אנו מודים ט סטרנר עבור תיקונים מועילים, דיוני הערות על כתב היד; SL Zipursky למתן מניות לטוס; M Schölling לביצוע עיבוד תמונה. חלק ניתוח התמונה בוצע במעבדה של א Kakita. עבודה זו נתמכה על ידי אלכסנדר פון הומבולדט קרן JSPs מלגות למחקר בחו&quot;ל (AS), עמיתי JSPs (SH-S.), גרנט-in-Aid עבור Start-up (24,800,024), על תחומים חדשניים (25,110,713), Mochida, טאקדה, Inamori, Daiichi Sankyo-, יסודות אליפות טוראי (TS), מימון הליבה DZNE (GT) ו DZNE מתקן מיקרוסקופית אור (CM).

הפרוצדורות המתוארות בפרוטוקול זה כרוך עובדים אך ורק עם תסיסנית ואינם כפופות לחוקים רווחים בעלי חיים בגרמניה וביפן. 1. תנאי חשיפה לאור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן זבובים שנושאים-flippase sensless (sens-FLP) ו bruchpilot-FRT-STOP-FRT-GFP (BRP-FSF-GFP) 15 המאפשר הדמיה BRP-GFP בנוירונים R8 קולטי האור (R8s). BRP קידוד מוקד גנומית בתוך כרומוזום בקטריאלי מלאכותי (BAC) שונה כדי ליצור מבנה זה BRP-FSF-GFP. בשנת הזבובים הנושאים BAC השונה זה הביטוי של BRP-GFP נמצא תחת השליטה של הרצפים רגולטוריים אנדוגני, אבל מוגבל קולטני אור R8 לאחר הסרה בתיווך sensless-flippase של קלטת FRT-STOP-FRT 15. שים לב sens-FLP לעתים רחוקות מבטא flippase ב R7s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על זבובי li h 12ght / 12 שעות חושך מחזור (LD) במהירות של 25 ° C משלב הזחל עד eclosion (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף הזבובים 6 - 0 שעות לאחר eclosion ולהכניס אותם לתוך בקבוקון חדש המכיל אוכל לטוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את צלוחיות לתוך מתלה שקוף עשוי שרף אקרילי עם שלושה שלבים (לגובה של 41 ס&quot;מ, בסיס של 21 ס&quot;מ, עובי של 4 ס&quot;מ וגובה של 13 ס&quot;מ לכל שלב) (איור 1 ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את המרחק בין המתלה ולוח LED לספק את התאורה בעצמה ממוצעת של 1,000 לוקס באמצעות מד אור דיגיטלי (התרשים 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על זבובים 1 - 3 ד תחת אחד מהתנאים הבאים: בחשכה מתמדת (DD), 12 אור H / 12 שעות חושך מחזור (LD), או אור קבוע (LL) של 25 מעלות צלזיוס חממה קטנה (איורים 1 א ו 1C). </li></ol> 2. Dissection, אימונוהיסטוכימיה והדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח מוחות זבוב עם מלקחיים, לתקן אותם עם 4% FOrmaldehyde ו immunostain עם הנוגדן הראשוני נגד Chaoptin (1:50) ו נוגדן שני להדמיה של קולטני האור המבוסס על פרוצדורות קודמות 25. בקצרה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 0.1% Triton X-100 ב PBS (0.1% PBT). פתרון זה משמש כדי לשפר חדירה לרקמות נוגדן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים זבובים על כרית CO 2, למיין את הגנוטיפ הנכון ולהעבירם צלחת פטרי המלאה 0.1% PBT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היצמד המלקחיים מתחת החוטם ולמשוך את העיניים ימינה ושמאלה בהתאמה עם המלקחיים האחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חוטם ואת קנה הנשימה המחובר למוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את המוח עם מלקחיים לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל המכיל 150 μL של PBT 0.1% ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך 10 דקות חוזרים מ 2.1.3 - 2.1.5 להשיג מוחות רבים ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL של פורמלדהיד 16% לתוך הצינור ומערבבים ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת המוח מקבע ב חדרהטמפרטורה במשך 50 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים עם 200 μL של 0.1% PBT עם micropipette, שם לב לעזוב את המוח בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף האחרון, להסיר את PBT 0.1% ולהוסיף פתרון הנוגדן הראשוני, מוכן כדלקמן: להוסיף 196 μL של 0.3% PBT (0.3% Triton X-100 ב PBS) 4 μL של נוגדנים נגד Chaoptin (דילול סופי 1 : 50) להדמיה של קולטני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת המוח בפתרון הנוגדן הראשוני ב 4 ° CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3x לשטוף עם 200 μL של PBT 0.1% עם micropipette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף האחרון, להסיר את PBT 0.1% ולהוסיף 200 μL של PBT 0.3% המכיל נוגדנים משני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה זה בחושך ב 4 ° CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים עם 200 μL של PBT 0.1% עם micropipette. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הרכבה, לשים שתי טיפות קטנות (2 μL כל אחת) של הרכבה בינונית עם micropipette במרכז של המיקרוסקופ שקופית בכ 2 ס&quot;מ distaNCE אחד מהשני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים שתי coverslips, אחד על כל טיפה ולהשאיר רווח צר בין coverslips של כ 0.2 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח 15 μL של מדיום גובר על גבי coverslip ומוסיף את המוח עם micropipette לתוך המדיום הגובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, מקם את המוח עם הצד הגחוני למעלה אל במרווח הצר שבין שני coverslips (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip על גבי וסוגרים את הקצוות של coverslip באמצעות לק ברור לתקן את הדגימה (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג תמונות של המוח באמצעות מיקרוסקופ confocal. השתמש עדשה אובייקטיבית טבילת 63X שמן (1.4 NA) ו זום דיגיטלי 2.6X. צור יותר מ -20 חלקים אופטיים של לשד גנגליון השני האופטי עם גודל צעד של 0.5 מיקרומטר. </li></ol> דור 3. של הכתמים, אובייקטי Surface, Start-נקודות-נקודות קצה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת את המספר, distribution ורמת delocalization של puncta BRP-GFP, לפתוח את המחסנית מתקבלת על ידי מיקרוסקופיה confocal בתוכנות ניתוח תמונה ולגבש מחדש תמונות 3D (איור 3 א). ראוי לציין, כי הצעד במחקר זה בוצע עם Imaris. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את puncta BRP-GFP על ידי מודול זיהוי נקודה עבור כל מסוף האקסון R8. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;הוסף כתמים חדשים&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;מגזר רק אזור של אינטרס&quot; בהגדרות האלגוריתם. בחר מסוף האקסון R8 ב לשד באופן ידני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחרו בערוץ מקור האות BRP-GFP. הערה: אקסונים קולטי האור R7 ו R8 היו immunolabeled עם (איור 3 א) נגד Chaoptin. רק R8, אם כי, מכיל puncta BRP-GFP ויכול ובכך להבחין בקלות (איור 3 א). יתר על כן, נקודת הסיום של R8 יכול להיות מזוהה על ידי הדילול של אקסונים אנטי החיוביים-Chaoptin בנקודת הכניסה לתוך השכבה לשד M3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את t בקוטר XY מוערךo 0.35 מיקרומטר ולטמן &quot;חיסור רקע&quot; באיתור המקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;איכות&quot; בסוג לסנן ולסנן באופן אוטומטי. מכן לחץ על סיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור מ 3.2.1 T- 3.2.5 עבור אקסונים R אחרים (איור 3 ב). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את רמת delocalization של BRP-GFP אקסונים R8, ליצור אובייקטים משטח עם הפונקציה &quot;Surface&quot; לכל האקסון (איור 3 ג). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;הוסף משטחים חדשים&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;מגזר רק אזור של אינטרס&quot; בהגדרות האלגוריתם. ואז לבחור מסופי האקסון R8 ב לשד באופן ידני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחרו בערוץ המקור של קולטני האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את &quot;חלקה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;אינטנסיביות מוחלטת&quot; הסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק &quot;הפעל&quot;. &quot;זרע נקודות קוטר&quot; הוא 0.5 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוג &quot;איכות&quot; מסנן בחר &quot;מספר ווקסלים&quot;, ולאחר מכן לסנן אוטומציהקאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש להקליק על &quot;ערוך&quot; ולמחוק את החלקים של משטחים שנוצרו על אקסונים אחרים שאינם מעניינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור מ 3.3.1 - 3.3.8 עבור אקסונים R אחרים (איור 3 ג). הערה כמה חפצי משטח נקטעו בגלל הרזון ואת האות החלשה קולטני אור ב שכבת M2, אבל הם עדיין נחשבו כאובייקט יחיד מהתחילה ועד לנקודות קצה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות את חלוקת puncta BRP-GFP לאורך כל נוירון neuropil המוארך, להגדיר את נקודת ההתחלה ואת נקודת הסיום עם נקודת פונקציה מדידה (איור 3D). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;הוסף נקודות מדידה חדשות&quot;. לאחר מכן בחר &quot;ערוך&quot; ובחר &quot;Surface של אובייקט&quot; כדי לחתוך עם החלק העליון של אובייקטי השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים נקודות מדידה על גבי חפצי שטח של אקסונים R בשכבת M1 כדי. אלה מוגדרים כיום-נקודות התחלה (איור 3D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;הוסף נקודות מדידה חדשות&quot;.לאחר מכן בחר &quot;ערוך&quot; ובחר &quot;Surface של אובייקט&quot; כדי לחתוך עם התחתונים של אובייקטי השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים נקודות מדידה על התחתונים של אובייקטי השטח של אקסונים R בשכבת M3 כדי. אלה מוגדרים כיום נקודות קצה (איור 3D). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפחית את אות הרקע מערוץ GFP, ליצור אובייקטים השטח, כתמים, סטארט-נקודות נקודות קצה עבור שני אקסונים R בשכבה M6 (איור 3E). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;הוסף משטחים חדשים&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;מגזר רק אזור של אינטרס&quot; בהגדרות האלגוריתם. לאחר מכן בחר מסוף האקסון R7 בין שכבת M5 ו M6 ידני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחרו בערוץ מקור קולטי האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את &quot;חלקה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;אינטנסיביות מוחלטת&quot; הסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר סוג מסנן &quot;איכות&quot; ו &quot;מספר ווקסלים&quot;, ואז לסנן באופן אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;הוסף כתמים חדשים&quot;;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;דלג על יצירה אוטומטית, לערוך באופן ידני&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;מרכז של אובייקט&quot; ולהוסיף נקודה באזור הפנימי של האובייקט משטח המופק 3.5.1 - 3.5.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור מ 3.5.1 - 3.5.9 לעוד מסוף האקסון R7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;הוסף נקודות מדידה חדשות&quot;. לאחר מכן בחר &quot;ערוך&quot; ולשים נקודות מדידה על גבי שני אובייקטי השטח של קצה האקסון מסוף R7 בשכבת M6. אלה הם עכשיו מוגדר-נקודות התחלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;הוסף נקודות מדידה חדשות&quot;. לאחר מכן בחר &quot;ערוך&quot; ולשים נקודות מדידה על החלק התחתון של שני אובייקטי השטח של קצה האקסון מסוף R7 בשכבת M6. אלה מוגדרים כיום נקודות קצה (איור 3E). </li></ol></li></ol> 4. חישוב מספר הכתמים, הפצה של תדר ספוט ודרג העשרת BRP-GFP עם תמונה אישית תוכנת ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העתק את הקובץ&quot;XtquantifySynapseSNR.m&quot; ואת התיקייה &quot;פונקציות&quot; לתוך תיקיית matlab XT Imaris. ראוי לציין, כי החישוב במחקר זה בוצע באמצעות תוסף אישית מיושם ב- Matlab. הורד את התוסף מהאתר ( <a href="https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo" target="_blank">https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח במערך עם n נקודות, n משטחים ו -2 חפצי נקודת מדידה, כל נקודות מדידת n המכילות (שהוכנו 3.1 - 3.4). מטרת נקודת המדידה הראשונה מגדירה את מיקומי ההתחלה עבור כל האקסונים. מטרת נקודת המדידה השנייה מגדירה את מיקום הסיום של כל האקסונים. שני אובייקטים נקודת המדידה צריכים יש את אותו מספר של נקודות המדידה (כלומר מספר אקסונים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Execute עיבוד תמונה &gt;&gt; CUSTOM&gt; atsushis זיהוי סינפסה Vs 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק metadata ולשנות בגדלי פיקסל תוכנת ניתוח תמונה במקרה זה אינו נכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ערוץ עבור Performance של הניתוח העוצם אזורים כתמים ואזורי cytoplasmic (הערוץ עם BRP-GFP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את שם הקובץ לייצוא התוצאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מספר פחי ואורך האקסון באחוזים. הזן את מספר הפחים כמו &quot;10&quot; ומגוון פחים כמו &quot;100%&quot; (איורי 4 א ו -4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את האזורים של הכתמים באזורים ציטופלסמית האחרים לניתוח delocalization BRP-GFP. זן כתמי רדיוס כמו &quot;0.35 מיקרומטר&quot; ורוחב של השטח המקיף אותה כמו &quot;50 מיקרומטר&quot;. רדיוס כתמים מגדיר באזור לאות GFP puncta (0.35 מיקרומטר קוטר, התרכזו פונקטום אחד). רוחב השטח המקיף אותה מגדיר באזור לאות GFP באזור cytoplasmic (50 מיקרומטר קוטר, מרוכז על פונקטום, אבל כולל רק R8 ולמעט בכל תחומי נקודה בציטופלסמה) (תרשימים 4 א ו 4C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה עד שכל מסכות נוירון מעובדותוייצא כקובצי PDF (איורים 4 ב ו 4C) ושולחן CSV לניתוח נוסף בגיליון אלקטרוני. טבלת CSV הכוללת את מספר הנקודות, את עוצמת האות הממוצעת של &quot;שטח cytoplasmic&quot; ואת עוצמת האות המרבית &quot;נקודה&quot; בכל bin עבור כל האקסונים R8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח במערך ערוך 3.5 לגריעת אות הרקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע עיבוד תמונה כמו נפרשים מימי 4.3 - 4.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את הממוצע של מספר הכולל והחלוקה של puncta BRP-GFP בתוך (4D דמויות 4E) גיליון אלקטרוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב הממוצע של delocalization של האות BRP-GFP בגיליון אלקטרוני על ידי היחס בין עוצמת הממוצע של &quot;שטח cytoplasmic&quot; מחולק העוצמה המקסימלית של &quot;נקודה&quot; מופחתים מעוצמת הממוצע אות הרקע (איור 4F) . </li></ol>

