Los autores desean reconocer que este trabajo recibió el apoyo de las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC) subvención.

<ol>
	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Sequencing+Consortium.+Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans:+a+platform+for+investigating+biology.">C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282, 2012-2018 (1998).</li><li>Pennisi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worming+secrets+from+the+C.+elegans+genome.">Worming secrets from the C. elegans genome.</a> Science. 282, 1972-1974 (1998).</li><li>Tabara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rde-1+gene,+RNA+interference,+and+transposon+silencing+in+C.+elegans.">The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans.</a> Cell. 99, 123-132 (1999).</li><li>Chisholm, A. D., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Epidermal morphogenesis. WormBook. The C. elegans Research Community. , 1-22 (2005).</li><li>Zhang, H., Gally, C., Labouesse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+morphogenesis:+how+multiple+cells+cooperate+to+generate+a+tissue.">Tissue morphogenesis: how multiple cells cooperate to generate a tissue.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 22, 575-582 (2010).</li><li>Kiehart, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing:+the+power+of+the+purse+string.">Wound healing: the power of the purse string.</a> Curr. Biol. 9, 602-605 (1999).</li><li>Ikegami, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+and+Eph+receptor+signaling+guide+a+series+of+cell+movements+for+ventral+enclosure+in+C.+elegans.">Semaphorin and Eph receptor signaling guide a series of cell movements for ventral enclosure in C. elegans.</a> Curr. Biol. 22, 1-11 (2012).</li><li>Chin-Sang, I. D., George, S. E., Ding, M., Moseley, S. L., Lynch, A. S., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ephrin+VAB-2/EFN-1+functions+in+neuronal+signaling+to+regulate+epidermal+morphogenesis+in+C.+elegans.">The ephrin VAB-2/EFN-1 functions in neuronal signaling to regulate epidermal morphogenesis in C. elegans.</a> C. elegans. Cell. 99, 781-790 (1999).</li><li>Wang, X., Roy, P. J., Holland, S. J., Zhang, L. W., Culotti, J. G., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Ephrins+Control+Cell+Organization+in+C.+elegans+Using+Kinase-Dependent+and+-Independent+Functions+of+the+VAB-1+Eph.">Multiple Ephrins Control Cell Organization in C. elegans Using Kinase-Dependent and -Independent Functions of the VAB-1 Eph.</a> Mol. Cell. 4, 903-913 (1999).</li><li>Chin-Sang, I. D., Moseley, S. L., Ding, M., Harrington, R. J., George, S. E., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+divergent+C.+elegans+ephrin+EFN-4+functions+in+embryonic+morphogenesis+in+a+pathway+independent+of+the+VAB-1+Eph+receptor.">The divergent C. elegans ephrin EFN-4 functions in embryonic morphogenesis in a pathway independent of the VAB-1 Eph receptor.</a> Development. 129, 5499-5510 (2002).</li><li>Ghenea, S., Boudreau, J. R., Lague, N. P., Chin-Sang, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+VAB-1+Eph+receptor+tyrosine+kinase+and+SAX-3/Robo+neuronal+receptors+function+together+during+C.+elegans+embryonic+morphogenesis.">The VAB-1 Eph receptor tyrosine kinase and SAX-3/Robo neuronal receptors function together during C. elegans embryonic morphogenesis.</a> Development. 132, 3679-3690 (2005).</li><li>Bernadskaya, Y. Y., Wallace, A., Nguyen, J., Mohler, W. A., Soto, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UNC-40/DCC,+SAX-3/Robo,+and+VAB-1/Eph+polarize+F-actin+during+embryonic+morphogenesis+by+regulating+the+WAVE/SCAR+actin+nucleation+complex.">UNC-40/DCC, SAX-3/Robo, and VAB-1/Eph polarize F-actin during embryonic morphogenesis by regulating the WAVE/SCAR actin nucleation complex.</a> PLoS Genet. 8, (2012).</li><li>Piekny, A. J., Werner, M., Glotzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis:+welcome+to+the+Rho+zone.">Cytokinesis: welcome to the Rho zone.</a> Trends Cell Biol. 15, 651-658 (2005).</li><li>Piekny, A. J., Maddox, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myriad+roles+of+Anillin+during+cytokinesis.">The myriad roles of Anillin during cytokinesis.</a> Sem. Cell Dev. Biol. 21, 881-891 (2010).