Funding for the production of this manuscript was provided by Nottingham Trent University. The authors wish to thank the University yard manager, Anna Gregory for the use of her horses and provision of fecal samples for use in the protocol. Thanks also to Chester Zoo Wildlife Endocrinology Laboratory for use of their facilities.

Ética declaración: los procedimientos que implican temas de muestreo de campo y animales han sido aprobados por la Escuela de animal, Rural y Ciencias Ambientales (ARES) en la Universidad de Nottingham Trent. 1. Recolección de muestras fecales NOTA: Se deben usar guantes al manipular muestras fecales y metanol. Si existe una fuerte sospecha de que un animal podría estar sufriendo de una enfermedad zoonótica, ropa protectora, como también se debe usar una bata de laboratorio. <ol><li> Recoger las muestras fecales tan pronto como sea posible (dentro de unos pocos minutos a una hora) después de la defecación y colocarlos en una bolsa de muestra. Tomar de tres a cinco submuestras de cualquier muestra defecado con un peso total de aproximadamente 10 g. Etiquetar la bolsa con la hora y fecha de recolección, identificación individual, y congelar la muestra a -20 ° C hasta su análisis. </li><li> Para minimizar el error, congelar las muestras a -20 ° C hasta que el estudio se complete a continuación, recoger las muestras para el análisis en conjunto como un solo lote. &lt;/ Li&gt; </ol> 2. Extracción de la hormona fecal <ol><li> Deje las muestras fecales que se descongele a temperatura ambiente. </li><li> Asegúrese de que las muestras se homogeneizaron mezclando manualmente cada muestra en su propia bolsa de muestra. </li><li> Para cada muestra pesan 0.50 (± 0.003 g) de material fecal en una microbalanza en un barco pesan a continuación, transferir las heces a un vial de vidrio de 8 ml. Use un nuevo barco pesan para cada muestra y limpiar las pinzas con metanol al 30% entre cada muestra. </li><li> Combinar el 0,5 g de materia fecal con 5 ml de metanol al 90%: agua, y agitar O / N en un agitador orbital a temperatura ambiente. </li><li> A la mañana siguiente, la muestra Vortex y centrifugar durante 20 minutos a 600 g. </li><li> Se decanta la fracción de metanol en un tubo de vidrio de 16 x 125 mm 2 y colocar en un estante en un baño de agua a una temperatura de 37 ° C. Se evapora a sequedad del aire en una campana de humos. Enjuague el vial de extracción y colocarlo el sedimento fecal restante en una bolsa de residuos clínicos para su eliminación. </li><li> Vuelva a suspender los extractos fecales en 100%, 1 ml de metanol y transferir a un tubo de polipropileno de 12 x 75 mm 2. Inmediatamente la tapa y se almacena a -20 ° C hasta su análisis. </li></ol> 3. Análisis Hormonal <ol><li> Llevar a cabo el análisis con un inmunoensayo ligado a enzimas (EIA) utilizando antisuero policlonal corticosterona CJM006. NOTA:. Un segundo EIA fue probado (cortisol R4866 antisuero, pero esto no logró alcanzar la etapa de validación bioquímica (ver sección 4.1) El antisuero policlonal corticosterona CJM006 y antisuero cortisol R4866 y el respectivo HRP de son suministrados por CJ Munro, Universidad de California, Davis, CA. </li><li> Diluir el antisuero a 1: 15.000 en tampón de revestimiento (0,05 M NaHCO3, pH 9,6) usando una pipeta repetitiva y una punta de pipeta 50 l, cargar una placa de microtitulación de 96 pocillos con 50 l / pocillo. Cubrir la placa con un sellador de placas e incubar O / N a 4 ° C. Dejar dos pozos no recubiertos para representar los pozos de unión no específica (NSB). </li><li> Inmediatamente antes de su uso lavar las placas de microtitulación cinco veces usando un lavador de placas de microtitulación automático (solución de lavado; 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20). </li><li> Cargar las placas con 50 l por pocillo para la NSB de y pozos [tampón EIA (0,1 M NaPO 4, 0,149 M NaCl, 0,1% de albúmina de suero bovino, pH 7,0) solamente] &quot;cero&quot;, estándares (corticosterona, 3,9 - 1.000 pg / así) o extraer muestras fecales (diluido apropiadamente a las 1:20 tampón EIA, ver sección 4.1). Normas y ceros deben ser manejados por triplicado y cuadruplicado, respectivamente. Diluidas extraer muestras fecales y de NSB deben analizar por