<ol>
	<li>Alabi, A. A., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+Vesicle+Pools+and+Dynamics.">Synaptic Vesicle Pools and Dynamics.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (8), (2012).</li><li>Couteaux, R., Pecot-Dechavassine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Synaptic+vesicles+and+pouches+at+the+level+of+&amp;#34;active+zones&amp;#34;+of+the+neuromuscular+junction].">[Synaptic vesicles and pouches at the level of &amp;#34;active zones&amp;#34; of the neuromuscular junction].</a> C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 271 (25), 2346-2349 (1970).</li><li>Schoch, S., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+organization+of+the+presynaptic+active+zone.">Molecular organization of the presynaptic active zone.</a> Cell and Tissue Research. 326 (2), 379-391 (2006).</li><li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Presynaptic+Active+Zone.">The Presynaptic Active Zone.</a> Neuron. 75 (1), 11-25 (2012).</li><li>Owald, D., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembling+the+presynaptic+active+zone.">Assembling the presynaptic active zone.</a> Curr Opin Neurobiol. 19 (3), 311-318 (2009).</li><li>Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+remodeling+of+the+presynaptic+cytomatrix+upon+homeostatic+adaptation+to+network+activity+silencing.">Extensive remodeling of the presynaptic cytomatrix upon homeostatic adaptation to network activity silencing.</a> J Neurosci. 31 (28), 10189-10200 (2011).</li><li>Matz, J., Gilyan, A., Kolar, A., McCarvill, T., Krueger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+structural+alterations+of+the+active+zone+lead+to+sustained+changes+in+neurotransmitter+release.">Rapid structural alterations of the active zone lead to sustained changes in neurotransmitter release.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (19), 8836-8841 (2010).</li><li>Spangler, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liprin-alpha2+promotes+the+presynaptic+recruitment+and+turnover+of+RIM1/CASK+to+facilitate+synaptic+transmission.">Liprin-alpha2 promotes the presynaptic recruitment and turnover of RIM1/CASK to facilitate synaptic transmission.</a> J Cell Biol. 201 (6), 915-928 (2013).</li><li>Sugie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Remodeling+of+the+Presynaptic+Active+Zone+of+Drosophila+Photoreceptors+via+Activity-Dependent+Feedback.">Molecular Remodeling of the Presynaptic Active Zone of Drosophila Photoreceptors via Activity-Dependent Feedback.</a> Neuron. 86 (3), 711-725 (2015).</li><li>Sigrist, S. J., Schmitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+plasticity+of+the+cytoplasmic+active+zone.">Structural and functional plasticity of the cytoplasmic active zone.</a> Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 144-150 (2011).</li><li>Kittel, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+zone+assembly+and+synaptic+release.">Active zone assembly and synaptic release.</a> Biochem Soc Trans. 34 (Pt 5), 939-941 (2006).</li><li>Kittel, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot+promotes+active+zone+assembly,+Ca2++channel+clustering,+and+vesicle+release.">Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release.</a> Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).</li><li>Hallermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naked+dense+bodies+provoke+depression.">Naked dense bodies provoke depression.</a> J Neurosci. 30 (43), 14340-14345 (2010).</li><li>Wagh, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot,+a+protein+with+homology+to+ELKS/CAST,+is+required+for+structural+integrity+and+function+of+synaptic+active+zones+in+Drosophila.">Bruchpilot, a protein with homology to ELKS/CAST, is required for structural integrity and function of synaptic active zones in Drosophila.</a> Neuron. 49 (6), 833-844 (2006).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+labeling+of+synapses+in+vivo+through+synaptic+tagging+with+recombination.">Cell-type-specific labeling of synapses in vivo through synaptic tagging with recombination.</a> Neuron. 81 (2), 280-293 (2014).</li><li>Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+Drosophila+larval+neuromuscular+junction+morphology.">Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (4), 490-493 (2012).</li><li>Ippolito, D. M., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+synapses:+an+immunocytochemistry-based+assay+to+quantify+synapse+number.">Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li><li>Schmitz, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+neuronal+morphology,+synapse+number+and+synaptic+recruitment.">Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment.</a> J Neurosci Methods. 195 (2), 185-193 (2011).</li><li>Danielson, E., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SynPAnal:+software+for+rapid+quantification+of+the+density+and+intensity+of+protein+puncta+from+fluorescence+microscopy+images+of+neurons.">SynPAnal: software for rapid quantification of the density and intensity of protein puncta from fluorescence microscopy images of neurons.</a> PLoS One. 9 (12), e115298 (2014).</li><li>Sanders, J., Singh, A., Sterne, G., Ye, B., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning-guided+automatic+three+dimensional+synapse+quantification+for+drosophila+neurons.">Learning-guided automatic three dimensional synapse quantification for drosophila neurons.</a> BMC Bioinformatics. 16, 177 (2015).</li><li>Peng, H., Ruan, Z., Atasoy, D., Sternson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+reconstruction+of+3D+neuron+structures+using+a+graph-augmented+deformable+model.">Automatic reconstruction of 3D neuron structures using a graph-augmented deformable model.</a> Bioinformatics. 26 (12), i38-i46 (2010).</li><li>Sturt, B. L., Bamber, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+quantification+of+synaptic+fluorescence+in+C.+elegans.">Automated quantification of synaptic fluorescence in C. elegans.</a> J Vis Exp. (66), (2012).</li><li>Kremer, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+long-term+changes+at+mushroom+body+input+synapses.">Structural long-term changes at mushroom body input synapses.</a> Curr Biol. 20 (21), 1938-1944 (2010).</li><li>Mosca, T. J., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+organization+of+the+Drosophila+antennal+lobe+and+its+regulation+by+the+Teneurins.">Synaptic organization of the Drosophila antennal lobe and its regulation by the Teneurins.</a> Elife. 3, e03726 (2014).</li><li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining.">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).</li><li>Fischbach, K. F., Dittrich, A. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Optic+Lobe+of+Drosophila-Melanogaster+.1+A+Golgi+Analysis+of+Wild-Type+Structure.">The Optic Lobe of Drosophila-Melanogaster .1 A Golgi Analysis of Wild-Type Structure.</a> Cell and Tissue Research. 258 (3), 441-475 (1989).</li><li>Berger-Muller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+role+of+cell-surface+molecules+in+central+synaptogenesis+in+the+Drosophila+visual+system.">Assessing the role of cell-surface molecules in central synaptogenesis in the Drosophila visual system.</a> PLoS One. 8 (12), e83732 (2013).</li><li>Fouquet, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+active+zone+assembly+by+Drosophila+Bruchpilot.">Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot.</a> J Cell Biol. 186 (1), 129-145 (2009).</li><li>Ke, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-Resolution+Mapping+of+Neuronal+Circuitry+With+an+Index-Optimized+Clearing+Agent.">Super-Resolution Mapping of Neuronal Circuitry With an Index-Optimized Clearing Agent.</a> Cell Rep. 14 (11), 2718-2732 (2016).</li><li>Ehmann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+super-resolution+imaging+of+Bruchpilot+distinguishes+active+zone+states.">Quantitative super-resolution imaging of Bruchpilot distinguishes active zone states.</a> Nat Commun. 5, 4650 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