</li><li>Zhao, W. M., Fang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anillin+is+a+substrate+of+anaphase-promoting+complex/cyclosome+(APC/C)+that+controls+spatial+contractility+of+myosin+during+late+cytokinesis.">Anillin is a substrate of anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) that controls spatial contractility of myosin during late cytokinesis.</a> J. Biol. Chem. 280, 33516-33524 (2005).</li><li>Piekny, A. J., Glotzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anillin+is+a+scaffold+protein+that+links+RhoA,+actin+and+myosin+during+cytokinesis.">Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin and myosin during cytokinesis.</a> Curr. Biol. 18, 30-36 (2008).</li><li>Hickson, G. R., O&#8217;Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-dependent+control+of+anillin+behavior+during+cytokinesis.">Rho-dependent control of anillin behavior during cytokinesis.</a> J. Cell Biol. 180, 285-294 (2008).</li><li>Fraser, A. G., Kamath, R. S., Zipperlen, P., Martinez-Campos, M., Sohrmann, M., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+chromosome+I+by+systematic+RNA+interference.">Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference.</a> Nature. 408, 325-330 (2000).</li><li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi.">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li><li>Duerr, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunohistochemistry. WormBook, The C. elegans Research Community. , 1-61 (2006).</li><li>Maddox, A. S., Habermann, B., Desai, A., Oegema, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+two+C.+elegans+anillins+in+the+gonad+and+early+embryo.">Distinct roles for two C. elegans anillins in the gonad and early embryo.</a> Development. 132, 2837-2848 (2005).</li><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 100, 64-119 (1983).</li><li>Chin-Sang, I. D., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Form+of+the+worm:+genetics+of+epidermal+morphogenesis+in+C.+elegans.">Form of the worm: genetics of epidermal morphogenesis in C. elegans.</a> Trends Genet. 16, 544-551 (2000).</li><li>Zhang, H., Labouesse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+through+mechanical+inputs+&#8211;+a+coordinated+process.">Signaling through mechanical inputs &#8211; a coordinated process.</a> J. Cell Sci. 125, 3039-3049 (2012).</li><li>Guenther, C., Garriga, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+distribution+of+the+C.+elegans+HAM-1+protein+in+neuroblasts+enables+daughter+cells+to+adopt+distinct+fates.">Asymmetric distribution of the C. elegans HAM-1 protein in neuroblasts enables daughter cells to adopt distinct fates.</a> Development. 122, 3509-3518 (1996).</li><li>Audhya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+containing+the+Sm+protein+CAR-1+and+the+RNA+helicase+CGH-1+is+required+for+embryonic+cytokinesis+in+Caenorhabditis+elegans.">A complex containing the Sm protein CAR-1 and the RNA helicase CGH-1 is required for embryonic cytokinesis in Caenorhabditis elegans.</a> J. Cell Biol. 171, 267-279 (2005).</li><li>Maddox, A. S., Lewellyn , L., Desai, A., Oegema, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anillin+and+the+septins+promote+asymmetric+ingression+of+the+cytokinetic+furrow.">Anillin and the septins promote asymmetric ingression of the cytokinetic furrow.</a> Dev. Cell. 12, 827-835 (2007).</li><li>Dorn, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actomyosin+tube+formation+in+polar+body+cytokinesis+requires+Anillin+in+C.+elegans.">Actomyosin tube formation in polar body cytokinesis requires Anillin in C. elegans.</a> Curr. Biol. 20, 2046-2051 (2010).</li><li>Calixto, A., Ma, C., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+neuronal+RNAi+in+C.+elegans+using+SID-1.">Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1.</a> Nat. Methods. 7, 554-559 (2010).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe el uso de diversos tipos de microscopía de divisiones celulares imagen durante mediados embriogénesis. En particular, este protocolo pone de relieve cómo la imagen de la división de los neuroblastos, células que pueden facilitar la morfogénesis epidérmica. La comunicación de célula de la célula es importante para la formación de tejido durante el desarrollo de los metazoos y C. elegans es un modelo excelente para estudiar la formación de tejido in vivo. Un evento que representa muy bien la interacción de los tejidos es la morfogénesis epidérmica, que cubre el embrión en una capa de células epiteliales. En particular, el recinto