duplicado. </li><li> Siga este inmediatamente con la adición de 50 l / pocillo de la etiqueta de rábano picante ᵻ conjugada con peroxidasa, diluida en tampón EIA a 1: 70.000. </li><li> Se incuban las placas de microtitulación en la oscuridad durante 2 horas a RT. </li><li> Lavar las placas de microtitulación con solución de lavado 5 veces y se incuban las placas a temperatura ambiente en la oscuridad con 100 l / well de RT sustrato [0,4 mM de 2,2&#39;-azino-di- sal (3-etilbenzotiazolina sulfónico) diamonio, 1,6 mM H 2 O 2, 0,05 M citrato, pH 4,0]. Preparar el sustrato inmediatamente antes del uso. </li><li> Use un espectrofotómetro a una longitud de onda de 405 nm para leer las placas de microtitulación. La incubación de las placas se considera completa cuando la densidad óptica de los pocillos cero llega a 0,8 a 1,0. </li><li> Para asegurar la repetibilidad, utilizar los controles [normas EIA o una muestra biológica diluidas en tampón de EIA para unirse a aproximadamente 30% (estándar EIA), 50% (una muestra biológica, por ejemplo, la piscina de caballo doméstico extracto fecal) y 70% (estándar EIA) ] para demostrar una intra e inter-ensayo coeficientes de variación de &lt;10% y &lt;15%, respectivamente. </li></ol> 4. Enzyme Linked-inmunoensayo: Validación para la especie estudio y sexo <ol><li> Validación bioquímica (paralelismo) <ol><li> Utilizando tampón EIA, lleve a cabo una dilución en serie en agrupada fecal adicionalct, lo ideal es tomado de muestras de alta y baja concentración de la hormona sospechosos de varios individuos (rango: aseado, 1: 2 a 1: 8192) y se ejecutan en el EIA como se describe en la sección 3. NOTA: Un paralelismo se considera logra cuando las diluciones en serie de los extractos fecales producen una curva de desplazamiento paralelo a los resultados curva y lineal de regresión estándar demuestran R2&gt; 0,90, una pendiente&gt; 0,50 y p &lt;0,05. El extracto fecal diluida en serie que se une a alrededor del 50% en la curva estándar se debe considerar la dilución ideal para ejecutar todos los extractos fecales (por ejemplo, 1:20). No hay interferencia en el ensayo considerado cuando los resultados de regresión lineal demuestran R2&gt; 0,90 y p &lt;0,05. </li></ol></li><li> Validación bioquímica (Interferencia) <ol><li> Pico de 200 l de los estándares diluidos en serie (cero, de 3,9 a 1000 ng / pocillo corticosterona) con 200 l de extracto fecal diluidas adecuadamente agrupada [diluida en el 50% de la unión determinada por Parallelism (1:20)] y se ejecutan en el EIA como en la sección 3. Tras gráfico de análisis EIA, la concentración observada menos el fondo (concentración de la muestra cero) frente a la concentración esperada. NOTA: Si la adición de extracto fecal diluida agrupado a las normas no altera significativamente la cantidad esperada y lineales resultados de la regresión produce R2&gt; 0,90, una pendiente cercana a 1,0 y p &lt;0,05. se ha logrado ninguna interferencia con la EIA. </li></ol></li><li> Validación biológica: NOTA: Una demostración de que la EIA elegido tiene la capacidad de medir los cambios de importancia biológica de la hormona de interés [por ejemplo, el aumento de las concentraciones de glucocorticoides siguientes farmacológico (ACTH es a menudo un procedimiento de licencia) o un desafío biológico (por ejemplo, psicológica y / o ambiental; más probable que sea un evento no regulada oportunista)]. <ol><li> Seleccionar, extraer y analizar muestras fecales de las concentraciones de metabolitos de glucocorticoidesmediante el proceso detallado en las secciones 1 a 3 antes y después de un evento desafiante. NOTA: Un desafiante evento será especies específicas. Un procedimiento de ejemplo se proporciona a continuación para el caballo doméstico. Ejemplos completos de eventos desafiantes para los caballos han sido publicados anteriormente incluyendo el uso de gestión 9 y procedimientos de cría de 16. Un aumento significativo en las concentraciones de metabolitos de glucocorticoides después del evento desafiante debe ser observado y confirmado mediante análisis estadístico. Esto debe incorporar en su caso, el efecto de las medidas repetidas, fecha de la muestra e individuales. Se consideró entonces logra la validación biológica. </li></ol></li></ol>

