Celest desarrollo fue apoyado por el NIH subvenciones R21AG027513 y U01AG045864. Algunas representaciones de vídeo cortos de datos y se han adaptado de Restif et al. (2014) 8, que fueron publicados bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento (CC BY) http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Agradecemos a Ricardo Laranjeiro ayuda manuscrito.

1. El crecimiento de los nematodos y manipulación <ol><li> C. elegans crecer en placas de Petri que contenían estándar NGM manchado con OP50-1 Escherichia coli como fuente de alimento 1-3. </li><li> Mantenga culturas en una incubadora que mantiene la temperatura deseada. C. elegans crece bien de 15 a 25 ° C, con 20 ° C siendo la temperatura de crecimiento estándar. NOTA: La natación es un fenotipo robusta, sin embargo nadar vigor puede verse afectada por factores ambientales como la contaminación en las placas y el sobrecalentamiento de las culturas y las diapositivas. debe hacerse un gran esfuerzo para mantener condiciones estables. </li><li> Usar un pico nematodo casera hecha de un alambre de platino llama sellada en una varilla de vidrio para manejar la transferencia de los animales individuales 4. </li></ol> 2. Puesta en funcionamiento para el Análisis de la nadada <ol><li> Utilizar un sistema integrado que consiste en un microscopio estereoscópico, cámara digital CCD y el software de grabación de vídeo digital. El software de CA Célestn ser utilizado en un equipo independiente. <ol><li> Cubra el microscopio con un paño oscuro (por ejemplo, fieltro) para evitar el deslumbramiento en el área de colocación de natación en el portaobjetos de un microscopio y mejorar la calidad de la imagen. </li><li> Ajustar la distancia de trabajo del microscopio y la ampliación de la vista de la zona de baño, y el espejo de base para obtener agudo contraste de los animales contra el fondo. Ajuste la iluminación de campo oscuro para visualizar los cuerpos de los adultos como blanco contra el fondo negro, que funciona muy bien para la visualización computacional y el seguimiento con el software de análisis de natación. </li><li> Tenga cuidado de mantener el área de trabajo, portaobjetos de microscopio, y nadar caer muy limpio. Los desechos pueden interferir con el análisis mediante la oclusión de la natación libre de los adultos, y de finos hilos de fibra puede ser detectada como actora animales durante el seguimiento. </li></ol></li></ol> 3. Preparación de los animales para el análisis de la condición física en Líquido <ol><li> Pipeta de 60 l Otampón f 1x M9 en un anillo de 10 mm preimpreso sobre un portaobjetos de microscopio. Asegúrese de que la caída cubre por completo la zona interior del anillo. El software extrae más información natación uso de este tamaño de gota contenida en un portaobjetos de lo que sería si la utilización de placas de múltiples pocillos. </li><li> Recoger nematodos adultos individuales y transferirlos a la caída de tampón 1x M9, reduciendo al mínimo el transporte de bacterias que pueden enturbiar el líquido. Reducir al mínimo las bacterias colocando primero los animales para su transferencia a un lado de la placa que no contiene mucho césped bacteriano, dejando que se arrastran, y luego suavemente levantándolos. <ol><li> Cuando la transferencia de los nematodos en la gota, utilizar un microscopio de disección cerca de la estación de análisis para reducir la duración del tiempo de natación, que puede afectar el comportamiento de los animales 25. </li><li> Coloque sólo 4 adultos en la gota si se mueven vigorosamente y se cruzan a menudo. Como orientación para minimizar la superposición de los nadadores (que confunde el análisis computacional), considerar la colocación de4 animales por caída cuando son tan activos como los adultos jóvenes sanos, WT y 5 animales por caída cuando son más grandes y muestran menos vigor. NOTA: nematodos WT saludable instinto empiezan a nadar poco después de ser colocado en un líquido. Con la ayuda de un pick nematodo, separar suavemente los adultos en el descenso si se amontonan. </li></ol></li></ol> 4. Análisis de la Condición Física en líquidos - Grabación de vídeo de Natación <ol><li> Coloque el portaobjetos cargado con los adultos sobre la base del microscopio para grabar su natación. 30 s detalles de captura de videos de la conducta de un animal individual en líquido (Video 1), y toma de muestras de un gran número de tales registros se logra fácilmente cuando con la ayuda de software de Celest 8,26; sin embargo, ya nadan períodos pueden ser ideal para otros estudios de comportamiento específicos 25. Es importante destacar que, asegúrese de mantener el mismo aumento a lo largo de todas las grabaciones ya que las diferencias de aumento afecel análisis y la comparación de natación t sesgo voluntad. NOTA: Estos pasos se proporcionan como orientación usando el software de grabación de vídeo digital que aparece en la Tabla de Materiales; software de acceso abierto VirtualDub podría sustituir, aunque no hemos probado esto. <ol><li> Utilice los siguientes parámetros como guía para el análisis de natación éxito: tamaño de la imagen de 696 x 520 píxeles, resolución de imagen de 0,02 mm / pixel, y una tasa de 18 frames / s. Versiones de mayor resolución de estos ajustes pueden facilitar el seguimiento pero no afectará a las medidas calculadas por el programa. NOTA: La zona de natación proporcionado por la caída de 60 l de tampón 1x M9 en el portaobjetos de microscopio no tiene mucha profundidad, lo que minimiza hacia arriba y hacia abajo movimiento de natación. </li></ol></li><li> En Configuración, vaya a &#39;Grabación&#39;, set &#39;Secuencia límite de tamaño &quot;a&quot; 545 marcos en el disco&#39;. En la misma partida, marque la casilla &#39;Usar Recording Manager&#39;. Haga clic en &quot;Editar recor actualguión ding ... &quot;botón, y bajo &#39;Comandos&#39;, seleccione &#39;Frame Grab&#39;, y bajo condiciones de parada &#39;&#39;, introduzca &#39;parada después de 0: 00: 30.00&quot;. </li><li> Para grabar, seleccione &quot;Nueva secuencia en la memoria RAM &#39;bajo el título principal y oprima el botón&#39; Record &#39;rojo. El software se agarra 545 marcos de más de 30 s con la cámara digital y los mantienen en la memoria RAM. </li></ol> 5. Análisis de la condición física en líquidos - Tratamiento de vídeo <ol><li> Fragmentar el video en una secuencia de cuadros de imagen haciendo clic en el encabezamiento principal y seleccionando &#39;secuencia completa Exportar a ... &quot;en el software de grabación de vídeo. NOTA: El software de grabación de vídeo digital puede guardar los fotogramas como .bmp, .jpg, .tif, o .png, todo lo cual puede ser leído por el programa de análisis de natación que aquí se presenta. Tenga