Siamo grati a T. Stürner per correzioni utili, discussioni e commenti sul manoscritto; SL Zipursky per la fornitura di scorte Fly; M Scholling per eseguire l&#39;elaborazione delle immagini. Parte della analisi delle immagini è stata effettuata presso il laboratorio di A. Kakita. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Alexander von Humboldt e JSP borse per la ricerca all&#39;estero (AS), JSPS Fellows (SH-S.), Gli aiuti Grant-In- per start-up (24.800.024), su aree innovative (25.110.713), Mochida, Takeda, Inamori, Daiichi Sankyo-, Fondazioni Toray (TS), finanziamento di base DZNE (GT) e DZNE luce Microscopia Facility (CM).

Le procedure sperimentali descritte in questo protocollo si riferiscono a lavori esclusivamente con Drosophila e non sono soggetti alle leggi sul benessere degli animali in Germania e Giappone. 1. Condizioni espozione <ol><li> Preparare le mosche che portano sensless-flippase (sens-FLP) e Bruchpilot-FRT-STOP-FRT-GFP (BRP-FSF-GFP) 15 per la visualizzazione di BRP-GFP in fotorecettori neuroni R8 (R8s). Il BRP codifica locus genomico all&#39;interno di un cromosoma artificiale batterico (BAC) è stato modificato per generare questo costrutto BRP-FSF-GFP. Nelle mosche che portano questo BAC modificato l&#39;espressione di BRP-GFP è sotto il controllo delle sequenze regolatorie endogene, ma limitato a fotorecettori R8 dopo sensless-flippase rimozione mediata della cassetta FRT-STOP-FRT 15. Si noti che sens-FLP raramente esprime flippase in R7s. </li><li> Mantenere le mosche in un 12 h LiSinistra / 12 h buio ciclo (LD) a 25 ° C dalla fase di larva fino eclosion (Figura 1A). </li><li> Raccogliere le mosche 0 - 6 ore dopo eclosion e metterli in un nuovo flacone contenente cibo mosca. </li><li> Impostare le fiale in un rack trasparente fatta di resina acrilica con tre gradini (una altezza di 41 cm, una base di 21 cm, uno spessore di 4 cm e un&#39;altezza di 13 cm per ogni passo) (Figura 1B). </li><li> Regolare la distanza tra la cremagliera e un pannello a LED per fornire l&#39;illuminazione con un&#39;intensità media di 1,000 lux utilizzando un misuratore digitale della luce (Figura 1C). </li><li> Conservare le mosche per 1 - 3 d sotto una delle seguenti condizioni: buio costante (DD), 12 h luce / 12 h buio ciclo (LD), o luce costante (LL) a 25 ° C in un piccolo incubatore (figure 1A e 1C). </li></ol> 2. Dissezione, immunoistochimica e Imaging <ol><li> Sezionare il cervello mosca con una pinza, fissarli con il 4% formaldehyde e immunostain con l&#39;anticorpo primario contro Chaoptin (1:50) ed un secondo anticorpo per la visualizzazione dei fotorecettori basato su precedenti procedure sperimentali 25. Brevemente: <ol><li> Preparare 0,1% Triton X-100 in PBS (0,1% PBT). Questa soluzione viene utilizzata per migliorare la penetrazione tissutale anticorpi. </li><li> Anestetizzare le mosche su un blocco di CO 2, risolvere il genotipo corretto e trasferirli in una capsula di Petri riempite con 0,1% PBT. </li><li> Stick la pinza sotto la proboscide e tirare fuori gli occhi a destra ea sinistra, rispettivamente, con le altre pinze. </li><li> Rimuovere la proboscide e la trachea attaccato al cervello. </li><li> Trasferire il cervello con le pinze in una provetta da 1,5 ml contenente 150 ml di 0,1% PBT a temperatura ambiente. </li><li> Entro 10 minuti ripetere da 2.1.3 - 2.1.5 per ottenere il maggior numero possibile di cervelli. </li><li> Aggiungere 50 ml di 16% di formaldeide nel tubo e mescolare pipettando. </li><li> Incubare il cervello in fissativo a cameratemperatura per 50 min. </li><li> Lavare tre volte con 200 ml di 0,1% PBT con una micropipetta, facendo attenzione a lasciare il cervello nel tubo. </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio, rimuovere il PBT 0,1% e aggiungere la soluzione di anticorpo primario, preparato come segue: aggiungere a 196 ml di 0,3% PBT (0,3% Triton X-100 in PBS) 4 ml di anticorpo anti-Chaoptin (diluizione finale 1 : 50) per la visualizzazione dei fotorecettori. </li><li> Incubare le cervelli in soluzione di anticorpo primario a 4 ° CO / N. </li><li> Lavare 3x con 200 ml di 0,1% PBT con una micropipetta. </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio, rimuovere il PBT 0,1% e aggiungere 200 microlitri del PBT 0,3% contenente un anticorpo secondario. </li><li> Incubare al buio a 4 ° CO / N. </li><li> Lavare tre volte con 200 ml di 0,1% PBT con una micropipetta. </li></ol></li><li> Per il montaggio, mettere due piccole gocce (2 ml ciascuna) di un mezzo di montaggio con una micropipetta al centro di un vetrino da microscopio a 2 cm circa distaSNO uno dall&#39;altro. </li><li> Mettere due lamelle, una su ogni goccia e lasciare uno spazio ristretto tra i vetrini di circa 0,2 mm. </li><li> Mettere 15 ml di un mezzo di montaggio sulla parte superiore del vetrino e aggiungere i cervelli con una micropipetta nel mezzo di montaggio. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione, posizionare il cervello con il lato ventrale nello stretto spazio tra le due coprioggetto (Figura 2). </li><li> Posizionare un vetrino sulla parte superiore e sigillare i bordi del coprioggetto con smalto trasparente per fissare il campione (Figura 2). </li><li> Ottenere immagini del cervello con un microscopio confocale. Utilizzare un obiettivo 63X olio di immersione obiettivo (1,4 NA) e uno zoom digitale 2.6X. Generare più di 20 sezioni ottiche della seconda medulla ganglio ottica con un passo di 0,5 micron. </li></ol> 3. Generazione dei luoghi, oggetti superficie, avviamento punti e End-point <ol><li> Per quantificare il numero, la distribution e il livello di delocalizzazione di BRP-GFP puncta, aprire la pila ottenuta mediante microscopia confocale in immagine software di analisi e ricostituiscono immagini 3D (Figura 3a). Si noti che il passo in questo studio è stato effettuato con Imaris. </li><li> Identificare il puncta BRP-GFP dal modulo di rilevazione posto per ogni terminale assone R8. <ol><li> Selezionare &quot;Aggiungere nuovi spot&quot;. </li><li> Selezionare &quot;Segmento solo una regione di interesse&quot; nelle impostazioni algoritmo. Selezionare un terminale assone R8 nel midollo manualmente. </li><li> Selezionare il canale sorgente del segnale BRP-GFP. NOTA: Gli assoni dei fotorecettori R7 e R8 sono stati immunolabeled con anti-Chaoptin (Figura 3A). Solo R8, però, contiene BRP-GFP puncta e potrebbe quindi essere facilmente distinto (figura 3A). Inoltre, il punto finale della R8 potrebbe essere identificato con l&#39;assottigliamento degli assoni anti-Chaoptin-positivi al punto di entrata nello strato midollare M3. </li><li> Impostare il diametro XY t stimatoo 0,35 micron e spuntare &quot;Sfondo sottrazione&quot; nella rilevazione posto. </li><li> Selezionare &quot;Qualità&quot; nel tipo di filtro e filtrare automaticamente. Quindi fare clic su Fine. </li><li> Ripetere dal 3.2.1 T 3.2.5 per altri assoni R (figura 3b). </li></ol></li><li> Per misurare il livello di delocalizzazione di BRP-GFP in assoni R8, generare oggetti di superficie con la funzione di &quot;Surface&quot; per ogni assone (Figura 3C). <ol><li> Selezionare &quot;Aggiungere nuove superfici&quot;. </li><li> Selezionare &quot;Segmento solo una regione di interesse&quot; nelle impostazioni algoritmo. Quindi selezionare manualmente un R8 terminali degli assoni nel midollo. </li><li> Selezionare il canale fonte dei fotorecettori. </li><li> Controllare off &quot;liscio&quot;. </li><li> Selezionare &quot;Intensity assoluto&quot; della soglia. </li><li> Selezionare &quot;Attiva&quot;. &quot;Punti di semi Diameter&quot; è di 0,5 micron. </li><li> Selezionare il filtro tipo &quot;Qualità&quot; e &quot;Numero di voxel&quot;, e poi filtrare automaticamente. </li><li> Vai su &quot;Modifica&quot; ed eliminare i pezzi di superfici generate da altri assoni non interessanti. </li><li> Ripetere da 3.3.1 - 3.3.8 per altri assoni R (Figura 3C). Nota Alcuni oggetti di superficie sono stati interrotti a causa della magrezza e il segnale debole in fotorecettori a livello M2, ma erano ancora considerati come un unico oggetto, dall&#39;inizio alla punti finali. </li></ol></li><li> Per identificare la distribuzione di BRP-GFP puncta lungo ogni neurone nel neuropil midollo, definire l&#39;inizio-point e punto finale con la funzione di punto di misura (Figura 3D). <ol><li> Selezionare &quot;Aggiungere nuovi punti di misura&quot;. Quindi selezionare &quot;Modifica&quot; e selezionare &quot;Surface di oggetto&quot; per intersecarsi con la parte superiore degli oggetti di superficie. </li><li> Mettere punti di misurazione in cima oggetti superficie di assoni R a strato M1 in ordine. Questi sono ora definiti come start-punti (Figura 3D). </li><li> Selezionare &quot;Aggiungere nuovi punti di misura&quot;.Quindi selezionare &quot;Modifica&quot; e selezionare &quot;Surface di oggetto&quot; per intersecarsi con la parte inferiore degli oggetti di superficie. </li><li> Mettere punti di misura sul fondo degli oggetti superficie di assoni R a strato M3 in ordine. Questi sono ora definiti come end-point (Figura 3D). </li></ol></li><li> Per sottrarre il segnale di fondo dal canale GFP, generare oggetti superficie, macchie, start-punti e end-point per due assoni R a M6 strato (Figura 3E). <ol><li> Selezionare &quot;Aggiungere nuove superfici&quot;. </li><li> Selezionare &quot;Segmento