במחקר זה, הראינו כיצד להכין את תנאי התאורה לחשוף זבובים אל עוצמת אור שווה. אנחנו לכמת לא רק את המספר של puncta סמן הסינפטי אלא גם יכולים מרחבית לפתור את הצפיפות של סינפסות לאורך אקסונים למדוד את רמת delocalization של חלבון הסמן באזורי cytoplasmic. הערכות שלוש אלה מאפשרים לנו להעריך את הפרטים של דינמיקה הסינפטי ברמת נוירון הבודדה בתנאים סביבתיים שונים. הפרוטוקול שלנו יכול להיות מותאם חלבונים סינפטיים שונים אלא גם לכל נתונים המכילים אותות punctate. שלב קריטי בתוך הפרוטוקול הוא ההרכבה של המוח. קולטני אור תסיסנית להקרין האקסונים שלהם אל לשד גנגליון השני האופטי. האקסון קולטי אור כל ניתן לסרוק בצורה ישירה אם המוח הרכוב הונח כראוי בשקופית מיקרוסקופ. ההרכבה הנכונה גם עושה את הבחירה של קולטני אור עם Softwa ניתוח תמונהמחדש פונקציות קלות. יש באזור קולטי אור כל אשר ייבחר ידני לספירה במספר וברמת delocalization של puncta. סטארט נקודות קצה הם גם שנבחרו באופן ידני. תכשירים אלה דורשים זמן רב יחסית עד אחד יכול להמשיך כימות. היתרון של אקסונים R8 הוא שהם unbranched וכל האקסון R8 הוא נפרד. תא עצב בודד פשוט כמו זה מומלץ עבור יישומים אלה שכן יש צורך להגדיר את האזור המדויק של הנוירון. בנוסף, זה עוזר להיפטר של puncta הספציפי ומשטחים נגזרים נוירונים אחרים. מגבלה בגישה זו, עם זאת, היא העומק של הקרנת z. עוצמת האות של puncta מקבלת פחות בשכבות עמוקות יותר של מחסנית z. הכנת מוח שקוף בשיטות ניקוי רקמות כזה SeeDB2 29 עשויה לעזור להתגבר על מגבלה זו ולאפשר הדמיה של אות punctate ברורה עוד יותר במוח. פרוטו שלנוcol יכול לשמש לניתוח ארגון הסינפטי ב בקנה מידה ננו ועם הדמיה לחיות. שילוב הדמיה סופר-רזולוציה (למשל, מגורה דלדול פליטה (STED) מיקרוסקופיה, מיקרוסקופית שיקום אופטיים סטוכסטיים (STORM), מיקרוסקופיה לוקליזציה מופעל צילום (PALM), מיקרוסקופיה תאורה מובנה (SIM) וכו &#39;) עם מודלים תיאורטיים התקדמה הבנתנו את מבנה ודינמיקה מולקולרית של סינפסות. לדוגמה, הארגון הננוסקופי של BRP הוערך ברזולוציה חד מולקולריות עם הדמיה סופר-רזולוציה בסערה ישירה (STORM ד) על תסיסנית NMJ 30. הפרוטוקול שלנו הותאם כימות של דינמיקה של מולקולת אזור פעילה אחד בכל אזור presynaptic הפעיל של קולטן postsynaptic יחיד בכל אזור postsynaptic כדי להבין יותר כיצד סינפסות מוסדרים ברמה מכניסטית. יתר על כן, הפרוטוקול שלנו יכול לשמש כדי לחזות מולקולריתנועה ב סינפסות ב בעלי חיים. למעשה, BRP-GFP ניתן דמיינו ללא הסתמכות על immunostaining. לפיכך, פיתוח presynaptic אקסונים R8 כבר צלם בבעלי חיים עם מיקרוסקופיה שני פוטונים 15. אפשר לעקוב אחר אות punctate של רכיבי אזור פעילים חיות בעלות על ידי איתור והניתוח כתם בנקודות זמן שונות מאז המשטחים והעמדות של נוירונים ספציפיים מוגדרים בפרוטוקול שלנו.