en cuenta que los archivos .tif utilizan más espacio de almacenamiento, pero algunos formatos como .jpg pueden degradar la calidad de imagen. </li><li> Poner en marcha el programa de análisis de natación desde MATLAB by hacer clic en el botón de ejecución. </li><li> En la pantalla principal del programa de análisis de nadar, utilizar el &quot;Añadir un vídeo&quot; o &quot;Añadir varios vídeos &#39;botones para cargar secuencias de cuadros de imagen de uno en uno o en grupos, mientras que sujetan las etiquetas pertinentes, tales como el genotipo, la fecha, el juicio y la duración . El software crea una base de datos de las secuencias marcadas. </li><li> Habilitar el seguimiento simultáneo de múltiples animales en las secuencias subidas haciendo clic en &#39;1. Proceso de vídeos &#39;. En la nueva pantalla, seleccionar los vídeos que desee en el cuadro de la izquierda y haga clic en &quot;Añadir a la lista &#39;. Para cada vídeo, haga clic en su nombre en la lista de arriba a la derecha para mostrar la primera imagen del vídeo en la parte inferior derecha. Demarcar la zona de la piscina mediante la selección de 3 puntos en el interior del anillo, e iniciar el procesamiento haciendo clic en &quot;Proceso de todos los vídeos que aparecen más arriba &#39;. Ver el progreso del procesamiento en la parte inferior central. </li><li> Una vez completado, &quot;Cerrar&quot; la pantalla de procesamiento de vídeo. </li></ol> 6. Análisis de la Condición Física en líquidos - Medición <ol><li> Haga clic en &quot;2. medidas de cómputo &#39;para abrir una nueva pantalla en la que se pueden subir los vídeos procesados, uno a la vez, para validar o rechazar el seguimiento de animales individuales. Los vídeos que se han procesado aparecerán en la lista de la izquierda, donde el nombre del vídeo se puede hacer clic para cargar ese video. </li><li> Utilice este paso manual para centrarse en las áreas de seguimiento (bloques rojos) perdidas en contraste con el seguimiento de éxito (bloques verdes). NOTA: Como alternativa, se puede confiar en la salida automatizado de seguimiento válido ya que el software tiene un estricto sistema de seguimiento (94,1% validez como se observa en 2.020 animales de 404 vídeos 8). <ol><li> Encuentra la «validez del cuerpo segmentado &#39;en la primera barra de color a través de la pantalla en la mitad inferior. El porcentaje de &quot;marcos válidos &#39;está en verde, y el porcentaje de tramas rechazadas&#39; &#39;está en rojo. ≥80% de tramas válidas que implica el seguimiento informaciones utilizado para calcular las medidas proviene de al menos 432 marcos de cada 540 en unos 30 s nadar ensayo registrado a 18 frames / s. </li><li> Fácil de navegar y modificar los bloques de validez / rechazado marcos que utilizan el &#39;siguiente bloque&#39;, &#39;Cambiar validez &quot;,&quot; bloque de Split&#39;, y las opciones de &#39;frame&#39; Aislar. En el raro caso de que 2 animales se cruzaron en una zona de baño con poca gente, cambiar su número de identificación en un intervalo de trama específico con el botón &#39;Cambiar&#39;. </li><li> Ver los gráficos de barras en la mitad inferior de la pantalla para obtener información adicional sobre el seguimiento y las actuaciones que se solapan. La longitud del cuerpo segmentado (de animales longitud del cuerpo por trama) se correlaciona con la incidencia superpuestas. </li></ol></li><li> Si ningún puntos brillantes en el video interfieren con el análisis, ajuste áreas brillantes en la zona de la piscina mediante la selección de la función de las «zonas de deslumbramiento. </li><li> Haga clic en &quot;Guardar y medidas Calcular &#39;para guardar la entrada de validez antes de que acabecargar otro de vídeo procesada. En esta etapa el software calcula, en el fondo (que no se muestra al usuario), mapas de curvatura de la rendimiento de la natación de los animales individuales y los parámetros indicados a continuación (Video 2). NOTA: Los parámetros medidos que se centran en que aquí se describen en la Tabla 1. La tasa de iniciación de la onda, número de la onda del cuerpo, la asimetría, estiramiento, y curling se calculan sobre la base de los mapas de curvatura que el software calcula para los animales; la velocidad de desplazamiento, movimiento del cepillo, y el índice de actividad parámetros no están basados ​​en mapas de curvatura. </li><li> Haga clic en &quot;Cerrar&quot; para salir de la pantalla &#39;&#39; Calcular medidas. </li></ol> 7. Análisis de la Condición Física en líquido - Salida de los resultados Nota: El software puede informar sobre múltiples medidas del movimiento de natación, que abarcan desde manifiestos a muy sutiles rasgos de comportamiento no anotados fácilmente por el ojo (Videos 3 y 4). Aquí elatención se centra en 8 parámetros que suelen mostrar un buen rango dinámico: Onda tasa de iniciación, número de la onda del cuerpo, la asimetría, Stretch, Curling, Velocidad de desplazamiento, movimiento del cepillo, y el índice de actividad. <ol><li> En la pantalla principal del programa, haga clic en &quot;3. Mostrar resultados &#39;para obtener el resultado del análisis. </li><li> Crear grupos de la muestra para el tratamiento estadístico mediante la selección de las secuencias analizadas deseados de marcos en el cuadro de la izquierda y su traslado a un grupo de muestra nueva o existente haciendo clic en los botones &#39;Añadir a la muestra seleccionada&#39; o &#39;Añadir a la nueva muestra. </li><li> Haga clic en &quot;mostrar gráficas de estas muestras &#39;para ir a una segunda pantalla que muestra los gráficos y estadísticas clave de las muestras para cada uno de los 8 parámetros de selección en la parte superior de la pantalla. <ol><li> Si lo desea, ajuste la representación de los gráficos de barras en la parte superior izquierda de la pantalla utilizando los &#39;Colores&#39;, &#39;# de histogramas&#39; y &#39;#&#39; de gusanos selectores. </li></ol></li><li> Utilizar&#39;&#39; Histogramas 2D para trazar combinaciones de cualquiera de los dos parámetros a través de la &#39;medida en el eje X&#39; y &#39;Medida en el eje Y&#39; menús desplegables a la izquierda de la pantalla. Haga clic en &quot;Cerrar&quot; para salir y regresar a la pantalla &quot;Mostrar resultados&quot;. </li><li> Utilice el &quot;Exportar ...&quot; botón en la parte superior izquierda de la pantalla para guardar los datos numéricos detallados como archivo .csv para abrir y manipular aún más en un programa de hoja de cálculo. </li><li> pantalla &#39;Cerrar&#39; &#39;los resultados de visualización&#39; para volver a la pantalla principal y haga clic en &quot;Salir&quot; para garantizar el ahorro de la base de datos que contiene las secuencias de vídeo analizados. </li></ol>