solo una regione di interesse&quot; nelle impostazioni algoritmo. Quindi selezionare manualmente un terminale assone R7 tra M5 e M6 strato. </li><li> Selezionare il canale fonte del fotorecettore. </li><li> Controllare off &quot;liscio&quot;. </li><li> Selezionare &quot;Intensity assoluto&quot; della soglia. </li><li> Selezionare il tipo di filtro &quot;Qualità&quot; e &quot;Numero di voxel&quot;, poi filtrare automaticamente. </li><li> Selezionare &quot;Aggiungere nuovi spot&quot;;. </li><li> Selezionare &quot;Salta la creazione automatica, modificare manualmente&quot;. </li><li> Selezionare &quot;Centro di oggetto&quot; e aggiungere un posto nella zona interna dell&#39;oggetto superficie generata dalla 3.5.1 - 3.5.6. </li><li> Ripetere da 3.5.1 - 3.5.9 per un altro terminale assone R7. </li><li> Selezionare &quot;Aggiungere nuovi punti di misura&quot;. Quindi selezionare &quot;Edit&quot; e mettere i punti di misurazione sulla parte superiore dei due oggetti superficie della punta del terminale assone R7 nello strato M6. Questi sono ora definiti come start-punti. </li><li> Selezionare &quot;Aggiungere nuovi punti di misura&quot;. Quindi selezionare &quot;Edit&quot; e mettere punti di misura sul fondo dei due oggetti superficie della punta del terminale assone R7 nello strato M6. Questi sono ora definiti come end-point (Figura 3E). </li></ol></li></ol> 4. Il calcolo del numero di macchie, distribuzione della frequenza di spot e il livello di arricchimento di BRP-GFP con un&#39;immagine personalizzata Data Analysis Software <ol><li> Copiare il file&quot;XtquantifySynapseSNR.m&quot; e la cartella &quot;funzioni&quot; nella cartella MATLAB Imaris XT. Si noti che il calcolo in questo studio è stato eseguito con un plugin personalizzato implementato in Matlab. Scarica il plugin dal sito web ( <a href="https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo" target="_blank">https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo</a> ). </li><li> Aprire un set di dati con n macchie, n superfici e 2 oggetti punto di misura, ognuno contenente punti n misura (preparati 3,1-3,4). Il primo oggetto punto di misurazione definisce le posizioni di partenza per tutti gli assoni. Il secondo oggetto punto di misura definisce la posizione finale di tutti assoni. Entrambi gli oggetti punto di misura devono avere lo stesso numero di punti di misura (cioè il numero di assoni). </li><li> Eseguire l&#39;elaborazione delle immagini &gt;&gt; CUSTOM&gt; atsushis rilevamento sinapsi Vs 6. </li><li> Controllare metadati e modificare le dimensioni dei pixel nel software di analisi delle immagini nel caso in cui non è corretto. </li><li> Selezionare il canale per la performance dell&#39;analisi intensità delle regioni macchie e delle regioni citoplasmatici (il canale con BRP-GFP). </li><li> Definire il nome del file per l&#39;esportazione dei risultati. </li><li> Definire il numero di contenitori e la lunghezza degli assoni in percentuale. Inserire il numero di bin come &quot;10&quot; e la gamma di contenitori come &quot;100%&quot; (le figure 4A e 4B). </li><li> Definire le regioni delle macchie e le altre regioni citoplasmatici per l&#39;analisi delocalizzazione BRP-GFP. Inserire i punti di raggio come &quot;0.35 micron&quot; e la larghezza della zona come &quot;50 micron&quot; circostante. Il raggio spot definisce la regione per il segnale puncta GFP (0,35 micron di diametro, centrato su un punctum). La larghezza della zona circostante definisce la regione per il segnale GFP nell&#39;area citoplasmatica (50 micron di diametro, centrata su lacrimale, ma includendo solo R8 ed escludendo tutte le aree piatte nel citoplasma) (figure 4A e 4C). </li><li> Attendere fino a quando tutte le maschere dei neuroni vengono elaboratied esportati come file PDF (figure 4B e 4C) e un tavolo CSV per ulteriori analisi in un foglio di calcolo. La tabella csv comprende il numero dei punti, l&#39;intensità media del segnale in &quot;zona citoplasmatica&quot; e l&#39;intensità massima del segnale in &quot;spot&quot; in ciascun bin per tutti gli assoni R8. </li><li> Aprire un set di dati preparato in 3.5 per sottrazione del segnale di fondo. </li><li> Eseguire l&#39;elaborazione delle immagini, come descritto 4,3-4,9. </li><li> Calcolare la media del numero totale e la distribuzione del puncta BRP-GFP in un foglio di calcolo (figure 4D e 4E). </li><li> Calcolare la media della delocalizzazione segnale Brp-GFP in un foglio per il rapporto tra l&#39;intensità media nella &quot;zona citoplasmatica&quot; divisa per l&#39;intensità massima nel &quot;spot&quot; sottratto dall&#39;intensità media del segnale di fondo (Figura 4F) . </li></ol>