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	<li>Morm&#232;de, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploration+of+the+hypothalamic-pituitary-adrenal+function+as+a+tool+to+evaluate+animal+welfare.">Exploration of the hypothalamic-pituitary-adrenal function as a tool to evaluate animal welfare.</a> Physiology and Behaviour. 92 (3), 317-339 (2007).</li><li>Lane, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+non-invasive+glucocorticoid+measures+be+used+as+reliable+indicators+of+stress+in+animals?.">Can non-invasive glucocorticoid measures be used as reliable indicators of stress in animals?.</a> Animal Welfare. 15 (4), 331-342 (2006).</li><li>Morgan, K. N., Tromborg, C. 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R., Wiggans, G. R., Van Soest, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement+of+liquid+and+solid+digesta+retention+in+ruminants,+equines+and+rabbits+given+timothy+hay.">The measurement of liquid and solid digesta retention in ruminants, equines and rabbits given timothy hay.</a> British Journal of Nutrition. 48, 329-339 (1982).</li><li>Goymann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+monitoring+of+hormones+in+bird+droppings:+biological+validations,+sampling,+extraction,+sex+differences+and+the+influence+of+diet+on+hormone+metabolite+levels.">Non-invasive monitoring of hormones in bird droppings: biological validations, sampling, extraction, sex differences and the influence of diet on hormone metabolite levels.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 35-53 (2005).</li><li>Touma, C., sachser, N., Mostl, E., Palme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+sex+and+time+of+day+on+metabolism+and+excretion+of+corticosterone+in+urine+and+feces+of+mice.">Effects of sex and time of day on metabolism and excretion of corticosterone in urine and feces of mice.</a> General and comparative Endocrinology. 130, 267-278 (2003).</li><li>Rattenbacher, S., Mostl, E., Hackl, R., Ghareeb, K., Palme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+corticosterone+metabolites+in+chicken+droppings.">Measurement of corticosterone metabolites in chicken droppings.</a> British Poultry Science. 45, 704-711 (2004).</li><li>Yarnell, K., Hall, C., Billett, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+the+aversive+nature+of+an+animal+management+procedure+using+behavioural+and+physiological+measures.">An assessment of the aversive nature of an animal management procedure using behavioural and physiological measures.</a> Physiology &amp; Behaviour. 118, 32-39 (2013).</li><li>Goymann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+use+of+non-invasive+hormone+research+in+uncontrolled,+natural+environments:+the+problem+with+sex,+diet,+metabolic+rate+and+the+individual.">On the use of non-invasive hormone research in uncontrolled, natural environments: the problem with sex, diet, metabolic rate and the individual.</a> Methods in Ecology and Evolution. 3, 757-765 (2012).</li><li>Sheriff, M. J., Dantzer, B., Delehanty, B., Palme, R., Boonstra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+stress+in+wildlife:+techniques+for+quantifying+glucocorticoids.">Measuring stress in wildlife: techniques for quantifying glucocorticoids.</a> Oecologia. 166, 614-619 (2011).</li><li>Watson, R., Munro, C. J., Edwards, K. L., Norton, V., Brown, J. L., Walker, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+versatile+enzyme+immunoassay+for+non-invasive+assessment+of+glucocorticoid+metabolites+in+a+diversity+of+taxonomic+species.">Development of a versatile enzyme immunoassay for non-invasive assessment of glucocorticoid metabolites in a diversity of taxonomic species.</a> General Comparative Endocrinology. 186, 16-24 (2013).</li><li>Touma, C., Palme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+fecal+glucocorticoid+metabolites+in+mammals+and+birds:+the+importance+of+validation.">Measuring fecal glucocorticoid metabolites in mammals and birds: the importance of validation.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 54-74 (2005).</li><li>Millspaugh, J. J., Washburn, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+fecal+glucocorticoid+metabolite+measures+in+conservation+biology+research:+considerations+for+application+and+interpretation.">Use of fecal glucocorticoid metabolite measures in conservation biology research: considerations for application and interpretation.</a> General and Comparative Endocrinology. 138, 189-199 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