<html> האפנון של פונקציה סינפטי תורם ליכולת המדהימה של מערכת העצבים להגיב בדיוק או להסתגל לשינוי לגירויים סביבתיים. התאמת הסתברות שחרור שלפוחית presynaptic היא אחת דרכים של שליטת כוח הסינפטי 1. שחרור שלפוחית סינפטית מתקיים האיזור הפעיל (AZ), אזור מיוחד של הקרום presynaptic 2. AZ מאופיין קסטה של חלבונים ספציפיים 3, 4. רוב החלבונים תורמים הרכבת AZ הם שמורים ביותר נמטודות, חרקים ויונקים 5. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי רמת הפעילות העצבית מסדיר את ההרכב המולקולרי של AZ, אשר בתורו תורם הסדרת פלט פונקציונלי הן במבחנה in vivo 6, 7,&gt; 8. מצאנו בעבר כי AZS קולטי האור לעבור שיפוץ מולקולרי תסיסנית לאחר חשיפה ממושכת לאור 9 הסביבה טבעית. במצב זה, צפינו שמספר Bruchpilot (BRP) -positive AZS הופחת אקסונים קולטי האור. החלבונים המשפחה BRP / CAST / Elks הם אבני הבניין הבסיסיות של AZS סינפסות חוליות ונטול עצמות 10. מוטנטים תסיסנית BRP, עורר שחרור שלפוחית מדוכא 11, 12. 17 שאריות חומצת אמינו C- מסוף של BRP חיוניים אשכולות שלפוחית סינפטית בצומת Neuromuscular תסיסנית (NMJ) 13, 14. מחקרים אלה הוכיחו את תפקידה המרכזי של מולקולה זו בארגון AZ ותפקוד. עם כלי גנטי שפותח לאחרונה, Synaptic תיוג עם רקומבינציה (כוכב), BRPניתן להבחין in vivo ב סוגי תאים מסוימים, ברמות ביטוי אנדוגני ברזולוציה סינפסה אחת 15. כלי זה עושה את זה אפשרי להעריך את הדינמיקה אנדוגני של סינפסות כמותית במערכת העצבים המרכזית המורכבת. היו מספר מחקרים כולל quantifications סינפסה על בסיס נתונים המתקבלים מן מיקרוסקופיה confocal. שינויי Synaptic הוערכו על ידי מדידת האורך, באזור, ההיקף, הצפיפות וספירת המספר המבוססים על יישומי תוכנה מתוחכמים. למשל, ImageJ החופשית מספקת שיטת כימות לאזור הסינפטי הכולל ואמצעי צפיפות הסינפטי ב תסיסנית NMJ 16. מספר האתרים colocalization של סמנים טרום postsynaptic כבר לכמת באמצעות התוסף &quot;Analyzer puncta&quot; זמין על פלטפורמת ImageJ תוכנה 17. לחלופין, א-נקוב רבתכנית מבוססת סביבת מחשוב המספרית adigm, גלאי סינפסה (synd), יכולה לעקוב אחר דנדריטים של נוירונים שכותרתו אוטומטית עם סמן פלואורסצנטי, ולאחר מכן מכמתת את רמות החלבון הסינפטי כפונקציה של מרחק מגוף התא 18. תוכנת Synaptic puncta הניתוח (SynPAnal), תוכננה עבור הניתוח המהיר של תמונות 2D של נוירונים רכשו במיקרוסקופ confocal או פלואורסצנטי. התפקיד העיקרי של תוכנה זו היא כימות אוטומטית ומהירה של צפיפות ועוצמת חלבון puncta 19. לאחרונה, אלגוריתם זיהוי סינפסה אוטומטית מבוססי למידה נוצר כימות של מספר הסינפטי ב -3 D 20, ניצול של 3D ויזואליזציה בסיוע ניתוח (Vaa3D) תוכנה 21. תוכנת ניתוח תמונה מסחרית הם גם כלים רבים עצמה עבור quantifications הסינפטי. למשל, fluorescentlyקולטני הנוירוטרנסמיטר שכותרתו או רכיב AZ presynaptic כבר לכמת בשלושה ממדים עם ברזולוציה יחיד סינפסה ב C. elegans 22 או מערכת חוש הריח תסיסנית 23, 24, המאפשר מאות סינפסות להתאפיין במהירות בתוך מדגם יחיד. כאן, אנו מציגים שיטה ידי תוכנת ניתוח תמונה אישית תוספת מיושמת בסביבת מחשוב מספרית רבה הפרדיגמה המאפשרת לנתח חצי אוטומטית מגוון רחב של אספקטי AZS, לרבות מספרם, הפצה ברמת ההעשרה של רכיבים מולקולריים במדריך המפות. לפיכך, ניתוח מורכב זה אפשר לנו להעריך את הדינמיקה של רכיבים סינפטיים במסופי האקסון בתנאים סביבתיים שונים. חקרנו את שפעת חשיפת אור על סינפסות הפלט של קולטני אור זבוב בוגר. ההליך מתבצע בשלושה שלבים: 1)לקראת חשיפה לאור, 2) לנתיחה, אימונוהיסטוכימיה ו הדמיה confocal, ו -3) ניתוח התמונה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vial</td>
			<td>Hightech, Japan</td>
			<td>MKC-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plug</td>
			<td>Thermo Fisher Sciehtific, USA</td>
			<td>AS-275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Customized transparent rack made of acrylic resin&#160;</td>
			<td>Shin-Shin Corporation, Japan</td>
			<td></td>
			<td>a height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cool incubator</td>
			<td>MITSUBISHI ELECTRIC, Japan</td>
			<td>CN-40A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED panel</td>
			<td>MISUMI, Japan</td>
			<td>LEDXC170-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital light meter</td>
			<td>CEM</td>
			<td>DT-1301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly pad</td>
			<td>Tokken, Japan</td>
			<td>TK-HA03-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (35 x 10 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One International, Germany</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablet</td>
			<td>Takara, Japan</td>
			<td>T900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Wako, Japan</td>
			<td>160-24751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>A. 152X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 16%</td>
			<td>NEM, Japan</td>
			<td>3152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P-200</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P-20</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P-2</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-chaoptin antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>24B10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa568-conjugated anti-mouse antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories, Inc.</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide (76 x 26 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. &#38; Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm)</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td>474030-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Industrial Microscopes</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>SZ61-C-SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope Lighting</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>KL 1600 LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>confocal microscopy</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td>LSM780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td>Version 7.6.4 or above</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>The MathWorks, Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel for Mac&#160;</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing synaptic modulation of drosophila melanogaster photoreceptors after exposure to prolonged light