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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-Resolution+Mapping+of+Neuronal+Circuitry+With+an+Index-Optimized+Clearing+Agent.">Super-Resolution Mapping of Neuronal Circuitry With an Index-Optimized Clearing Agent.</a> Cell Rep. 14 (11), 2718-2732 (2016).</li><li>Ehmann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+super-resolution+imaging+of+Bruchpilot+distinguishes+active+zone+states.">Quantitative super-resolution imaging of Bruchpilot distinguishes active zone states.</a> Nat Commun. 5, 4650 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

In questo studio, abbiamo mostrato come preparare le condizioni di luce per esporre le mosche a un&#39;intensità di luce uguali. Abbiamo quantificato non solo il numero di un puncta marcatore sinaptica, ma potrebbe anche spazialmente risolvere la densità delle sinapsi lungo gli assoni e misurare il livello di delocalizzazione della proteina marcatore nelle zone citoplasmatici. Questi tre valutazioni ci permettono di valutare i dettagli di dinamiche sinaptiche a livello dei neuroni singolo in diverse condizioni ambientali. Il nostro protocollo può essere adattato a diverse proteine ​​sinaptiche, ma anche tutti i dati che contiene segnali puntiformi. Un passo fondamentale all&#39;interno del protocollo è il montaggio dei cervelli. Fotorecettori Drosophila proiettano i loro assoni alla seconda midollare ganglio ottico. Ogni assone fotorecettore possibile eseguire la scansione semplicemente se i cervelli montati sono stati collocati correttamente su un vetrino da microscopio. Il montaggio corretto rende anche la selezione dei fotorecettori con l&#39;analisi dell&#39;immagine software funzioni più semplici. Ogni regione fotorecettore deve essere selezionato manualmente per contare il numero e delocalizzazione livello di puncta. I punti finali di inizio e vengono selezionati anche manualmente. Queste preparazioni richiedono un tempo relativamente lungo finché si può procedere alla quantificazione. Il vantaggio di R8 assoni è che sono ramificati e ogni assone R8 è separata. Un semplice neurone isolato come questo è consigliato per queste applicazioni in quanto è necessario per definire l&#39;area esatta del neurone. Inoltre, questo aiuta a sbarazzarsi di puncta aspecifica e superfici derivate da altri neuroni. Una limitazione di questo approccio, tuttavia, è la profondità della proiezione z. L&#39;intensità del segnale puncta diventa meno negli strati più profondi della z stack. Preparazione cervelli trasparenti con metodi di tessuto-eliminazione di un tale SeeDB2 29 potrebbe aiutare a superare questo limite e consentire l&#39;imaging di un segnale chiaro puntata ancora più profondo nel cervello. Il nostro protoCol può potenzialmente essere utilizzato per analizzare l&#39;organizzazione sinaptica su scala nano e con immagini dal vivo. La combinazione di imaging super-risoluzione (ad esempio, stimolata esaurimento emissione (STED) microscopia, la microscopia stocastico ricostruzione ottica (Storm), photo attivato la localizzazione microscopia (PALM), l&#39;illuminazione strutturata microscopia (SIM) etc.) con la modellazione teorica ha avanzato la nostra comprensione del struttura e dinamica molecolare delle sinapsi. Per esempio, l&#39;organizzazione nanoscopica di Brp è stata valutata con una risoluzione single-molecolare con immagini super-risoluzione STORM diretta (d Storm) alla Drosophila NMJ 30. Il nostro protocollo è stato adattato per la quantificazione della dinamica di una singola molecola zona attiva alla zona attiva presinaptica e di un singolo recettore postsinaptico corrispondenza di una zona postsinaptico comprendere ulteriormente come sinapsi sono regolati ad un livello meccanicistico. Inoltre, il protocollo potrebbe essere utilizzato per visualizzare molecolaremovimento alla sinapsi in animali viventi. In realtà, BRP-GFP può essere visualizzato senza fare affidamento su immunocolorazione. Così, lo sviluppo pre-sinaptico negli assoni R8 è stato ripreso di animali vivi con microscopia a due fotoni 15. È possibile monitorare il segnale puntata di componenti di zona attiva negli animali viventi rilevando e analizzando macchie momenti diversi in quanto le superfici e le posizioni di neuroni specifici sono definiti nel nostro protocollo.