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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+connectome+of+a+decision-making+neural+network.">The connectome of a decision-making neural network.</a> Science. 337 (6093), 437-444 (2012).</li><li>Greenblum, A., Sznitman, R., Fua, P., Arratia, P. E., Sznitman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+segmentation+using+texture-based+models+for+motility+phenotyping.">Caenorhabditis elegans segmentation using texture-based models for motility phenotyping.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 61 (8), 2278-2289 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

El uso de C. elegans como sistema modelo sigue aumentando debido a su maleabilidad genética, la trazabilidad y la anatomía experimental anotadas, en detalle meticuloso. Por ejemplo, la estructura neuronal y la conectividad de la C. elegans hermafrodita está claramente trazaron 34-36, facilitando enormemente la investigación de los circuitos neuronales específicos que controlan conductas particulares. 302 neuronas constituyen el sistema nervioso del adulto hermafrodita, que procesar una amplia gama de entradas sensoriales en salidas de comportamiento básicas como la locomoción. La estructura del sistema nervioso más complejo masculina también se ha descrito 37, lo que permite circuitos sexo-específicas que deben abordarse. 37 C. elegans comportamiento ha sido ampliamente estudiado en placas de cultivo estándar que contienen medio sólido. Desde WT C. elegans se mueve en ondas sinusoidales previsibles en las placas de agar-llenado, las desviaciones de lapatrón general puede ser detectada por el ojo y obtuvo manualmente. Este enfoque, sin embargo, está sujeta a criterio del experimentador y mucha mano de obra. Herramientas de hardware y software diseñados para rastrear y medir C. elegans locomoción en medios sólidos eliminar el sesgo de subjetividad y permite estudios a gran escala, lo que permite cuestiones biológicas más sofisticados que deben abordarse. La base de datos del comportamiento reciente creado por el laboratorio Schafer 16 es un excelente ejemplo de la extensión y profundidad de análisis que se ha logrado con un sistema computacional para la locomoción en los platos. Cuando WT C. elegans se coloca en forma líquida, el animal se adapta rápidamente su movimiento al nuevo entorno, iniciando un baño. C. elegans natación utiliza un mayor rango de movimiento que se arrastra y puede ser más irregular 8. Software como Célest pretende llenar el hueco para el análisis detallado de C. elegans comportamiento en estado líquido, permitting cuantificación de parámetros de movimiento asociado a que no se miden fácilmente por el ojo de la ONU con ayuda de, o que se pueden lograr con mayor rapidez que la calificación manual. En 8 h dura un individuo puede procesar hasta 200 videos, ~ 1.000 registros por día. El software define parámetros que evalúan la natación que sirven como una huella digital completa de la condición física y el comportamiento. Además de enriquecer la comprensión de las complejas facetas de C. elegans comportamiento en el líquido y sus vías moleculares subyacentes, este software puede ser utilizado para explorar varios aspectos de la biología incluyendo respuestas farmacológicas, el envejecimiento, y el comportamiento distintos. Que aquí se presenta, el resumen de los cambios cuantificados que se producen en el rendimiento físico de C. elegans adultos, ya que la edad es un ejemplo de tal aplicación del software (para una descripción más detallada, ver Restif et al. 8). En el contexto del envejecimiento, algunos parámetros medidos disminuyeron mientrasotros aumentaron o no cambiar constantemente de tipo salvaje. Las tendencias se confirmaron en gran medida por el perfil de cálculo de los mutantes de la longevidad, y los perfiles relativos de cohortes ager agraciado y malos de las poblaciones de la misma edad mantenidos en condiciones ambientales uniformes. La alta resolución del software también puede revelar fenotipos sutiles previamente desconocido en los mutantes ampliamente caracterizados (por ejemplo, la edad-1 (hx546) en la Figura 1). Hay algunos pasos particularmente críticos del protocolo descrito. El mantenimiento de un ambiente de temperatura constante entre el entorno de la piscina y el cultivo en placa de presión es importante para la reproducibilidad de natación, por lo que los experimentadores se les anima a ir a grandes esfuerzos para evitar los cambios de temperatura al azar. medios de natación deben estar a la misma temperatura que las placas. Del mismo modo, una cuidadosa atención al tamaño de la gota para el nado ayudará a asegurar la reproducibilidad. Por último, es prudente pensar enavanzar sobre la descarga de los archivos de video grandes que se acumulan. Se recomienda el procesamiento de imágenes en un sitio aparte del equipo de captura de vídeo. El uso del software que aquí se presenta para el análisis de baño tiene ciertas limitaciones. En primer lugar, si bien los programas pueden rastrear simultáneamente múltiples animales, si hay más de cinco animales se analizan en conjunto, hay una mayor probabilidad de que los animales van a nadar a través de uno al otro en las imágenes de vídeo. Cuando el programa no puede determinar de forma inequívoca qué animal era que, según censura esas tramas de datos. Aunque esta característica programa asegura que los datos de los animales individuales son de alta calidad, que limita el rendimiento. En segundo lugar, las imágenes deben ser bastante limpio, que está libre de polvo, manchas y resplandor de las luces, como señales asociadas también pueden confundir el análisis de imágenes. Como se ha señalado en la sección 2.1.1 de protocolo, una inversión muy baja tecnología que puede ayudar en gran medida la captura de imágenes mediante la eliminación de las complicaciones con las fluctuaciones in ambiental de la iluminación es para cubrir el área del escenario con una tela oscura que no permite que la luz ambiente para llegar a la etapa. En tercer lugar, el programa está optimizado para los animales en la etapa adulta. Joven larvas nadan muy rápido y tienen cuerpos pequeños, lo que aumenta error del programa. En cuarto lugar, algunos de los software utiliza MATLAB, y cuando hay actualizaciones de versiones y / o actualizaciones del sistema operativo, algunos enlaces de programa puede ser interrumpido. Actualmente, el software está optimizado para su uso en MATLAB 2015b y Mac OS versión 10.10, pero esperamos pronto para publicar una versión de software que es más robusto frente a tales cambios. Por último, los archivos de datos de vídeo pueden llegar a ser grandes rápido, y requieren espacio de almacenamiento que ha de adjudicarse. En resumen, se presenta aquí es una metodología sencilla que se puede implementar fácilmente por cualquier laboratorio sin mucha inversión para crear vídeos de C. elegans que nadan para el análisis Célest. Características del paquete de software incluyen una amplia automatización de seguimiento a través deanálisis, el seguimiento de múltiples animales simultánea, y el uso de bases matemáticas (es decir, medidas de curvatura) para la cuantificación de la mayoría de los parámetros de locomoción. El software es de código abierto, con código y demos a disposición del público como se detalla en Restif et al. 8. A pesar de que el programa cuenta con el análisis de la visión por ordenador avanzado de búsqueda, otros sistemas de seguimiento publicado (por ejemplo, Greenblum et al., 2014 38) son compatibles con el análisis de parámetros del software que aquí se presenta. Futuras mejoras serán dirigidos hacia convertir el software en un paquete más robusto que no restringe el uso de las versiones específicas de los sistemas operativos mencionados anteriormente (también indicados en la Tabla de Materiales).