ventral es el proceso en el que las células epidérmicas ventrales migran para encerrar la superficie ventral del embrión, y se basa en los neuroblastos subyacentes. Los neuroblastos proporcionan señales químicas o mecánicas, y el recinto ventral se ve comprometida si se altera la posición de los neuroblastos. El número (o polaridad) de neuroblastos también pueden ser esenciales para el recinto ventral que se produzca adecuadamente,y es importante para entender los mecanismos que regulan su división. Este protocolo se describe cómo la división celular imagen dentro de un tejido vivo usando C. elegans embriones coexpressing dos sondas fluorescentes (mCherry: PH para delinear las membranas plasmáticas y HAM-1: las buenas prácticas agrarias para etiquetar los núcleos neuroblastos). Los pasos más esenciales para la imagen C. viven elegans embriones que expresan sondas fluorescentes son: i) utilizar, hermafroditas sanos jóvenes adultos que expresan los marcadores fluorescentes deseados (mantenidas a 20-25 ° C), ii) utilizar mutantes o RNAi para estudiar los requisitos de genes durante la formación de los tejidos, iii) recoger los embriones en el la derecha del escenario para microscopía (por ejemplo. mediados embriogénesis), y iv) realizar microscopía de fluorescencia con los ajustes optimizados para mantener fototoxicidad bajo, pero para mantener una alta calidad de imagen. Para identificar las células específicas y / o compartimentos intracelulares dentro de un tejido de interés, utilice gusanos expresan marcadores etiquetados con pro fluorescentebes. El Centro de Genética Caenorhabditis (CGC; http://www.cbs.umn.edu/cgc) ofrece una variedad de cepas que coexpresan marcadores múltiples. Sin embargo, dos cepas (cada una expresando un único marcador de interés) pueden tener que ser cruzado y examinados con un microscopio de fluorescencia durante varias generaciones para generar una cepa que expresa de forma estable ambas sondas. Por ejemplo, para llevar a cabo este protocolo experimental, una cepa que expresa un marcador para visualizar las membranas celulares (mCherry: Ph; OP70) se cruzó con una cepa que expresa un marcador para visualizar los núcleos de neuroblastos (HAM-1: GFP; OP102) para generar una cepa coexpressing ambos. La mejor manera de estudiar los requisitos de genes durante el desarrollo embrionario es llevar a cabo experimentos de pérdida de función, donde el producto génico es derribado o mutado. Este protocolo experimental se describe la realización de RNAi contra anillin (ani-1) para reducir endógenos ANI-1 los niveles en todos los tejidos embrionarios. Hay alelos hypomorphic no bien caracterizadosde ani-1. Por lo tanto, el ARNi es la mejor opción para examinar la pérdida de ani-1 &#39;s de fenotipos funcionales y determinar su función durante el desarrollo embrionario. Típicamente, es mejor utilizar mutantes en lugar de ARNi, como la eficiencia de la precipitación puede ser variable y rara vez es nulo. Uno de los problemas más comunes con la alimentación de los protocolos de ARNi es la contaminación, lo que reducirá la eficiencia de RNAi. Para disminuir el riesgo de contaminación, preparar las placas y el alimento de RNAi en condiciones asépticas. La contaminación puede ser detectada mediante el cribado de algunas de las placas antes de su uso, y placas con bacterias lechosas / opacas que buscan debe ser desechada. Otro problema que puede reducir la eficiencia de RNAi es por no elegir hermafroditas en la etapa de desarrollo derecho. Lo mejor es usar gusanos adultos L4 escenificados o jóvenes (la vulva desarrollo aparece como un círculo / agujero blanquecino en la parte ventral del gusano), que no tienen / pocos embriones fertilizados. Además, las condiciones y tratamientos de RNAi may variar para los diferentes productos génicos. Diferentes maneras para aumentar o disminuir la fuerza de la RNAi es resuspendiendo las bacterias HT115 sedimentadas en diferentes cantidades de medio LB Amp (ver Sección 1.2.2), y mediante la alteración de la duración del tratamiento de RNAi (longitud de tiempo que los gusanos se mantienen en placas de RNAi, véase el Protocolo no 3). Para obtener óptimos ani-1 RNAi fenotipos para este protocolo, las bacterias se resuspendieron en 500 l de medio LB Amp y gusanos se mantuvieron en placas de RNAi durante 2 días (ani-1 RNAi se caracterizó previamente por Maddox et al. 23). Cepas resistentes o sensibles