<html> La modulazione della funzione sinaptica contribuisce alla notevole capacità del sistema nervoso di rispondere o adattarsi alle mutevoli stimoli ambientali precisione. Regolazione della probabilità di rilascio delle vescicole presinaptico è un modo per controllare la forza sinaptica 1. Rilascio delle vescicole sinaptiche hanno luogo presso la zona attiva (AZ), una regione specializzata della membrana presinaptica 2. L&#39;AZ è caratterizzato da una cassetta di proteine specifiche 3, 4. La maggior parte delle proteine che contribuiscono alla AZ di montaggio sono altamente conservati nei nematodi, insetti e mammiferi 5. Studi recenti suggeriscono che il livello di attività neuronale regola la composizione molecolare del AZ, che a sua volta contribuisce alla regolazione della potenza funzionale sia in vitro che in vivo 6, 7,&gt; 8. Abbiamo già scoperto che AZS fotorecettori subiscono rimodellamento molecolare in Drosophila dopo una prolungata esposizione alla luce ambientale naturale, 9. In questa condizione, abbiamo osservato che il numero di Bruchpilot (BPA) -positivo AZS è stata ridotta negli assoni dei fotorecettori. Le proteine Brp / CAST / famiglia ELKS sono mattoni fondamentali di AZS in vertebrati e invertebrati sinapsi 10. In Drosophila mutanti BRP, evocato rilascio delle vescicole è soppressa 11, 12. Le 17 residui di aminoacidi C-terminale della Brp sono essenziali per il clustering sinaptica vescicole al Drosophila Giunzione neuromuscolare (NMJ) 13, 14. Questi studi hanno dimostrato il ruolo centrale di questa molecola in organizzazione e funzione AZ. Con uno strumento genetico sviluppato di recente, Synaptic Tagging con ricombinazione (STAR), Brppuò essere osservato in vivo in specifici tipi cellulari, a livelli di espressione endogeni e ad una sola risoluzione sinapsi 15. Questo strumento rende possibile valutare le dinamiche endogene di sinapsi quantitativamente nel complesso sistema nervoso centrale. Ci sono stati diversi studi tra cui quantificazioni sinapsi in base ai dati ottenuti da microscopia confocale. alterazioni sinaptiche sono state valutate misurando la lunghezza, la zona, il volume, la densità e contando il numero basato su applicazioni software sofisticate. Per esempio, il freeware ImageJ fornisce un metodo di quantificazione per l&#39;area sinaptica totale e le misure di densità sinaptica alla Drosophila NMJ 16. Il numero di siti colocalizzazione di marcatori pre e post-sinaptici sono stati quantificati utilizzando il plug-in &quot;Puncta Analyzer&quot; disponibili sulla piattaforma software ImageJ 17. In alternativa, un multi-parprogramma basato adigm ambiente di calcolo numerico, Synapse Detector (Synd), può tracciare automaticamente dendriti dei neuroni marcati con un marcatore fluorescente, e quindi quantifica i livelli di proteine sinaptiche in funzione della distanza dal corpo cellulare 18. Il software Synaptic Puncta Analysis (SynPAnal), è stato progettato per l&#39;analisi rapida di immagini 2D di neuroni acquisiti da microscopia confocale o fluorescenti. La funzione principale di questo software è la quantificazione automatica e rapida della densità e l&#39;intensità di proteine puncta 19. Recentemente, un algoritmo automatico apprendimento basato rilevamento sinapsi è stato generato per la quantificazione del numero sinaptica in 3D 20, approfittando del software 21 Visualizzazione 3D-Assisted Analysis (Vaa3D). immagine commerciale software di analisi sono anche potenti strumenti per la quantificazioni sinaptiche. Per esempio, la fluorescenzarecettori dei neurotrasmettitori etichettati o un componente presinaptica AZ sono stati quantificati in tre dimensioni con risoluzione di una singola sinapsi in C. elegans 22 o il sistema Drosophila olfattivo 23, 24, permettendo centinaia di sinapsi per essere rapidamente caratterizzato all&#39;interno di un singolo campione. Qui, presentiamo un metodo con un software di analisi di immagine personalizzata plug-in implementato in un ambiente di calcolo numerico multi-paradigma che permette di analizzare semi-automaticamente molteplici aspetti AZS, tra loro numero, la distribuzione e il livello di arricchimento di componenti molecolari l&#39;AZ. Così, questo complesso di analisi ci ha permesso di valutare la dinamica dei componenti sinaptiche in terminali degli assoni in diverse condizioni ambientali. Abbiamo studiato l&#39;effetto dell&#39;esposizione luce sulle sinapsi di uscita dei fotorecettori mosca adulta. La procedura viene eseguita in tre fasi: 1)preparazione per esposizione alla luce, 2) dissezione, immunoistochimica e confocale, e 3) analisi delle immagini.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vial</td>
			<td>Hightech, Japan</td>
			<td>MKC-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plug</td>
			<td>Thermo Fisher Sciehtific, USA</td>
			<td>AS-275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Customized transparent rack made of acrylic resin&#160;</td>
			<td>Shin-Shin Corporation, Japan</td>
			<td></td>
			<td>a height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cool incubator</td>
			<td>MITSUBISHI ELECTRIC, Japan</td>
			<td>CN-40A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED panel</td>
			<td>MISUMI, Japan</td>
			<td>LEDXC170-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital light meter</td>
			<td>CEM</td>
			<td>DT-1301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly pad</td>
			<td>Tokken, Japan</td>
			<td>TK-HA03-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (35 x 10 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One International, Germany</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablet</td>
			<td>Takara, Japan</td>
			<td>T900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Wako, Japan</td>
			<td>160-24751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>A. 152X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 16%</td>
			<td>NEM, Japan</td>
			<td>3152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P-200</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P-20</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P-2</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-chaoptin antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>24B10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa568-conjugated anti-mouse antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories, Inc.</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide (76 x 26 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. &#38; Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm)</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td>474030-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Industrial Microscopes</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>SZ61-C-SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope Lighting</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>KL 1600 LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>confocal microscopy</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td>LSM780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td>Version 7.6.4 or above</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>The MathWorks, Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel for Mac&#160;</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing synaptic modulation of drosophila melanogaster photoreceptors after exposure to prolonged light

Il sistema nervoso ha la notevole capacità di adattarsi e rispondere a vari stimoli. Questa regolazione neurale è ottenuto tramite la plasticità a livello sinaptico. La zona attiva (AZ) è la regione a livello della membrana presinaptica che media il rilascio dei neurotrasmettitori ed è composto da un insieme denso di proteine ​​ponteggi. AZS di Drosophila melanogaster (Drosophila) fotorecettori subisce rimodellamento molecolare dopo una prolungata esposizione alla luce ambientale naturale. Così il livello di attività neuronale in grado di riorganizzare la composizione molecolare del AZ e contribuire alla regolazione della potenza funzionale. A partire dalla esposizione alla luce di set-up preparazione alla immunoistochimica, questo protocollo dettagli come quantificare il numero, la distribuzione spaziale, e il livello di delocalizzazione delle molecole sinaptiche a AZS in fotorecettori Drosophila. Utilizzando l&#39;analisi delle immagini software, grappoli della componente GFP-fuso AZ Bruchpilot sono stati identificati per ogni fotorecettore R8 (R8) terminale degli assoni. macchie Bruchpilot rilevati sono stati assegnati automaticamente ai singoli assoni R8. Per calcolare la distribuzione di frequenza posto lungo l&#39;assone, abbiamo implementato un personalizzato software plugin. start-point di ogni assone e end-point sono stati definiti manualmente e la posizione di ciascun punto Bruchpilot stati proiettati sulla linea di collegamento tra inizio e fine-point. Oltre al numero di cluster Bruchpilot, abbiamo anche quantificato il livello di delocalizzazione Bruchpilot-GFP all&#39;interno dei cluster. Queste misure riflettono in dettaglio le dinamiche sinaptiche spazialmente risolti in un singolo neurone in diverse condizioni ambientali agli stimoli.