Definiendo cómo el comportamiento de la genética, la epigenética, la experiencia y la influencia ambiente es un reto importante en la biología moderna. Los modelos simples, genéticamente susceptibles que pueden ser computacionalmente rastreados y medidos pueden hacer contribuciones importantes para alcanzar esta meta. Los nematodo Caenorhabditis elegans es uno de estos modelos. El propósito de este artículo es demostrar cómo C. elegans natación locomoción pueden ser rastreados y se cuantifica para extraer información sobre ocho nuevas características con relevancia biológica. C. elegans tiene una vida útil relativamente corta de aproximadamente 2 - 3 w y un período reproductivo de aproximadamente 4 d a 20 ° C 1,2. En cultivos de laboratorio estándar, este nematodo microscópico se cultiva en placas de Petri que contenían Nematodo Medios de Crecimiento (NGM) que se propagan con una fuente alimentaria bacteriana 3,4. animales WT N2 se mueven activamente en las ondas sinusoidales elegantes en placas de agar-llenado; cambian rata movimientoes en itinerancia (búsqueda de alimento), la vivienda (navegación), o recuperándose de una comida (saciedad quiescencia inactivo) 5. Deterioro 6 ó 7-12 años de edad pueden alterar dramáticamente el movimiento de las placas. Los genes que modulan el comportamiento, Healthspan o el envejecimiento, se pueden caracterizar funcionalmente por análisis de C. elegans los patrones de movimiento o locomoción. Un enfoque para medir healthspan es clasificar adultos mayores en tres categorías (por ejemplo, A, B, y C) de acuerdo con su locomoción en placas, con la actividad física vigorosa ser de clase A y parálisis ser de clase C 7,8,13. Aunque tal clasificación cualitativa es útil para revelar las diferencias en la forma física, las categorías son amplias y sin límites claros y por lo tanto su puntuación está sujeto a sesgo del experimentador. Un número cada vez mayor de seguidores han elevado la objetividad, la sofisticación y la precisión del análisis del movimiento de C. elegansen medios sólidos de 14-18. C. elegans locomoción en placas se restringe principalmente al plano en el que el animal entra en contacto con la superficie sólida de los medios de comunicación. (C. elegans también puede inducir la exploración mediante el levantamiento de la cabeza del resto del cuerpo que todavía está en contacto con una superficie sólida, el posicionamiento del cuerpo en múltiples planos. Sin embargo, este comportamiento es inusual.) Cuando se coloca en un líquido, este nematodo inicia un movimiento ondulatorio, o la natación, que cuenta con más extenso movimiento dimensional, una mayor gama de velocidad y la profundidad de movimiento, y un aumento de la incidencia con la edad de movimiento anterior diferente a posterior en comparación con animales en superficies sólidas. Como un rápido análisis de la condición física y la respuesta al nuevo entorno, un experimentador puede colocar un animal individual en una gota de líquido y anotar la frecuencia de su cuerpo se dobla bajo el microscopio de disección. La grabación de vídeo puede facilitar scoring presentes y futuras de la natación el vigor de laanimal. Sin embargo, el enfoque manual de limitar el número de características que se pueden puntuar, y está totalmente restringido a punto de marcar un animal a la vez. La locomoción en líquido ha sido menos explorada de la locomoción en medios sólidos. De hecho, hay pocas opciones de software que son robustos y fáciles de implementar en el laboratorio para medir la locomoción en líquido 19-24. El software de Celest (C. elegans prueba de natación) ofrece simplicidad de uso y las medidas matemáticos basados en los datos que entregan (puntuaciones de curvatura) directamente relacionadas con la naturaleza del movimiento 8; (descripción detallada de las características y ventajas en Restif et al. 8). Además, el análisis computacional permite la elucidación de las características fenotípicas que son imposibles para el ojo humano a marcar. En este caso, los datos que ejemplifican la resolución de este método de análisis se presentan y un fácil de poner en práctica el protocolo para grabar pruebas de nado se describe para el análisis posterior Célest.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1764">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:484px;">REAGENT</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:375px;"></td>
			<td style="width:649px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:484px;">N2</td>
			<td style="width:256px;">Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td style="width:375px;"></td>
			<td>C. elegans wild type (ancestral).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:484px;">OP50 Escherichia coli</td>
			<td style="width:256px;">Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td style="width:375px;"></td>
			<td>Biosafety Level: BSL-1.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:484px;">OP50-1 Escherichia Coli&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td style="width:375px;"></td>
			<td>Streptomycin resistant strain of OP50.&#160; Biosafety Level: BSL-1.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:484px;">Streptomycin sulfate salt</td>
			<td style="width:256px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:375px;">S6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:484px;">Printed Microscope Slides&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:375px;">Gold Seal Fluorescent Antibody Microslides: 3032-002</td>
			<td>have two etched 10mm diameter circles delineated by white ceramic ink</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:484px;">Nematode Growth Medium (NGM)</td>
			<td style="width:256px;">For 1L: 17g Agar, 3g NaCl, 2.5g Peptone, 1mL 1M CaCl2, 1mL 5mg/mL Cholesterol in ethanol, 25mL 1M KPO4 buffer, 1mL 1M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving.</td>
			<td style="width:375px;"></td>
			<td>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:484px;">M9 buffer</td>
			<td style="width:256px;">For 1L: 3g KH2PO4, 6g Na2HPO4, 5g NaCl, 1mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving.</td>
			<td style="width:375px;"></td>
			<td>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:375px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:484px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:375px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:484px;">CeleST</td>
			<td style="width:256px;">Driscoll Lab, Rutgers University</td>
			<td style="width:375px;">C. elegans Swim Test</td>
			<td>Open Source, see http://celestmod.github.io/CeleST/ and http://celest.mbb.rutgers.edu/</td>
		</tr>
		<tr height="189">
			<td height="189" style="height:189px;width:484px;">MATLAB</td>
			<td style="width:256px;">www.mathworks.com/downloads</td>
			<td style="width:375px;">MatLab version 2015b (best)</td>
			<td style="width:649px;">The CeleST version demonstrated here has best functionality with Mac OS 10.10 and MatLab 2015b. MATLAB 2015B introduced changes to how MATLAB handled graphics, including a new coding convention and syntax. These changes resolved an issue that couldn&#39;t be resolved elegantly (primarily because the internals of MATLAB really needed the major graphics overhaul implemented in MATLAB 2015B). For this reason, CeleST should always be run on MATLAB 2015B or later versions. However for users without access to MATLAB version 2015B or later (or MATLAB at all), we have created a CeleST program that doesn&#39;t need MATLAB on the computer at al. An installer is downloaded by the prospective user and then it installs itself onto the computer through a couple prompts like most programs.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:484px;">Mac OS</td>
			<td>www.apple.com</td>
			<td style="width:375px;">Version 10.10</td>
			<td style="width:649px;">Currently, CeleST has been ported to the major operating systems (Windows, Mac, and Linux). The current code can be run on any of the operating systems and there are versions for each operating system that don&#39;t even require users to have MATLAB to use CeleST (this version requires a large download). The Windows version has been tested the least and is most prone to bugs as such. Linux has been moderately tested. And Mac has been and continues to be tested extensively (primarily because it&#39;s the operating system in our lab).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:484px;">Stereomicroscope&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Zeiss</td>
			<td style="width:375px;">Stemi 2000-C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:484px;">Transmitted Light Base</td>
			<td style="width:256px;">Diagnostic Instruments</td>
			<td style="width:375px;">TLB 3.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:484px;">Digital CCD Camera</td>
			<td style="width:256px;">QImaging</td>
			<td style="width:375px;">Rolera-XR Mono Fast 1394 (ROL-XR-F-M-12)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:484px;">Digital Video Recording Software</td>
			<td style="width:256px;">Norpix</td>
			<td style="width:375px;">Streampix Version 3.17.2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated analysis of c. elegans swim behavior using celest software