análisis corticosterona fecal proporciona un medio de evaluar los patrones de largo plazo de la actividad suprarrenal en los caballos. La naturaleza no invasiva del método supera los efectos de confusión de otros métodos de muestreo utilizados para evaluar la actividad suprarrenal incluyendo la saliva y el plasma análisis 9. Además, la técnica tiene una clara ventaja no invasivo si el estudio de los caballos que van libres. Hay varios puntos clave para discutir con respecto a este método y su uso apropiado. Un paso crítico en el protocolo es la validación del ensayo para la especie en cuestión y la elección anticuerpo apropiado. Si el anticuerpo utilizado reacciona de forma cruzada con metabolitos de glucocorticoides estructuralmente similares pero funcionalmente diferentes esto podría confundir los resultados 17. Por lo tanto, los ensayos para medir los metabolitos de hormonas requieren una validación fisiológica o biológica cuidado, existen detalles de que en la literatura 18,19 y dentro de la descr protocoloibed. El estado de la muestra fecal necesita ser considerado la inclusión de frescura de la muestra y la exposición ambiental que han tanto ha demostrado que afecta los niveles de metabolitos hormonales 20. La lluvia excesiva exposición al sol o se sabe que causan aumentos o disminuciones en las concentraciones de metabolitos debido a la metabolización bacteriana 21. Los investigadores que deseen recoger muestras de diferentes grados de frescura deben investigar los efectos del tiempo sobre la integridad de la muestra, además de impacto ambiental. Esto se puede hacer antes del estudio mediante la creación de un pequeño experimento y periódicamente muestras de heces de los individuos masculinos y femeninos, con diferentes grados de frescura y la exposición a las variables climáticas. En la mayoría de los escenarios de investigación, las muestras de individuos conocidos serán útiles o necesarios 10. En los caballos domésticos esto se puede lograr mediante el control de un grupo para la defecación o el uso de marcadores de alimentos ingeridos a Identificaciónentify heces de los individuos en grupos más grandes 12. En las especies que van gratuitas esto puede resultar de tiempo como se requiere seguimiento individual. Al seleccionar el método de análisis de glucocorticoides se debe considerar que los resultados del ensayo de corticosterona fecal representan una muestra colectiva con el tiempo en lugar de un punto en el tiempo de medida; Por lo tanto, habrá menos fluctuación en los datos. Si el investigador está interesado en los efectos a largo plazo de una situación, la técnica de cría o en la práctica la gestión entonces el análisis fecal ofrece una técnica apropiada. Si se requiere una evaluación de los patrones de corto plazo en la concentración de la hormona a continuación, el plasma o el análisis de saliva sería el método preferido.