RNAi (por ejemplo. Rde-1, SID-1 o RRF-3) también se pueden usar para alterar la fuerza de ARNi. Más importante, estas cepas se pueden acoplar con la expresión específica de tejido de sus genes tipo salvaje para crear cepas sensibles de tejidos. Por ejemplo, para llevar a cabo los neuroblastos específica de RNAi, se podría utilizar SID-1 embriones mutantes (RNAi-resistente) que expresan en peso <em&gt; Sid-1 bajo el promotor UNC-119 (ID deformación a la CGC TU3401) 31. Este protocolo se describe cómo la división de imagen de la célula neuroblast mediados embriogénesis. Hay varios aspectos del protocolo que requieren una cuidadosa consideración, tales como el estado de desarrollo de los embriones, la recogida de los Z-pilas adecuadas y la optimización de las condiciones de formación de imágenes para minimizar fototoxicidad sin comprometer la calidad de imagen. Para capturar momentos de la hora a la fase de desarrollo a la derecha (por ejemplo recinto ventral), los embriones deben ser filmados de intercalación dorsal (pares de células de la epidermis dorsal se entrecruzan y se fusionan para formar una sola capa de la epidermis en el lado dorsal del embrión; Figura 1A6). En este momento, los neuroblastos están dividiendo rápidamente. Desde la organización de los embriones puede ser difícil bajo bajo aumento (por ejemplo, usando un microscopio de disección), que ayuda a recolectar muchos embriones de diferentes etapas y embriones en ella derecha del escenario se puede seleccionar con mayor aumento. Los neuroblastos son relativamente pequeñas y delgadas, y se encuentran en todo el centro del embrión. Es esencial para optimizar el número y el tamaño de Z-pilas para asegurar que se captura toda la célula durante la división. Por ejemplo, la recogida de demasiadas imágenes expondrá embriones a más luz y hacerlos propensos a la fototoxicidad. Sin embargo, la recogida de muy pocos Z-pilas o utilizando secciones Z gruesos podría hacer más difícil la imagen correctamente una célula entera neuroblast divisoria. Este protocolo describe el uso de un microscopio confocal de barrido de campo o un sistema de división de imagen de campo amplio de células de neuroblastos. Como se describió anteriormente, una de las principales limitaciones del uso de un microscopio de epifluorescencia de campo amplio es el potencial de fototoxicidad. Si bien es muy recomendable utilizar un disco giratorio confocal o confocal de barrido de campo para la imagen C. elegans embriones, algunos laboratorios pueden tener acceso limitado a estos sistemas. Esta pROTOCOLO da algunas sugerencias para limitar fototoxicidad cuando se utilizan sistemas de campo amplio, tales como el cierre de la abertura a 30%, la reducción de la intensidad de luz de la bombilla de mercurio (o preferiblemente el uso de LEDs), usando una cámara EMCCD, y el aumento de la ganancia o binning para permitir una disminución en el tiempo de exposición. El número de Z-pilas y puntos temporales también se limitará el uso de un sistema de campo amplio. Aunque no se describe en este protocolo, el disco giratorio microscopio confocal se utiliza comúnmente para la formación de imágenes en vivo, ya que causa baja fototoxicidad en comparación con un microscopio de campo amplio. Similar al sistema de campo de barrido, que utiliza láseres de estado sólido y dispersa la luz (aunque en una forma diferente respecto al campo de barrido). Cualquiera de las cámaras CCD o EMCCD se pueden utilizar con el sistema de disco giratorio, que a menudo tiene múltiples puertos de la cámara para permitir la formación de imágenes doble. Al igual que en el microscopio de campo barrido, las imágenes se pueden capturar con tiempos de exposición de 50-90% más baja respecto al sistema de campo amplio. Esta protocol se puede utilizar para estudiar la función de varios genes que regulan la mitosis durante la formación de tejido. El tiempo entre cada imagen podría reducirse (por ej. Cada 15 a 30 segundos vs. 2-3 min) para visualizar mejor los fenotipos mitótico. Diferentes sondas podrían ser utilizados (por ejemplo, en lugar de utilizar la HAM-1: GFP, H2B-etiquetado fluorescente podría ser utilizado para visualizar el ADN, y / o fluorescente marcado tubulina se podría utilizar para visualizar husos mitóticos.). El número de Z-pilas y el espesor de cada pila también podría ser alterado (por ejemplo, más pilas de un tamaño de paso más pequeño). Como