and recovery of crayfish photoreceptors is presented. We performed intracellular electrical recordings of photoreceptor cells in isolated eyestalks using the discontinuous single electrode-switched voltage-clamp configuration. First, with a razor blade we made an opening in the dorsal cornea to get access to the retina. Thereafter, we inserted a glass electrode through the opening, and penetrated a cell as reported by the recording of a negative potential. Membrane potential was clamped at the photoreceptor's resting potential and a light-pulse was applied to activate currents. Finally, the two light-flash protocol was employed to measure current desensitization and recovery. The first light-flash triggers, after a lag period, the transduction ionic current, which after reaching a peak amplitude decays towards a desensitized state; the second flash, applied at varying time intervals, assesses the state of the light-activated conductance. To characterize the light-elicited current, three parameters were measured: 1) latency (the time elapsed between light flash delivery and the moment in which current achieves 10% of its maximum value); 2) peak current; and 3) desensitization time constant (exponential time constant of the current decay phase). All parameters are affected by the first pulse.
To quantify recovery from desensitization, the ratio p2/p1 was employed versus time between pulses. p1 is the peak current evoked by the first light-pulse, and p2 is the peak current evoked by the second pulse. These data were fitted to a sum of exponential functions. Finally, these measurements were carried out as function of circadian time.

A protocol for the study of desensitization and sensitivity recovery of crayfish photoreceptors as a function of circadian time is presented.

Desensibilización y recuperación de fotorreceptores de cangrejo de río tras la entrega de un estímulo ligero

A method to study desensitization and recovery of crayfish photoreceptors is presented. We performed intracellular electrical recordings of photoreceptor ...

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Protein aggregation is a central feature of most neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease (PD), Huntington&#39;s disease (HD), and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Protein aggregates are closely associated with neuropathology in these diseases, although the exact mechanism by which aberrant protein aggregation disrupts normal cellular homeostasis is not known. Emerging data provide strong support for the hypothesis that pathogenic aggregates in AD, PD, HD, and ALS have many similarities to prions, which are protein-only infectious agents responsible for the transmissible spongiform encephalopathies. Prions self-replicate by templating the conversion of natively-folded versions of the same protein, causing spread of the aggregation phenotype. How prions and prion-like proteins in AD, PD, HD, and ALS move from one cell to another is currently an area of intense investigation. Here, a Drosophila melanogaster model that permits monitoring of prion-like, cell-to-cell transmission of mutant huntingtin (Htt) aggregates associated with HD is described. This model takes advantage of powerful tools for manipulating transgene expression in many different Drosophila tissues and utilizes a fluorescently-tagged cytoplasmic protein to directly report prion-like transfer of mutant Htt aggregates. Importantly, the approach we describe here can be used to identify novel genes and pathways that mediate spreading of protein aggregates between diverse cell types in vivo. Information gained from these studies will expand the limited understanding of the pathogenic mechanisms that underlie neurodegenerative diseases and reveal new opportunities for therapeutic intervention.

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Accumulating evidence supports the idea that pathogenic protein aggregates associated with neurodegenerative diseases spread between cells with prion-like properties. Here, we describe a method that enables visualization of cell-to-cell spreading of prion-like aggregates in the model organism, Drosophila melanogaster.