Los objetivos método descrito para analizar las concentraciones de corticosterona en las heces de equino con el fin de proporcionar una evaluación no invasiva de la actividad suprarrenal. La medición de la actividad (HPA) eje hipotálamo-hipofisario-suprarrenal es un método aceptado para estudiar la respuesta a situaciones potencialmente aversivas en ambas especies en cautividad y domésticas. La técnica de referencia y el método más ampliamente utilizado es el uso de plasma de la sangre 1 Sin embargo, los métodos alternativos tales como el análisis fecal se han desarrollado con el fin de superar el estrés inducido por el muestreo de sangre en sí y permitir la capacidad de seguimiento de las especies que van libres. Durante una situación aversiva, la homeostasis fisiológica se altera. El hipotálamo en el cerebro libera hormona liberadora de corticotropina (CRH) que actúa sobre la glándula pituitaria anterior y estimula la liberación de la hormona adrenocorticotrópica (ACTH). ACTH entra en el torrente sanguíneo y estimula la corteza adrenal para secretar especieS glucocorticoides específicos (GC). Los glucocorticoides están estrechamente vinculados a los acontecimientos estresantes en lugar de ser producido constantemente en todos los estados elevados de energía, por lo tanto a menudo se miden en preferencia sobre otras hormonas de estrés ligado 2. Los glucocorticoides son responsables de varios efectos adaptativos en caballos. La energía se movilizó rápidamente desde los lugares de almacenamiento en el cuerpo en forma de ácidos grasos y glucosa, el consumo de oxígeno se incrementa, la función sensorial se potencia 3 y el flujo sanguíneo se reduce a las zonas no necesarias para el movimiento 4. Además de actuar como mecanismo de defensa, el aumento inducido por el estrés de glucocorticoides también puede ayudar a preparar a los animales para el siguiente factor de estrés 5. La evaluación de los niveles de hormonas en el plasma y saliva implica la medición de la hormona circulante actual, sin embargo, la medición de los metabolitos en las medidas de heces el producto final metabólico de la hormona. esteroides circulantes son catabolizados en el liver antes de su excreción en la bilis a la donde se someten a cambios adicionales facilitadas por las actividades enzimáticas de la flora bacteriana en el tracto intestinal 6. Por lo tanto, los inmunoensayos dirigidos a los glucocorticoides en la sangre no pueden ser adecuados para el análisis de los metabolitos de glucocorticoides fecales 7. Como recogida fecal puede llevar a cabo sin perturbación para el caballo, el análisis de heces para la corticosterona, se ha utilizado ampliamente para controlar la actividad HPA en un número de circunstancias. Corticosterona elevada en las heces de los caballos ha sido reportada en respuesta a situaciones potencialmente aversivos incluso durante el tratamiento veterinario postoperatorio 8 y 9 en la vivienda restrictiva. Toma de muestras fecales refleja un nivel de glucocorticoides combinado con el tiempo en lugar de en el punto de muestreo en tiempo ofrecido por el plasma y la saliva por lo que es apropiado para el seguimiento a largo plazo, crónica o patrones estacionales 10. Debido a la no invasivanaturaleza del método, las muestras se pueden recoger en varias ocasiones para un individuo sin la necesidad para la captura o la restricción 11. Sin embargo, las especies de tiempo específico de tránsito intestinal se debe tener en cuenta al planificar un protocolo de muestreo. En los caballos, tiempo de tránsito intestinal es de alrededor de 18 hr 12, por lo tanto, la respuesta adrenal y posteriores metabolitos de corticosterona se pueden detectar en las heces un día después de la activación inicial del eje HPA. Cuando se utilizan técnicas de inmunoensayo no invasivos una validación cuidadosa de la especie objeto de la investigación es esencial 13. Además, las diferencias de sexo en la hormona de excreción de los metabolitos se han reportado probablemente debido a las diferencias en la tasa metabólica y el tipo de metabolito excretado corticosterona en diversas especies, incluyendo ratones 14, 15 y pollos. Por ello es importante como parte de este método que el ensayo fue validado para su uso tanto en los caballos domésticos masculinos y femeninos como se detalla en la THprotocolo de correo. Esta diferencia en el metabolismo de las hormonas entre los géneros tiene consecuencias para la calidad de los datos, sin embargo, rara vez se aborda y se incluye como parte de la validación de un ensayo. Este método no invasivo permite una evaluación a largo plazo de la actividad suprarrenal en los caballos domésticos. Los detalles del protocolo tanto en la validación del ensayo y de la técnica de ensayo en sí.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Corticosterone antibody &#38; HRP kit</td>
			<td>Coralie Munro - UC Davis</td>
			<td>NA</td>
			<td>No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cortisol antibody &#38; HRP kit</td>
			<td>Coralie Munro - UC Davis</td>
			<td>NA</td>
			<td>No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone synthetic standard hormone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>50-23-7</td>
			<td>Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cortisol synthetic standard hormone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>15087-01-1</td>
			<td>Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td>Irritant. Use in fume cupboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate Anhydrous</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>497-19-8</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>77-92-9</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABTS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>30931-67-0</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 30%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>7722-84-1</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer capsules - pH 4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>332732B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer capsules - pH 7</td>
			<td>VWR</td>
			<td>332742D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer capsules - pH 10</td>
			<td>VWR</td>
			<td>332762H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>435570</td>
			<td>Irritant. Use in fume cupboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BFS-525-010A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air compressor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer +printer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fridge-freezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flammable liquid storagecabinet</td>
			<td>VWR</td>
			<td>649-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume cupboard</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot-plate stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>640-282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate washer</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research&#174; pipettes - multipack option 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette - 1000ul</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette - 200ul</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette - 20ul</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette filler</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Progen Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Hilsonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warm water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water purification system</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fecal glucocorticoid analysis: non-invasive adrenal monitoring in equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