La disección de los circuitos neuronales y neuromusculares que regulan el comportamiento sigue siendo un reto importante en la biología. El nematodo Caenorhabditis elegans ha demostrado ser un organismo modelo muy valiosa para ayudar a hacer frente a este reto, de inspirar enfoques tecnológicos, la construcción de la conectoma cerebro humano, de arrojar luz sobre realidad los conductores moleculares específicas de los patrones funcionales básicos. La mayor parte de los estudios de comportamiento en C. elegans se han realizado sobre sustratos sólidos. En forma líquida, los animales exhiben patrones de comportamiento que incluyen el movimiento en un rango de velocidades en 3D, así como los movimientos de partes del cuerpo, como un rizo posterior sin cambio de forma anterior, que introducen nuevos retos para la cuantificación. Las etapas de un procedimiento sencillo, y el uso de un software que permite el análisis de alta resolución de C. elegans nadar comportamiento, se presentan aquí. El software, llamado Celest, utiliza un programa informático especializado que realiza el seguimientovarios animales a la vez y proporciona nuevas medidas de C. elegans la locomoción en líquido (natación). Las medidas se basan en su mayoría en la postura de los animales y se basan en las matemáticas utilizadas en la visión por computador y reconocimiento de patrones, sin requisitos computacionales para el umbral de puntos de corte. La herramienta de software puede ser utilizado tanto para evaluar la destreza general nadar en cientos de animales de los ensayos pequeños lotes combinados y revelar nuevos fenotipos mutantes genéticos, incluso en bien caracterizados. La preparación de muestras para análisis con Celest es simple y de baja tecnología, lo que permite la adaptación de ancho por la comunidad científica. Por lo tanto, el uso del método de cálculo descrito aquí debe contribuir a la mejor comprensión de la conducta y circuitos de comportamiento en el modelo C. elegans.