L&#39;occhio composto di Drosophila comprende ~ 780 ommatidi, ciascuna contenente otto tipi di fotorecettori (R1-8). R7 e R8 progetto loro assoni alla seconda ganglio ottico, midollo, dove formano sinapsi strati M6 e M3, rispettivamente, 26. Per studiare l&#39;effetto dell&#39;esposizione prolungata alla luce sulla composizione molecolare dei fotorecettori zone attive R8, abbiamo approfittato del metodo STaR 15. Livelli di espressione endogena di Brp sono stati fluorescente lanciando il codone di stop in BRP-FSF-GFP con un flippase espresso in fotorecettori R8 derivati dalla sens-FLP. Le mosche sono stati conservati per 1 - 3 d dopo eclosion in LL, LD o DD per lo stesso periodo di tempo a 25 ° C (Figura 1A). Per esporre le mosche a 1.000 Lux luce, le mosche sono stati fissati in un rack resina acrilica (Figura 1B) e mantenuti alla stessa distanzadalla sorgente luminosa a LED in un piccolo incubatore (Figura 1C). Dopo immunostaining, cervelli sezionati sono stati collocati nella fessura stretta tra due vetrini su un vetrino da microscopio con il lato ventrale del cervello rivolte verso l&#39;alto per la visualizzazione e la quantificazione del puncta BRP-GFP (Figura 2). Il segnale BRP-GFP risulta localizzato a puncta distinta all&#39;interno R8 nella midollare (Figura 3A). Per contare il numero e misurare la distribuzione di BRP-GFP puncta, e di valutare il livello di segnale delocalizzazione di BRP-GFP in R8s, un personalizzato analisi delle immagini software plugin è stato sviluppato in un multi-paradigma di ambiente di calcolo numerico 9, 27. In un primo momento, puncta sono stati rilevati da una funzione di rilevamento posto per ogni R8 (Figura 3B). Successivamente, la superficies di ciascun R8 sono stati generati per la valutazione del livello di delocalizzazione (Figura 3C). Infine, abbiamo definito start-punti e punti finali nella parte superiore dello strato M1 e la parte inferiore dello strato M3 su ogni fotorecettore, rispettivamente per misurare la distribuzione AZ (Figura 3D). Oggetti superficie, macchie, start-punti e end-point per due terminali degli assoni R7 in strato M6 sono stati generati per sottrarre il segnale di fondo del canale GFP (Figura 3E). I risultati del numero (Figura 4D), la distribuzione (figure 4A, 4B e 4E) e il livello delocalizzazione (figure 4A, 4C e 4F) vengono calcolati automaticamente dal personalizzato plug-in scritti in un ambiente di calcolo numerico multi-paradigma . Abbiamo scoperto che il numero di Brp puncta discreta è stata significativamente ridotta nel R8 fotorecettori di mosche tenuti in condizioni LL (figure 4D e 4E). Inserisciitionally, abbiamo scoperto che le sinapsi R8 sono stati distribuiti lungo l&#39;albero assonale dalla M1 allo strato M3, ma la densità era più elevata a strati M1 e M3 (figura 4E). Il livello di delocalizzazione di BRP-GFP è rimasto invariato in tutte le condizioni di luce (Figura 4F). Questo è in contrasto con la localizzazione di un fluorescente tag versione corta della Brp (BRP-short-ciliegia) 28, che, come abbiamo riportato in precedenza 9 diventa chiaramente diffusa in LL (Figura 4G). Abbiamo suggerito che il segnale BRP-short-ciliegia delocalizzato potrebbe essere correlato al trattamento inadeguato del BRP-breve frammento dopo lo smontaggio dalla AZ 9. Tra le altre proteine AZ testati, fluorescente contrassegnati legame con le proteine (DRBP) costrutti DLiprin-alfa o Drosophila Rim mostrano una riduzione del numero di puncta e una chiara delocalizzazione in LL. Al contrario, fluorescenza tagged Dsyd-1 o Cacophony (Cac) fanno<html> Non visualizzare un aumento del segnale citoplasmatica anche dopo LL (Figura 4G). Così, misurando sistematicamente se il segnale diventa citoplasmatica potrebbe essere rilevante per comprendere la trasformazione delle proteine ​​AZ. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55176/55176fig1.jpg" /> Figura 1: Preparazione delle condizioni di esposizione alle Definito intensità della luce. (A) protocolli di esposizione alla luce dopo eclosion. DD, l&#39;oscurità continua; LD, 12 h / 12 h scuro; LL, l&#39;esposizione costante alla luce. Fly cervelli sono stati sezionati nei tempi indicati nelle parentesi (adattato da una precedente pubblicazione 9). (B) Fiale sono allineati in un rack acrilico trasparente personalizzato. (C) Il rack acrilico e due pannelli LED sono messi in un piccolo incubatore e rettificati per esporre le mosche a un&#39;intensità luminosa di 1.000 lux.s / ftp_upload / 55176 / 55176fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55176/55176fig2.jpg" /> Figura 2: Preparazione del campione. (A) tutto montato preparati cervello. (B - D) Schema dei preparativi. (C, D) Le sezioni trasversali dei preparativi. Il lato ventrale del cervello è alto (C) tra coprioggetto (D). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55176/55176fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55176/55176fig3.jpg" /> Figura 3: Generazione dei luoghi, oggetti di superficie e punti di misura. <strong&gt; (A) proiezione di una pila confocale attraverso gli strati midollo M1 - M6, che mostrano R8s BRP-GFP puncta (bianco) generato con la stella 15 usando ricombinasi sens-FLP. Anti-Chaoptin (blu) mette in evidenza gli assoni dei fotorecettori R7 e R8. barra della scala, 5 micron. (B) Individuazione di BRP-GFP puncta dal modulo di rilevazione posto per ogni terminale assone R8. (C) Rilevato assone regioni ( &quot;oggetti di superficie&quot;, blu) e le regioni a pronti ( &quot;oggetti Spot&quot;, bianco) per la misurazione del livello di delocalizzazione di BRP-GFP in assoni R8. (D) l&#39;avvio punti e end-point vengono impostati manualmente con la funzione di &quot;punto di misura&quot; per definire l&#39;orientamento di ciascun assone nello spazio 3D e di definire un sistema di coordinate su cui il punto BRP-GFP vengono proiettate. (E) La superficie di oggetti, macchie, start-punti e end-point per due terminali degli assoni R7 a strati M6 che non includono R8 vengono generati per sottrarre il segnale di fondodel canale GFP. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55176/55176fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55176/55176fig4.jpg" /> Figura 4: Quantificazione del numero, la distribuzione e la delocalizzazione livello di BRP-GFP Puncta. (A) Schema del procedimento utilizzato per misurare il livello di segnale delocalizzato Brp-GFP in R8. Il puncta BRP-GFP sono identificati e due aree sono definiti intorno a loro: l&#39;area &quot;spot&quot; e l&#39;area &quot;citoplasmatica&quot;. La linea di collegamento di inizio e end-point è suddiviso in 10 partizioni. (B, C) di uscita dalla personalizzata analisi delle immagini software plugin scritto in un ambiente di calcolo numerico multi-paradigma. Ogni punctum BRP-GFP coordinate viene proiettato ad una linea che rappresenta il neurone dall&#39;inizio-Point al punto finale (B). barra della scala, 5 micron. Il puncta Brp-GFP sono identificati e due zone sono definite intorno a loro: l&#39;area &quot;spot&quot; e la zona &quot;citoplasmatica&quot; (C), come schematizzato in (A). (D - F) Istogrammi confrontando il numero totale di puncta (D), la loro distribuzione (E) e il livello di delocalizzazione di BRP-GFP per R8 assone (F) a DD (83 assoni / 7 cervelli), LD (107 assoni / 5 cervelli) e LL (226 assoni / 15 cervelli). Grafici (G) Bar a confronto il livello di delocalizzazione di BRP-short-ciliegia in LD (74 assoni / 7 cervelli) e LL (70 assoni / 5 cervelli), GFP-DLiprin-α in LD (67 assoni / 7 cervelli) e LL (52 assoni / 6 cervelli), GFP-DRBP in LD (70 assoni / 7 cervelli) e LL (83 assoni / 6 cervelli), GFP-Dsyd-1 in LD (48 assoni / 5 cervello) e LL (69 assoni / 7 cervelli), e Cac-GFP in LD (31 assoni / 5 cervello) e LL (27 assoni / 5 cervelli). *** P &lt;0,0001, ** p &lt;0,001, * p &lt;0,0<html> 5, ns p&gt; 0.05; Test t spaiato con la correzione di Welch due code. barra di errore mostra l&#39;errore standard della media. Il disegno schematico in (A) ei dati (D), (E) e (G) sono atti da una precedente pubblicazione 9. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55176/55176fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Supplemental Video 1" src="/files/ftp_upload/55176/55176mov1.jpg" /> Video supplementare: Descrizione del trattamento effettuato con l&#39;Imaris Plugin &quot;Synapse Trafo&quot;. Discussione del trattamento dei dati. Questo video contiene una breve conferenza per illustrare la trasformazione ed elaborazione dei dati passi eseguiti dal Imaris plug-in &quot;synapse_trafo&quot; coordinata.5176 / theory_data_analysis_withaudio.avi &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro del mouse per scaricare).