caballos domésticos (n = 16, 8 yeguas, 8 castrados) con una edad media de 15 años (± 3) se agruparon de acuerdo con el género y se sometió a cuatro diseños de las viviendas con el aumento de los niveles de aislamiento social (n = 4 caballos / tratamiento). 1 vivienda involucrada caballos que viven en un ambiente de la manada, que simula estrechamente su hábitat natural. Viviendas 2 involucrada caballos que viven en parejas en un granero de interior. Viviendas de 3 caballos que participan alojados en establos solos pero con contacto visual con otros caballos y alojamiento 4 aislamiento total involucrado de los caballos. La exposición a cada tratamiento fue en un diseño de bloques al azar por un período de cinco días. A raíz de esto los caballos se desviaron en potreros de gramíneas en sus grupos experimentales durante dos días antes de la exposición al siguiente tratamiento vivienda. Se recogieron muestras fecales una vez al día en los días 1, 2 y 3 pasaron dentro de cada tratamiento vivienda a partir de n = 8 caballos (n = 2 caballos dentro de cada tratamiento). Se recogieron muestras fecales tan pronto como sea posible y dentro de 1 hora después de la defecación. Todas las muestras se recogieron después de 1.200 horas en el primer día completo de estabulación significado que la primera muestra en el primer día fue recogido al menos 20 horas después de que el caballo se introdujo en el tratamiento de la vivienda. Las muestras de un día, dos y tres (total de 24 muestras por el diseño de viviendas) fueron evaluados para los niveles de corticosterona fecal reflectantes del pasado 18 horas debido a la velocidad de paso de la digesta 12. Los mismos caballos individuales se utilizaron para el análisis fecal durante todo el estudio. Para detalles completos de este desafío biológica, incluidos los parámetros de medición adicionales, ver los ejemplos de trabajo 9 alternos publicados de eventos desafiantes para los caballos domésticos también se pueden encontrar en la literatura 16. Esta sección proporciona ejemplos de resultados de una validación bioquímica (paralelismo), tanto para corticosterone y cortisol en las heces de caballos domésticos masculinos y femeninos. Esta sección también proporciona datos representativos obtenidos a partir de la extracción y el análisis fecal EIA. Los resultados se obtuvieron como parte de un estudio más amplio que investigó el impacto del aislamiento social causado por el diseño de viviendas, en el comportamiento y fisiología equina 9. Los resultados de la validación bioquímica revelaron que el EIA corticosterona era apropiado para medir la actividad suprarrenal [Figura 1A muestra masculina% de unión = 25,349 + 0,729 (% estándar de unión), R2 = 0.9545, F (1, 7) = 146,710, p menos de 0,001); Figura 1B muestra femenina% de unión = 29.989 + 0,7198 (unión% estándar), R2 = 0,95594, F (1, 7) = 151,865, p menos de 0,001], pero no el cortisol EIA [Figura 1C muestra masculina% de unión = 79.089 + 0.0629 (vinculante% estándar), R2 = 0,175, F (1, 7) = 1,485, p = 0,262); muestra femenina Figura 1D% De unión = 81.652 + 0,0772 (unión% estándar), R2 = 0.257, F (1, 7) = 2,422, p = 0,164]. A medida que el EIA corticosterona demostró paralelismo a diferencia de la EIA cortisol y prueba de interferencia en la corticosterona EIA reveló ninguna evidencia de interferencia de la matriz, como la adición de extracto fecal diluida a las normas de corticosterona no alteró la cantidad esperada (macho: Observado = 1.302 + 1.017 (esperados) , R2 = 0.9972, F1, 7 = 1287.128, p &lt;0,001; femenino: Observado = 0,3169 + 1,0931 (esperados), R2 = 0.9972, F1, 7 = 2432,65, p &lt;0,001;). Los resultados del EIA reveló que no hubo diferencia significativa en los niveles de corticosterona entre caballos machos (M = 37,7, SD = 14,1) y caballos hembra (M = 33,8, SD = 12,7; t (70) = 1,23, p = 0,22) . El nivel de corticosterona fecal aumentó como el nivel de aislamiento aumentó. caballos aislados (diseño de carcasa 4) tenían significativamente altoer niveles de corticosterona fecal en comparación con todos los otros diseños de vivienda (Wilks Lambda = 0,58, F (3, 18) = 4,29, p = 0,01, eta parcial multivariante cuadrado = 0,42; p ≤0.02). El nivel de corticosterona fecal fue mayor para todos los caballos en los tres días de la muestra durante la carcasa más aislada en comparación con los otros tratamientos de vivienda. Las concentraciones de corticosterona fecal media para cada diseño de viviendas por cada día se presentan en la Tabla 1. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53479/53479fig1.jpg" /> Figura 1. Validación bioquímica (paralelismo) de una de corticosterona y cortisol Enzyme Linked-Inmunoensayo para hombres y mujeres caballos. Esta figura detalla la unión de piscinas diluidas en serie de hombres y caballos domésticos extractos fecales femeninos contra el aumento de corticosterona y cortisol concentraciones de la curva estándar en ciento una EIA. Los resultados demuestran que lacorticosterona (A, masculino; B, femenino) y no el cortisol EIA (C, masculino; D, femenino). arrojó un éxito curva de desplazamiento paralelo a la curva estándar EIA corticosterona <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53479/53479fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table><tbody><tr><td rowspan="3"></td><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> Media (± DE) CORTICOSTERONA FECAL (ng / g) en cada tratamiento VIVIENDA </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> TRATAMIENTO DE VIVIENDA </td><td> Día 1 </td><td> Dia 2 </td><td> Día 3 </td><td> EN GENERAL </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td&gt; </tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 31.73 ± 10.2 </td><td> 32,18 ± 8,0 </td><td> 29,22 ± 5,9 </td><td> 31.05 ± 7.8 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> 32.75 ± 10.0 </td><td> 33,66 ± 12,9 </td><td> 34.67 ± 9.3 </td><td> 33.69 ± 10.3 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td> 35.06 ± 14.6 </td><td> 35,14 ± 15,9 </td><td> 33.13 ± 12.5 </td><td> 34,44 ± 13,6 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;/ Td&gt; <td></td><td></td><td></td><td> * </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 38.16 ± 17.8 </td><td> 42.00 ± 16.7 </td><td> 41,52 ± 17,6 </td><td> 40,56 ± 16,5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1. La media (± DE) en heces corticosterona (ng / g) para cada tratamiento vivienda durante un día, dos y tres y media de corticosterona fecal (ng / g) para los tres días (total) en cada tratamiento Vivienda. Esta tabla muestra los valores medios de corticosterona fecal (ng / g) ± la desviación estándar para cada uno de los tratamientos de vivienda durante días uno, dos y tres. Las muestras se recogieron al menos 20 horas después de caballos entraron en la vivienda. También muestra la corticosterona fecal media (ng / g) ± desviación estándar para los tres días (en general) en cada tratamiento vivienda. El concentrat corticosterona fecalion fue significativamente mayor (*) durante el diseño de la carcasa aislada. La menor concentración de corticosterona fecal para todos los días se encontró en el grupo de tratamiento alojado (tratamiento 1). Adaptado de Yarnell et al. (2015), con el permiso de la Revista de Fisiología y Comportamiento.