Mediante el análisis de la locomoción en líquido (natación), fenotipos que no son fácilmente evidentes en medios sólidos (rastreo) pueden ser dilucidados. Para cuantificar la locomoción natación hemos desarrollado un software específico que mide diez nuevos parámetros de comportamiento natatorio 8. Los ocho más útil de estos parámetros se describen en detalle en la Tabla 1. Estos parámetros se denominan Wave tasa de iniciación, número de la onda del cuerpo, Asimétrico, estiramiento, Curling, Velocidad de desplazamiento, movimiento del cepillo, y el índice de actividad. Los estudios que ejemplifican el poder del software han definido el deterioro funcional de cientos de envejecimiento adultos con WT, fondos de comportamiento o de longevidad mutante 8, y han analizado el bien estudiado mutantes longevidad edad-1 (hx546) y daƒ-16 (mgDƒ50), los cuales albergan mutaciones que alteran la vía normal de señalización de la insulina. La edad-1 gen codifica para una phosphatidylinositide 3-quinasa (PIK3) Subunidad catalítica, y, cuando se alberga el hx546 mutación, provoca prolongación de la vida y la resistencia al estrés 27-29. El gen daƒ-16 codifica para un factor de transcripción forkhead cuadro de O (FOXO) que acorta la vida útil y deteriora la respuesta al estrés cuando se suprime 30-33. Ciertos parámetros de la natación como Wave tasa de inicio, la velocidad del viaje, del movimiento del cepillo y el índice de actividad disminuyó gradualmente con la edad, incluso en contextos genéticos favorables (Figura 1). De acuerdo con los conocimientos actuales, de larga vida con la edad (1) hx546 mutantes mostraron un rendimiento físico más vigoroso que WT en edades avanzadas y muy viejos. También como se había anticipado, de corta vida daƒ-16 (mgDƒ50) mutantes visualizan en peligro el rendimiento, especialmente a edades muy antiguas. Sorprendentemente, fue sólo bajo el escrutinio de la visión por ordenador y el paquete de Celest algoritmo matemático que el superiorendimiento de la natación r-1 de edad mutantes (hx546) era detectable en el inicio de la edad adulta. El hecho de que los resultados en mejora del rendimiento físico en la vida adulta temprana edad-1 (hx546) sugiere que esta mutación afecta el desarrollo normal y / o fenotipo de adultos jóvenes de una manera no apreciado anteriormente (Figura 1). Número de la onda del cuerpo, la asimetría, estirar y Curling parámetros mostraron una tendencia aumenta con la edad en el WT y el envejecimiento de los adultos mutantes (Figura 2). Curiosamente, el nivel de resolución del software reveló rasgos de comportamiento más finos como la simetría sostenido de mutantes a lo largo de su vida útil y la incapacidad de los viejos-16 daƒ mutantes extremas (mgDƒ50) edad-1 (hx546) para estirar y enroscarse en la medida en la misma WT y la edad-1 (hx546) -Edad adultos hacen. Además de la pérdida inevitable total de perfo físicarmance debido a la edad, cada individuo adulto muestra un patrón único a través de la progresión del proceso de envejecimiento, incluso cuando la genética y el medio ambiente son prácticamente homogénea 7. (Mediante el control de la genética y el medio ambiente, los posibles efectos de confusión de estos factores se reducen al mínimo, al presentar la importante contribución de la estocasticidad a la degeneración relacionada con la edad.) A C. elegans población sincronizada de los antecedentes genéticos similares que son mantenidas en un ambiente controlado todavía contiene una mezcla de diferentes clases de individuos de acuerdo con sus peculiaridades envejecimiento. A pesar de todo el comienzo como adultos sanos, algunos pierden rápidamente su condición física (malos gerentes, clase C), mientras que otros mantienen el vigor para el período más largo de tiempo (gerentes agraciado, clase A). por lo tanto malos gerentes parecen tener un healthspan considerablemente más corto que quinceañeros agraciado. Como se detalla más adelante en nuestro estudio 8, gerentes agraciados mantienen fitn física juveniless como se observa por comparación con el perfil de natación de los adultos más jóvenes (Figuras 3, 4 y 5). Esta aptitud sostenida es comparable con el rendimiento físico de edad-1 mutantes (hx546) de larga vida en la era post-reproductiva (D 11) (Figuras 1 y 2). Por el contrario, los malos gerentes pierden drásticamente gran parte de su capacidad física poco después de la reproducción, que se realiza en niveles similares a los de los adultos de edad extremas y progeric daƒ-16 (mgDƒ50) (Figuras 1 - 4). Estas similitudes se pueden extraer por comparación bruta, sin embargo, las firmas particulares son fácilmente perceptibles a una mirada más cercana. Por ejemplo, aunque hay alguna correlación entre el grado de tanto estiramiento y rizado en los tipos silvestres de edad extremas y los mutantes de envejecimiento (Figura 2), esta relación no se observa en los malos gerentes (Figuras 4 y 5), que muestran mayor propensión a enroscarse pero hastade no estirar en las muestras ensayadas. El software se presenta por lo tanto añade dimensión al análisis de la condición física o la capacidad de locomoción, proporcionando las herramientas para estudios más sofisticados que no eran tratables antes. En resumen, Celest proporciona lecturas completas en forma de ocho nuevas medidas destacadas aquí, que definen la huella digital del comportamiento del concreto genética, epigenética, y fondos ambientales, lo que permite la identificación de patrones de parámetros únicos y comunes que pueden ser las firmas de condiciones específicas ( ambiental, farmacológico, nutricional), biológicos u organismo estados como healthspan. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54359/54359fig1.jpg" /> Figura 1: Informes de software Célest en onda Iniciación Rate (A), el Índice de Actividad (B), Pincelada (C) y Velocidad de desplazamiento (D) de WT, edad-1 (hx546), y daƒ-16 (mgDƒ50)<html> Adultos D 4 (edad adulta), 11 (post-reproducción) y 20 (extrema de edad). &#39;#&#39; &#39;En la serie&#39; medios eje y. WT son de color gris, la edad-1 en verde y daƒ-16 en rojo. Las barras de error son el error estándar de la media (SEM). WT-edad Same y mutantes de envejecimiento se compararon de significación estadística utilizando ANOVA de una vía seguido por prueba de comparación múltiple de Dunnett. **, P = 0,001 - &lt;0,01; ***, P = 0,0001 - &lt;0,001. n = 62 en cada punto de datos de cuatro ensayos independientes. Tenga en cuenta que aquí, y para la Figura 2, cada uno de 30 s de vídeo se realiza con 4 animales, y para cada ensayo que anotar un total de 16 animales a partir de 4 vídeos de natación, esto se hace para 4 repeticiones biológica para cada punto de datos se muestra. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54359/54359fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <html> ntent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54359/54359fig2.jpg" /> Figura 2: Informes de software en el cuerpo Número de onda (A), Asimétrico (B), Estiramiento (C), y se encrespa (D) para WT, edad-1 (hx546) y (mgDƒ50) Adultos D 4 16 daƒ-(jóvenes la edad adulta), 11 (post-reproducción) y 20 (extrema de edad). &#39;#&#39; &#39;En la serie&#39; medios eje y. WT son de color gris, la edad-1 en verde, y daf-16 en rojo. Las barras de error son el error estándar de la media (SEM). WT-edad Same y mutantes de envejecimiento se compararon de significación estadística utilizando ANOVA de una vía seguido por prueba de comparación múltiple de Dunnett. *, P = 0,01 - &lt;0,05; **, P = 0,001 - &lt;0,01; ***, P = 0,0001 - &lt;0,001. n = 62 en cada punto de datos a partir de cuatro independientes, 30 s nadan ensayos.e.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54359/54359fig3.jpg" /> Figura 3: Informes de software en la onda de Iniciación Rate (A), Índice de Actividad (B), Pincelada (C), y Velocidad de desplazamiento (D) para los adultos WT jóvenes (D4), y de la misma edad agraciado y Bad Age (D10 y 11). &#39;#&#39; &#39;En la serie&#39; medios eje y. WT jóvenes son de color gris, clase A agraciados gerentes en verde, y de clase C malos gerentes en rojo. Las barras de error son el error estándar de la media (SEM). Clase A elegantes y gerentes de clase C malos gerentes se compararon con D 4 adultos jóvenes usando ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunnett. ****, P &lt;0,0001. n = 27 en cada punto de datos de dos independientes, 30 s nadan ensayos. Gráfico se modifica ligeramente de Restif et al. (2014) 8, que fue publicado bajo el creativoCommons Reconocimiento (CC BY) http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ licencia. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54359/54359fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54359/54359fig4.jpg" /> Figura 4: Informes de software en el cuerpo Número de onda (A), Asimétrico (B), y Curling (C) para WT adultos jóvenes (D 4), y de la misma edad Age elegantes y Bad (D 10 y 11). &#39;#&#39; &#39;En la serie&#39; medios eje y. WT jóvenes son de color gris, clase A agraciados gerentes de gerentes verde y de clase C malas en rojo. Las barras de error son el error estándar de la media (SEM). Clase A elegantes y gerentes de clase C malos gerentes se compararon con D 4 adultos jóvenes usando ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunnett. **, P = 0,001 - &lt;0,01; ****, P &lt;0,0001; <strong&gt; n / a, no es aplicable ya que sólo un animal a partir del tamaño total de la muestra curvado. n = 27 en cada punto de datos de dos independientes, 30 s nadan ensayos. Gráfico se modifica ligeramente de Restif et al. (2014) 8, que fue publicado bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento (CC BY) licencia http: /creativecommons.org/licenses/by/4.0/. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54359/54359fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54359/54359fig5.jpg" /> Figura 5: Informe sobre el estiramiento de software para adultos WT joven (D4), y de la misma edad agraciado y Bad Age (D 10 y 11). WT jóvenes son de color gris, clase A agraciados gerentes de gerentes verde y de clase C malas en rojo. Las barras de error son el error estándar de la media (SEM). Clase A gerentes elegantes y de clase C malos gerentes se compararon con D 4 yos jóvenes adultos utilizando ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunnett. n = 27 en cada punto de datos de dos ensayos independientes. Gráfico se modifica ligeramente de Restif et al. (2014) 8, que fue publicado bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento (CC BY) licencia http: /creativecommons.org/licenses/by/4.0/. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54359/54359fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="video 1" src="/files/ftp_upload/54359/54359video1.jpg" /> Video 1: Natación de un grupo representativo de C. elegans adultos. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54359/Video1.mov" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo. (Haga clic aquí para descargar.)</a> <img alt="video 2" src="/files/ftp_upload/54359/54359video2.jpg" /> Video 2: Celest Software Cálculo de mapas individuales curvatura de las Actuaciones de natación de los animales ensayados. Los mapas de curvatura se calculan en el fondo; que no aparecen en la interfaz de software con el usuario. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54359/Video2.mov" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo. (Haga clic aquí para descargar.)</a> <img alt="video 3" src="/files/ftp_upload/54359/54359video3.jpg" /> Video 3: Software de cálculo de las medidas de baño individuales basados en mapas de curvatura. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54359/Video3.mov" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo. (Haga clic aquí para descargar.)</a> <img alt="vídeo 4" src="/files/ftp_upload/54359/54359video4.jpg" /> Video 4: Cálculo Software de Medidas de natación que no dependen de la curvaturaMapas. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54359/Video4.mov" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo. (Haga clic aquí para descargar.)</a>