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light at JoVE.com

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Qui mostriamo come quantificare il numero e la distribuzione spaziale delle zone attive sinaptiche In Drosophila melanogaster fotorecettori, evidenziata con un marcatore molecolare geneticamente codificato, e la loro modulazione dopo una prolungata esposizione alla luce.

Analizzando Synaptic Modulazione di<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotorecettori dopo l&#39;esposizione alla luce prolungata

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

analyzing-synaptic-modulation-drosophila-melanogaster-photoreceptors

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

6.5K Views.  Niigata University.  Qui mostriamo come quantificare il numero e la distribuzione spaziale delle zone attive sinaptiche In Drosophila melanogaster fotorecettori, evidenziata con un marcatore molecolare geneticamente codificato, e la loro modulazione dopo una prolungata esposizione alla luce. 

Video: Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

Nella visualizzazione in vivo delle vescicole sinaptiche In Drosophila assoni larvali segmentale

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Ricerca

Neuroscienze

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Stimolazione Optogenetic del comportamento in Fuga<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

Determinazione del locomotore attività spontanea in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a straightforward manner. As we previously demonstrated 1, in a two-dimensional chamber, we first force the flies to form a tight group, subsequently allowing them to take their preferred distance from each other. After the flies have settled, we measure the distance to the closest neighbor (or social space), processing a static picture with free online software (ImageJ). The analysis of the distance to the closest neighbor allows researchers to determine the effects of genetic and environmental factors on social interaction, while controlling for potential confounding factors. Diverse factors such as climbing ability, time of day, sex, and number of flies, can modify social spacing of flies. We thus propose a series of experimental controls to mitigate these confounding effects. This assay can be used for at least two purposes. First, researchers can determine how their favorite environmental shift (such as isolation, temperature, stress or toxins) will impact social spacing 1,2. Second, researchers can dissect the genetic and neural underpinnings of this basic form of social behavior 1,3. Specifically, we used it as a diagnostic tool to study the role of orthologous genes thought to be involved in social behavior in other organisms, such as candidate genes for autism in humans 4.

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The effect of genes and environment on social space of Drosophila melanogaster can be quantified through a powerful but straightforward analytical paradigm. We show here different factors that can affect this social space, and thus need to be taken into consideration when designing experiments in this paradigm.

Condizioni che influiscono spazio sociale in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

High Throughput test per esaminare Preferenze deposizione delle uova dei singoli<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral variation. The larval path-length assay was developed to measure individual differences in foraging behavior that were later linked to the foraging gene. Larval path-length is an easily scored trait that facilitates the collection of large sample sizes, at minimal cost, for genetic screens. Here we provide a detailed description of the current protocol for the larval path-length assay first used by Sokolowski. The protocol details how to reproducibly handle test animals, perform the behavioral assay and analyze the data. An example of how the assay can be used to measure behavioral plasticity in response to environmental change, by manipulating feeding environment prior to performing the assay, is also provided. Finally, appropriate test design as well as environmental factors that can modify larval path-length such as food quality, developmental age and day effects are discussed.

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

Foraggiamento protocollo percorso di lunghezza per<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Le larve

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Metodo elettrofisiologiche per la registrazione intracellulare di tensione Risposte di<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorecettori e Interneuroni a luce stimoli<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.

Metodo elettrofisiologico per le registrazioni a morsetto di tensione a cellule intere da<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorecettori

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Desensitization and Recovery of Crayfish Photoreceptors Upon Delivery of a Light Stimulus

A method to study desensitization and recovery of crayfish photoreceptors is presented. We performed intracellular electrical recordings of photoreceptor cells in isolated eyestalks using the discontinuous single electrode-switched voltage-clamp configuration. First, with a razor blade we made an opening in the dorsal cornea to get access to the retina. Thereafter, we inserted a glass electrode through the opening, and penetrated a cell as reported by the recording of a negative potential. Membrane potential was clamped at the photoreceptor's resting potential and a light-pulse was applied to activate currents. Finally, the two light-flash protocol was employed to measure current desensitization and recovery. The first light-flash triggers, after a lag period, the transduction ionic current, which after reaching a peak amplitude decays towards a desensitized state; the second flash, applied at varying time intervals, assesses the state of the light-activated conductance. To characterize the light-elicited current, three parameters were measured: 1) latency (the time elapsed between light flash delivery and the moment in which current achieves 10% of its maximum value); 2) peak current; and 3) desensitization time constant (exponential time constant of the current decay phase). All parameters are affected by the first pulse.
To quantify recovery from desensitization, the ratio p2/p1 was employed versus time between pulses. p1 is the peak current evoked by the first light-pulse, and p2 is the peak current evoked by the second pulse. These data were fitted to a sum of exponential functions. Finally, these measurements were carried out as function of circadian time.

A protocol for the study of desensitization and sensitivity recovery of crayfish photoreceptors as a function of circadian time is presented.

Desensibilizzazione e recupero dei fotorecettori dei gamberi al momento della consegna di uno stimolo leggero

A method to study desensitization and recovery of crayfish photoreceptors is presented. We performed intracellular electrical recordings of photoreceptor ...

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Protein aggregation is a central feature of most neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease (PD), Huntington&#39;s disease (HD), and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Protein aggregates are closely associated with neuropathology in these diseases, although the exact mechanism by which aberrant protein aggregation disrupts normal cellular homeostasis is not known. Emerging data provide strong support for the hypothesis that pathogenic aggregates in AD, PD, HD, and ALS have many similarities to prions, which are protein-only infectious agents responsible for the transmissible spongiform encephalopathies. Prions self-replicate by templating the conversion of natively-folded versions of the same protein, causing spread of the aggregation phenotype. How prions and prion-like proteins in AD, PD, HD, and ALS move from one cell to another is currently an area of intense investigation. Here, a Drosophila melanogaster model that permits monitoring of prion-like, cell-to-cell transmission of mutant huntingtin (Htt) aggregates associated with HD is described. This model takes advantage of powerful tools for manipulating transgene expression in many different Drosophila tissues and utilizes a fluorescently-tagged cytoplasmic protein to directly report prion-like transfer of mutant Htt aggregates. Importantly, the approach we describe here can be used to identify novel genes and pathways that mediate spreading of protein aggregates between diverse cell types in vivo. Information gained from these studies will expand the limited understanding of the pathogenic mechanisms that underlie neurodegenerative diseases and reveal new opportunities for therapeutic intervention.

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Accumulating evidence supports the idea that pathogenic protein aggregates associated with neurodegenerative diseases spread between cells with prion-like properties. Here, we describe a method that enables visualization of cell-to-cell spreading of prion-like aggregates in the model organism, Drosophila melanogaster.