מערכת העצבים יש את היכולת המדהימה להסתגל ולהגיב לגירויים שונים. התאמה עצבית זו מושגת בעיקר באמצעות פלסטיות ברמה הסינפטי. האיזור הפעיל (AZ) הוא האזור על הממברנה presynaptic שמתווך שחרור הנוירוטרנסמיטר והוא מורכב מאוסף צפוף של חלבוני פיגום. AZS של תסיסנית (דרוזופילה) קולטני אור לעבור שיפוץ מולקולרי לאחר חשיפה ממושכת לאור הסביבה טבעי. כך רמת הפעילות עצבית יכולה לארגן מחדש את ההרכב המולקולרי של AZ ולתרום הסדרת הפלט הפונקציונלי. החל מ בהכנת הגדרת חשיפה לאור על אימונוהיסטוכימיה, פרוטוקול זה מפרט כיצד לכמת את המספר, את הפריסה המרחבית, ורמת delocalization של מולקולות הסינפטי AZS ב קולטני האור תסיסנית. באמצעות ניתוח תמונה software, אשכולות של רכיב AZ-התמזג GFP Bruchpilot זוהו עבור כל קולטי אור R8 מסוף האקסון (R8). זוהו כתמי Bruchpilot חולקו באופן אוטומטי אקסונים R8 פרט. כדי לחשב את חלוקת תדר נקודה לאורך האקסון, יישמנו תוסף תוכנה מותאם אישית. כל סטארט-נקודת הקצה של האקסון הוגדרו באופן ידני ואת המיקום של כל נקודה ונקודת Bruchpilot היה מוקרן על הקו המחבר בין התחלת נקודת סיום. מלבד מספר אשכולות Bruchpilot, אנחנו גם לכמת את רמת delocalization של Bruchpilot-GFP בתוך אשכולות. מדידות אלה משקפים בפירוט את הדינמיקה הסינפטי נפתרה מרחבית ב נוירון בודד בתנאים סביבתיים שונים לגירויים.