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Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Análisis de glucocorticoides fecales: Monitoreo suprarrenal no invasiva en los équidos

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

fecal-glucocorticoid-analysis-non-invasive-adrenal-monitoring

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.6K vistas.  Nottingham Trent University. Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Video: Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Mouse Adrenal Chromaffin Cell Isolation

Adrenal medullary chromaffin cell culture systems are extremely useful for the study of excitation-secretion coupling in an in vitro setting.  This protocol illustrates the method used to dissect the adrenals and then isolate the medullary region by stripping away the adrenal cortex.  The digestion of the medulla into single chromaffin cells is then demonstrated.

Adrenal medullary chromaffin cell culture systems are extremely useful for the study of excitation-secretion coupling in an in vitro setting. This protocol illustrates the method used to dissect the adrenals and then isolate the medullary region by stripping away the adrenal cortex. The digestion of the medulla into single chromaffin cells is then demonstrated.

Ratón cromafín aislamiento de células

Adrenal medullary chromaffin cell culture systems are extremely useful for the study of excitation-secretion coupling in an in vitro setting.  This ...

Investigación

Biología

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative medicine. A non-invasive method to monitor the transplanted stem cells repeatedly in vivo would greatly enhance our ability to understand the mechanisms that control stem cell death and identify trophic factors and signaling pathways that improve stem cell engraftment. MR imaging has been proven to be an effective tool for the in vivo depiction of stem cells with near microscopic anatomical resolution. In order to detect stem cells with MR, the cells have to be labeled with cell specific MR contrast agents. For this purpose, iron oxide nanoparticles, such as superparamagnetic iron oxide particles (SPIO), are applied, because of their high sensitivity for cell detection and their excellent biocompatibility. SPIO particles are composed of an iron oxide core and a dextran, carboxydextran or starch coat, and function by creating local field inhomogeneities, that cause a decreased signal on T2-weighted MR images. This presentation will demonstrate techniques for labeling of stem cells with clinically applicable MR contrast agents for subsequent non-invasive in vivo tracking of the labeled cells with MR imaging.

For the evaluation of new stem cell therapies it is important to non-invasively track the injected cells in vivo. This video will show you how to label human mesenchymal and embryonic stem cells with iron oxide based contrast agents in vivo for subsequent MR imaging in vivo.

Etiquetado y hESCs hMSCs con nanopartículas de óxido de hierro para no invasivo en el seguimiento in vivo mediante RM

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Etiquetado de las células madre con tintes fluorescentes para la detección no invasiva con imágenes ópticas

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard cuticle which makes it difficult to use protocols of classical histology. In addition, histological sectioning destroys the sample and can therefore not be used for unique material. Hence, a non-destructive method is desirable which allows to view inside small samples without the need of sectioning.
We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble (France) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows us to reconstruct the internal organization in its natural state without the artefacts produced by histological sectioning. These date can be used for quantitative morphology, landmarks, or for the visualization of animated movies to understand the structure of hidden body parts and to follow complete organ systems or tissues through the samples.

We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows the reconstruction of internal structures in their natural state without the artefacts produced by histological sectioning.

No invasivo en 3D de visualización con la Sub-micron resolución mediante sincrotrón de rayos X de la tomografía

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

A Reversible, Non-invasive Method for Airway Resistance Measurements and Bronchoalveolar Lavage Fluid Sampling in Mice

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated procedures to obtain such measurements in the same animal are generally not feasible.  Here, we demonstrate protocols for obtaining from mice repeated measurements of AHR and bronchoalveolar lavage fluid samples.  Mice were challenged intranasally seven times over 14 days with a potent allergen or sham treated.  Prior to the initial challenge, and within 24 hours following each intranasal challenge, the same animals were anesthetized, orally intubated and mechanically ventilated.  AHR, assessed by comparing dose response curves of respiratory system resistance (RRS) induced by increasing intravenous doses of acetylcholine (Ach) chloride between sham and allergen-challenged animals, were determined.  Afterwards, and via the same intubation, the left lung was lavaged so that differential enumeration of airway cells could be performed.  These studies reveal that repeated measurements of AHR and BAL fluid collection are possible from the same animals and that maximal airway hyperresponsiveness and airway eosinophilia are achieved within 7-10 days of initiating allergen challenge.  This novel technique significantly reduces the number of mice required for longitudinal experimentation and is applicable to diverse rodent species, disease models and airway physiology instruments.  