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Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Se describe una metodología eficiente y simple para el análisis computarizado de comportamiento natatorio nematodos en líquido. El método requiere poca o ninguna inversión para C. elegans laboratorios. El hardware utilizado es estándar, y los programas de ordenador para el análisis del comportamiento (Celeste) es un código abierto uno.

El análisis automatizado de<em&gt; C. elegans</em&gt; Comportamiento de la nadada El uso de software Célest

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...

automated-analysis-of-c-elegans-swim-behavior-using-celest-software

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

12.3K vistas.  Rutgers University.  Se describe una metodología eficiente y simple para el análisis computarizado de comportamiento natatorio nematodos en líquido. El método requiere poca o ninguna inversión para C. elegans laboratorios. El hardware utilizado es estándar, y los programas de ordenador para el análisis del comportamiento (Celeste) es un código abierto uno. 

Video: Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant mechanism(s) of toxicity are still unclear. A&beta; is also deposited intramuscularly in Inclusion Body Myositis, a severe human myopathy. The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express human A&beta;. Depending on the tissue or timing of A&beta; expression, transgenic worms can have readily measurable phenotypes that serve as a read-out of A&beta; toxicity. For example, transgenic worms with pan-neuronal A&beta; expression have defects is associative learning (Dosanjh et al. 2009), while transgenic worms with constitutive muscle-specific expression show a progressive, age-dependent paralysis phenotype (Link, 1995; Cohen et al. 2006). One particularly useful C. elegans model employs a temperature-sensitive mutation in the mRNA surveillance system to engineer temperature-inducible muscle expression of an A&beta; transgene, resulting in a reproducible paralysis phenotype upon temperature upshift (Link et al. 2003). Treatments that counter A&beta; toxicity in this model [e.g., expression of a protective transgene (Hassan et al. 2009) or exposure to Ginkgo biloba extracts (Wu et al. 2006)] reproducibly alter the rate of paralysis induced by temperature upshift of these transgenic worms. Here we describe our protocol for measuring the rate of paralysis in this transgenic C. elegans model, with particular attention to experimental variables that can influence this measurement.

Assaying &#946;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express the human &beta;-amyloid peptide (A&beta;). Induced expression of A&beta; in C. elegans muscle leads to a rapid, reproducible paralysis phenotype that can be used to monitor treatments that modulate A&beta; toxicity.

Ensayo β-amiloide toxicidad con un transgénico C. elegans Modelo

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant ...

Investigación

Neurociencias

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

En vivo láser axotomía en C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, robust, and simple to manipulate. A suitable model has been found in the optokinetic response (OKR), a reflexive behavior present in all vertebrates due to its high selection value. The OKR involves slow stimulus-following movements of eyes alternated with rapid resetting saccades. The measurement of this behavior is easily carried out in zebrafish larvae, due to its early and stable onset (fully developed after 96 hours post fertilization (hpf)), and benefitting from the thorough knowledge about zebrafish genetics, for decades one of the favored model organisms in this field. Meanwhile the analysis of similar mechanisms in adult fish has gained importance, particularly for pharmacological and toxicological applications.
Here we describe VisioTracker, a fully automated, high-throughput system for quantitative analysis of visual performance. The system is based on research carried out in the group of Prof. Stephan Neuhauss and was re-designed by TSE Systems. It consists of an immobilizing device for small fish monitored by a high-quality video camera equipped with a high-resolution zoom lens. The fish container is surrounded by a drum screen, upon which computer-generated stimulus patterns can be projected. Eye movements are recorded and automatically analyzed by the VisioTracker software package in real time.
Data analysis enables immediate recognition of parameters such as slow and fast phase duration, movement cycle frequency, slow-phase gain, visual acuity, and contrast sensitivity.
Typical results allow for example the rapid identification of visual system mutants that show no apparent alteration in wild type morphology, or the determination of quantitative effects of pharmacological or toxic and mutagenic agents on visual system performance.

The VisioTracker is an automated system for the quantitative analysis of visual performance of larval and small adult fish based on the recording of eye movements. It features full control over visual stimulus properties and real-time analysis, enabling high-throughput research in fields such as visual system development and function, pharmacology, neural circuit studies and sensorimotor integration.

VisioTracker, un enfoque innovador para el análisis automatizado oculomotor

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

The Mouse Forced Swim Test

The forced swim test is a rodent behavioral test used for evaluation of antidepressant drugs, antidepressant efficacy of new compounds, and experimental manipulations that are aimed at rendering or preventing depressive-like states. Mice are placed in an inescapable transparent tank that is filled with water and their escape related mobility behavior is measured. The forced swim test is straightforward to conduct reliably and it requires minimal specialized equipment. Successful implementation of the forced swim test requires adherence to certain procedural details and minimization of unwarranted stress to the mice. In the protocol description and the accompanying video, we explain how to conduct the mouse version of this test with emphasis on potential pitfalls that may be detrimental to interpretation of results and how to avoid them. Additionally, we explain how the behaviors manifested in the test are assessed.

The forced swim test is validated as an experimental approach to assess potential antidepressant efficacy in rodents. Experimental animals are placed in a tank of water and escape-related mobility behavior is quantified. The common procedures for the mouse version of this test are described.

El ratón de prueba de natación forzada

The forced swim test is a rodent behavioral test used for evaluation of antidepressant drugs, antidepressant efficacy of new compounds, and experimental ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

La cuantificación automática de la fluorescencia en el Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. elegans Seguimiento y Medición del Comportamiento

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Una lectura molecular de adaptación a largo plazo olfativa en<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Formación de imágenes in vivo de calcio neuronal en C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

Visualizar Neuroblast Citocinesis Durante<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriogénesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

En vivo de imágenes de Dauer-específica neuronal Remodelación en C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...