העין המתחמת של תסיסנית מורכבת ~ 780 האומטידיה, שכל אחת מהן מכיל שמונה סוגים של קולטני אור (R1-8). R7 ו R8 פרויקט האקסונים שלהם אל גנגליון השני האופטי, הלשד, שם הם יוצרים סינפסות בשכבות M6 ו M3, בהתאמה 26. כדי לחקור את ההשפעה של חשיפה ממושכת אור על ההרכב המולקולרי של אזורי R8 קולטי האור פעיל, לקחנו את היתרון של שיטת הכוכבים 15. רמות ביטוי אנדוגני של BRP תויגו fluorescently ידי מרפרף את קודון עצירה ב BRP-FSF-GFP עם flippase לידי ביטוי קולטני האור R8 נגזר sens-FLP. הזבובים הוחזקו במשך 1 - 3 ד לאחר eclosion ב LL, LD או DD לאותו פרק זמן של 25 מעלות צלזיוס (איור 1 א). כדי לחשוף את הזבובים 1,000 Lux אור, הזבובים היו התקבעו מתל שרף אקרילי (האיור 1B) והמשיכו באותו המרחקממקור אור LED חממה קטנה (איור 1 ג). לאחר immunostaining, המוח גזור הונחו לתוך הפער הצר שבין שני coverslips בשקופית מיקרוסקופ עם הצד הגחוני של המוח כלפי מעלה להדמיה וכימות של puncta BRP-GFP (איור 2). האות BRP-GFP וכתוצאה מקומי puncta נבדלת בתוך R8 ב (איור 3 א) לשד. כדי לספור את המספר ולמדוד את חלוקת puncta BRP-GFP, וכדי להעריך את רמת delocalization של אות BRP-GFP ב R8s, תוסף תוכנה לניתוח תמונה אישית פותח בסביבת מחשוב מספרית רב הפרדיגמה 9, 27. בהתחלה, puncta אותרו על ידי פונקציית זיהוי מקום לכל R8 (איור 3 ב). בהמשך לכך, שטחהים של כל R8 נוצר עבור הערכת רמת delocalization (איור 3 ג). לבסוף, הגדרנו סטארט-נקודות נקודות קצה בראש שכבת M1 והחלק התחתון של שכבת M3 על כל קולטי האור בהתאמה למדוד את חלוקת AZ (איור 3D). אובייקטים Surface, כתמים, סטארט-נקודות נקודות קצה עבור שני מסופי האקסון R7 בשכבה M6 נוצרו גם כדי להפחית את אות הרקע מערוץ GFP (איור 3E). התוצאות של המספר (האיור 4D), חלוקה (איורי 4 א, 4 ב ו 4E) ורמת delocalization (איורים 4 א, 4C ו 4F) מחושבות באופן אוטומטי על ידי מנהג תוספת בכתב בסביבת מחשוב מספרית רבה הפרדיגמה . מצאנו כי מספר puncta דיסקרטית BRP הופחת משמעותית קולטני האור R8 של זבובים לפי תנאי האריזה LL (4D דמויות 4E). לְהוֹסִיףitionally, מצאנו כי סינפסות R8 חולקו לכל אורך פיר axonal מן M1 לשכבה M3, אבל הצפיפות הייתה גבוהה בשכבות M1 ו- M3 (איור 4E). רמת delocalization של BRP-GFP נותר ללא שינוי בכל תנאי האור (איור 4F). זאת בניגוד ל לוקליזציה של fluorescently מתויג גרסה קצרה של BRP (BRP-קצר-דובדבן) 28, אשר, כפי שכבר דיווחנו בעבר 9 הופך מתפזרת בבירור LL (איור 4G). הצענו את האות BRP-קצר-דובדבן delocalized עשויים להיות קשורים עיבוד הולם של שבר BRP-קצר לאחר פירוק מן AZ 9. בין חלבוני AZ בדוקים אחרים, fluorescently מתויג DLiprin-α או תסיסנית רים חלבון מחייב (DRBP) בונה להציג צמצום מספר puncta וכן delocalization ברור LL. לעומת זאת, fluorescently מתויג Dsyd-1 או קקופוניה (CAC) לעשות<html> לא להציג אות cytoplasmic מוגברת גם לאחר LL (איור 4G). לפיכך, מדידה שיטתית אם האות הופך ציטופלסמית עשויים להיות רלוונטי גם להבין את העיבוד של חלבוני AZ. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55176/55176fig1.jpg" /> איור 1: הכנת תנאי חשיפה עוצמת אור מוגדר. (א) פרוטוקולים חשיפה לאור לאחר eclosion. DD, חושך רציף; LD, 12 שעות אור / 12 כהה h; LL, חשיפה מתמדת לאור. מוח לעוף נותחו במועדים המצוינים בסוגריים (מעובד מתוך פרסום קודם 9). בקבוקי (B) מיושרים מתלה שקוף אקריליק אישית. (ג) מתל אקריליק ושני לוחות LED מוכנסים בתוך חממה קטנה והותאמנו לחשוף את הזבובים על עוצמת אור של 1,000 לוקס.s / ftp_upload / 55,176 / 55176fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55176/55176fig2.jpg" /> איור 2: הכנת הדגימה. (א) הכנות מוח רכובים פריטים. (B - D) ציור סכמטי של ההכנות. (C, D) בחתכים של ההכנות. הצד הגחוני של המוח הוא עד (ג) בין coverslips (D). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55176/55176fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55176/55176fig3.jpg" /> איור 3: הדור של כתמים, אובייקטים ועיבוד משטחים נקודות מדידה. <strong&gt; (א) הטלה של מחסנית confocal דרך שכבות לשד M1 - M6, מראה R8s BRP-GFP puncta (לבן) שנוצר עם כוכבים 15 באמצעות recombinase sens-FLP. Anti-Chaoptin (כחול) מדגיש את האקסונים קולטי האור R7 ו R8. סרגל קנה מידה, 5 מיקרומטר. (ב) זיהוי של puncta BRP-GFP על ידי מודול זיהוי נקודה עבור כל מסוף האקסון R8. (C) זוהה האקסון אזורים ( &quot;חפצים Surface&quot;, כחול) ואזורים נקודה ( &quot;חפצים ספוט&quot;, לבן) למדידת רמת delocalization של BRP-GFP אקסונים R8. (ד) סטארט-נקודות נקודות קצה נקבעים באופן ידני עם &quot;נקודת מדידה&quot; הפונקציה כדי להגדיר כל האוריינטציה של האקסון בחלל 3D ולהגדיר מערכת קואורדינטות שעליו במקום BRP-GFP מוקרנים. (ה) המשטח חפץ, כתמים, סטארט-נקודות נקודות קצה עבור שני מסופי האקסון R7 ב שכבת M6 שאינו כוללים R8 נוצרת כדי להפחית את אות הרקעשל ערוץ ה- GFP. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55176/55176fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55176/55176fig4.jpg" /> איור 4: כימות של המספר, ההפצה Delocalization הרמה של BRP-GFP puncta. (א) ציור סכמטי של הליך מנוצל כדי למדוד את רמת האות BRP-GFP delocalized ב R8. Puncta BRP-GFP מזוהים ושני אזורים מוגדרים סביבם: באזור &quot;נקודה&quot; ואזור &quot;cytoplasmic&quot;. הקו המחבר סטארט נקודות קצה מתחלק ב 10 מחיצות. (B, C) פלט מן תוסף תוכנה לניתוח תמונה אישית בכתב בסביבת מחשוב מספרית רבה פרדיגמה. כל פונקטום BRP-GFP קואורדינטות צפוי קו המייצג את נוירון מ-פו ההתחלהint לסיים נקודות (B). סרגל קנה מידה, 5 מיקרומטר. Puncta BRP-GFP מזוהים ושני אזורים מוגדרים סביבם: באזור &quot;נקודה&quot; ואזור &quot;cytoplasmic&quot; (C), כמו schematized ב (א). (D - F) גרפים בר להשוות את המספר הכולל של puncta (D), תפוצתם (E) ורמת delocalization של BRP-GFP לכל האקסון R8 (F) ב DD (83 אקסונים / 7 המוח), LD (107 אקסונים / 5 המוח) ול&quot;ל (226 אקסונים / 15 מוחות). (G) גרפים בר השוואה של רמת delocalization של דובדבן BRP-קצר LD (74 אקסונים / 7 המוח) ול&quot;ל (70 אקסונים / 5 המוח), GFP-DLiprin-α ב LD (67 אקסונים / 7 המוח) ול&quot;ל (52 אקסונים / 6 המוח), GFP-DRBP ב LD (70 אקסונים / 7 המוח) ול&quot;ל (83 אקסונים / 6 המוח), GFP-Dsyd-1 ב LD (48 אקסונים / 5 המוח) ול&quot;ל (69 אקסונים / 7 מוח), ו CAC-GFP ב LD (31 אקסונים / 5 מוח) ול&quot;ל (27 אקסונים / 5 מוח). *** P &lt;0.0001, ** p &lt;0.001, * p &lt;0.0<html> 5, ns p&gt; 0.05; מבחן t מזווג עם התיקון של וולש שני זנב. שגיאת עמודות מציגות שגיאת התקן של הממוצע. הציור הסכמטי ב (א) ואת הנתונים (ד), (ה) ו- (ז) מעובדים מנתונים פרסום קודם 9. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55176/55176fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="משלימה וידאו 1" src="/files/ftp_upload/55176/55176mov1.jpg" /> וידאו משלימה: תיאור של עיבוד הנתונים נערכים עם תוסף Imaris &quot;סינפסה Trafo&quot;. דיון של עיבוד נתונים. סרטון זה כולל הרצאה קצרה על מנת להמחיש את לתאם מדרגות עיבוד טרנספורמציה ונתונים שבוצעו על ידי תוסף Imaris &quot;synapse_trafo&quot;.5176 / theory_data_analysis_withaudio.avi &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light at JoVE.com

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

כאן אנו מראים כיצד לכמת את מספר הפריסה המרחבית של אזורי הפעילות הסינפטית קולטני האור תסיסנית, הדגיש עם סמן מולקולרי מקודדים גנטית, אפנון שלהם לאחר חשיפה ממושכת לאור.