Repeated measurements of rodent respiratory physiology and sampling of airway inflammatory cells are desirable, but generally not feasible. Here we describe a repeatable method for orally intubating mice that permits repeated measurements of airway hyperreactivity and sampling of airway inflammatory cells.

A reversible, método no invasivo para las mediciones de resistencia de las vías y Toma de Muestras Líquido del Lavado broncoalveolar en ratones

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

A largo plazo Prueba de toxicidad letal con el Crustáceo Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

El análisis genético rápido de epitelio-mesenquimal de señalización durante la regeneración del cabello

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids can lead to severe side effects. Test systems are needed to search for novel compounds influencing glucocorticoid signaling in vivo or to determine unwanted effects of compounds on the glucocorticoid signaling pathway. We have established a transgenic zebrafish assay which allows the measurement of glucocorticoid signaling activity in vivo and in real-time, the GRIZLY assay (Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY). The luciferase-based assay detects effects on glucocorticoid signaling with high sensitivity and specificity, including effects by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production. We present here a detailed protocol for conducting chemical screens with this assay. We describe data acquisition, normalization, and analysis, placing a focus on quality control and data visualization. The assay provides a simple, time-resolved, and quantitative readout. It can be operated as a stand-alone platform, but is also easily integrated into high-throughput screening workflows. It furthermore allows for many applications beyond chemical screening, such as environmental monitoring of endocrine disruptors or stress research.

We describe the procedure and data analysis of a chemical screening system for glucocorticoid stress hormone signaling using zebrafish larvae: the Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY (GRIZLY) assay. The assay sensitively and specifically detects effects on glucocorticoid signaling by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production.

Un procedimiento de detección química de glucocorticoides Señalización con un sistema indicador de pez cebra Larva luciferasa

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

Who is Who? Non-invasive Methods to Individually Sex and Mark Altricial Chicks

Many experiments require early determination of offspring's sex as well as early marking of newborns for individual recognition. According to animal welfare guidelines, non-invasive techniques should be preferred whenever applicable. In our group, we work on different species of song birds in the lab and in the field, and we successfully apply non-invasive methods to sex and individually mark chicks. This paper presents a comprehensive non-invasive tool-box. Sexing birds prior to the expression of secondary sexual traits requires the collection of DNA-bearing material for PCR. We established a quick and easy method to sex birds of any age (post hatching) by extracting DNA from buccal swabs. Results can be obtained within 3 hours. For individual marking chick's down feathers are trimmed in specific patterns allowing fast identification within the hatching order. This set of methods is easily applicable in a standard equipped lab and especially suitable for working in the field as no special equipment is required for sampling and storage. Handling of chicks is minimized and marking and sexing techniques are non-invasive thereby supporting the RRR-principle of animal welfare guidelines.

This protocol provides a convenient set of methods, which enables extremely fast, easy, non-invasive, reliable and low-cost, molecular sex determination of birds and their non-invasive, quick, safe and easily recognizable marking shortly after hatching. Only limited handling of chicks is required. This convenient toolbox of methods complies entirely with the RRR-guidelines.

¿Quién es quién? Métodos no invasivos para Individualmente Sexuales y Mark altriciales Chicks

Many experiments require early determination of offspring's sex as well as early marking of newborns for individual recognition. According to animal ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic disorder, cardiovascular disease, and kidney disease. Currently, there is no available method to assess LDL uptake while simultaneously monitoring for health of the cells. The current study presents a protocol, using a live cell imaging analysis system, to acquire serial measurements of LDL influx with concurrent monitoring for cell health. This novel technique is tested in three human cell lines (hepatic, renal tubular epithelial, and coronary artery endothelial cells) over a four-hour time course. Moreover, the sensitivity of this technique is validated with well-known LDL uptake inhibitors, Dynasore and recombinant PCSK9 protein, as well as by an LDL uptake promoter, Simvastatin. Taken together, this method provides a medium-to-high throughput platform for simultaneously screening pharmacological activity as well as monitoring of cell morphology, hence cytotoxicity of compounds regulating LDL influx. The analysis can be used with different imaging systems and analytical software.

This protocol provides an efficient approach to measuring LDL cholesterol uptake with real time influx rates using a live cell imaging system in various cell types. This technique provides a platform to screen the pharmacological activity of compounds affecting LDL influx while monitoring for cell morphology and hence potential cytotoxicity.

Ensayo de absorción de colesterol LDL utilizando celular directo imágenes análisis con células control de salud

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...