ניתוח Synaptic אפנון של<em&gt; תסיסנית</em&gt; קולטני אור לאחר חשיפה לאור ממושך

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

analyzing-synaptic-modulation-drosophila-melanogaster-photoreceptors

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

6.5K Views.  Niigata University.  כאן אנו מראים כיצד לכמת את מספר הפריסה המרחבית של אזורי הפעילות הסינפטית קולטני האור תסיסנית, הדגיש עם סמן מולקולרי מקודדים גנטית, אפנון שלהם לאחר חשיפה ממושכת לאור. 

Video: Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

בשנת vivo ויזואליזציה של שלפוחית ​​Synaptic בתוך האקסונים תסיסנית המגזרי הזחל

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

גירוי Optogenetic של התנהגות בריחה ב<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

קביעת הפעילות של תנועה הספונטנית ב<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a straightforward manner. As we previously demonstrated 1, in a two-dimensional chamber, we first force the flies to form a tight group, subsequently allowing them to take their preferred distance from each other. After the flies have settled, we measure the distance to the closest neighbor (or social space), processing a static picture with free online software (ImageJ). The analysis of the distance to the closest neighbor allows researchers to determine the effects of genetic and environmental factors on social interaction, while controlling for potential confounding factors. Diverse factors such as climbing ability, time of day, sex, and number of flies, can modify social spacing of flies. We thus propose a series of experimental controls to mitigate these confounding effects. This assay can be used for at least two purposes. First, researchers can determine how their favorite environmental shift (such as isolation, temperature, stress or toxins) will impact social spacing 1,2. Second, researchers can dissect the genetic and neural underpinnings of this basic form of social behavior 1,3. Specifically, we used it as a diagnostic tool to study the role of orthologous genes thought to be involved in social behavior in other organisms, such as candidate genes for autism in humans 4.

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The effect of genes and environment on social space of Drosophila melanogaster can be quantified through a powerful but straightforward analytical paradigm. We show here different factors that can affect this social space, and thus need to be taken into consideration when designing experiments in this paradigm.

תנאים המשפיעים על המרחב חברתי ב<em&gt; תסיסנית melanogaster</em

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

Assay תפוקה גבוהה לבחינת העדפות הטלה של פרט<em&gt; תסיסנית</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral variation. The larval path-length assay was developed to measure individual differences in foraging behavior that were later linked to the foraging gene. Larval path-length is an easily scored trait that facilitates the collection of large sample sizes, at minimal cost, for genetic screens. Here we provide a detailed description of the current protocol for the larval path-length assay first used by Sokolowski. The protocol details how to reproducibly handle test animals, perform the behavioral assay and analyze the data. An example of how the assay can be used to measure behavioral plasticity in response to environmental change, by manipulating feeding environment prior to performing the assay, is also provided. Finally, appropriate test design as well as environmental factors that can modify larval path-length such as food quality, developmental age and day effects are discussed.

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

פרוטוקול נתיב באורך שארגן לעצמו<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

שיטת אלקטרו עבור תגובות מתח תאיים הקלטה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; קולטני אור ו interneurons יאירו גירויים<em&gt; In vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.

שיטה אלקטרו-קולית לקולקציית מתח מלא<em&gt; תסיסנית</em&gt; פוטורספטורים

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Desensitization and Recovery of Crayfish Photoreceptors Upon Delivery of a Light Stimulus

A method to study desensitization and recovery of crayfish photoreceptors is presented. We performed intracellular electrical recordings of photoreceptor cells in isolated eyestalks using the discontinuous single electrode-switched voltage-clamp configuration. First, with a razor blade we made an opening in the dorsal cornea to get access to the retina. Thereafter, we inserted a glass electrode through the opening, and penetrated a cell as reported by the recording of a negative potential. Membrane potential was clamped at the photoreceptor's resting potential and a light-pulse was applied to activate currents. Finally, the two light-flash protocol was employed to measure current desensitization and recovery. The first light-flash triggers, after a lag period, the transduction ionic current, which after reaching a peak amplitude decays towards a desensitized state; the second flash, applied at varying time intervals, assesses the state of the light-activated conductance. To characterize the light-elicited current, three parameters were measured: 1) latency (the time elapsed between light flash delivery and the moment in which current achieves 10% of its maximum value); 2) peak current; and 3) desensitization time constant (exponential time constant of the current decay phase). All parameters are affected by the first pulse.
To quantify recovery from desensitization, the ratio p2/p1 was employed versus time between pulses. p1 is the peak current evoked by the first light-pulse, and p2 is the peak current evoked by the second pulse. These data were fitted to a sum of exponential functions. Finally, these measurements were carried out as function of circadian time.

A protocol for the study of desensitization and sensitivity recovery of crayfish photoreceptors as a function of circadian time is presented.

הפחתת רגישות והתאוששות של סרטן הנהרות בעת העברת גירוי באור

A method to study desensitization and recovery of crayfish photoreceptors is presented. We performed intracellular electrical recordings of photoreceptor ...

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Protein aggregation is a central feature of most neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease (PD), Huntington&#39;s disease (HD), and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Protein aggregates are closely associated with neuropathology in these diseases, although the exact mechanism by which aberrant protein aggregation disrupts normal cellular homeostasis is not known. Emerging data provide strong support for the hypothesis that pathogenic aggregates in AD, PD, HD, and ALS have many similarities to prions, which are protein-only infectious agents responsible for the transmissible spongiform encephalopathies. Prions self-replicate by templating the conversion of natively-folded versions of the same protein, causing spread of the aggregation phenotype. How prions and prion-like proteins in AD, PD, HD, and ALS move from one cell to another is currently an area of intense investigation. Here, a Drosophila melanogaster model that permits monitoring of prion-like, cell-to-cell transmission of mutant huntingtin (Htt) aggregates associated with HD is described. This model takes advantage of powerful tools for manipulating transgene expression in many different Drosophila tissues and utilizes a fluorescently-tagged cytoplasmic protein to directly report prion-like transfer of mutant Htt aggregates. Importantly, the approach we describe here can be used to identify novel genes and pathways that mediate spreading of protein aggregates between diverse cell types in vivo. Information gained from these studies will expand the limited understanding of the pathogenic mechanisms that underlie neurodegenerative diseases and reveal new opportunities for therapeutic intervention.

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Accumulating evidence supports the idea that pathogenic protein aggregates associated with neurodegenerative diseases spread between cells with prion-like properties. Here, we describe a method that enables visualization of cell-to-cell spreading of prion-like aggregates in the model organism, Drosophila melanogaster.