se describió anteriormente, la elección de la configuración apropiada es crucial para limitar la fototoxicidad y la optimización de la calidad de imagen. A pesar de que la mCherry: PH y HAM-1: sondas GFP expresan en niveles relativamente altos, la recogida de los puntos de tiempo más rápidos, lo que aumenta el número de Z-pilas o imágenes durante períodos más largos de tiempo frente a lo que se describe en este protocolo no puede ser posible en un sistema de campo amplio. Un im basada en Javaprograma de procesamiento de edad (ImageJ, NIH) se puede utilizar para procesar las imágenes recogidas por los diferentes microscopios y las imágenes se pueden exportar como archivos TIFF. Sin embargo, dependiendo del software utilizado para la adquisición, los archivos podrían ya ser compatible con el software de procesamiento. Es mejor abrir archivos originales vs imágenes exportadas (por ejemplo, TIFF), ya que los metadatos se mantiene con los archivos originales. Software de procesamiento puede ser usado para manipular las imágenes para la fabricación de figuras o películas. Además, los análisis cuantitativos también se pueden realizar, como la medición de intensidades de los píxeles en las regiones seleccionadas. Software óptimo debe seleccionarse en función del análisis, tales como procesamiento de imágenes Toolbox (MathWorks, Matlab) o 3D y 4D en tiempo real Interactive Data Visualization (Imaris, Bitplane). Usando este protocolo, se mostró ani-1 que se requiere para la citocinesis neuroblastos, a pesar de que no se requiere para la citocinesis en el embrión temprano. Curiosamente, mediante el control de la numbre y la posición de los neuroblastos, ani-1 pueden regular la migración de las células epidérmicas ventrales para recinto ventral, ya que los neuroblastos proporcionan señales químicas o mecánicas a las células epiteliales suprayacentes. Sin embargo, no se sabe si se requiere ani-1 para la división o cambio de forma de otros tipos de células durante la embriogénesis tardía mediados. Mostrando cómo la composición total de un tejido afecta a los tejidos vecinos hace hincapié en la importancia de la comunicación tejidos durante el desarrollo de los metazoos.

Aunque existen protocolos que describen cómo la división celular la imagen a principios del C. elegans embrión, este protocolo se describe cómo la división celular la imagen dentro de un tejido a mediados embriogénesis. Uno de los principales retos en la formación de imágenes organismos durante el desarrollo ha sido su sensibilidad a la fototoxicidad. Sin embargo, el aumento de la accesibilidad a hilar microscopios confocal de disco o microscopios de campo de barrido ha permitido aplicaciones de imagen más extendidos. Ambos sistemas utilizan láseres de estado sólido y la luz difusa, lo que limita los niveles de radiación UV que los organismos están expuestos. Sin embargo, puestos de campo amplio todavía se puede utilizar para obtener imágenes in vivo, sobre todo si están equipados con cámaras con alta sensibilidad (por ejemplo EMCCD), control de apertura y control de luz (por ejemplo, LEDs o bombillas de mercurio ajustables). Este protocolo describe cómo utilizar bien un sistema confocal o basado en un sistema de campo amplio para la división celular en el desarrollo de la imagen C. elegans &lt;/ Em&gt; embriones. A modo de ejemplo, se describe cómo reproducir la división celular neuroblastos. Los neuroblastos pueden facilitar la morfogénesis epidérmica proporcionando señales químicas o mecánicas a las células de la epidermis suprayacente, y proporcionar un excelente ejemplo de la importancia de la comunicación intercelular en la formación de tejidos. Caenorhabditis elegans es un organismo modelo ideal para estudios basados ​​en la microscopía, debido a su transparencia y simple organización del tejido 1. Además, C. elegans es susceptible de métodos genéticos y de ARNi, y dado que muchos de sus genes tienen homólogos humanos, puede ser utilizado para identificar los mecanismos conservadas para la formación de tejido 2-5. En C. elegans, la formación de la epidermis ocurre durante la mitad la embriogénesis, cuando el embrión tiene&gt; 300 células. Morfogénesis epidérmico se compone de varias fases principales, durante el cual el embrión está encerrado en una capa de células epidérmicas que constriñen y se extienden para transformar la EMBRyo desde una forma ovoide en la forma alargada de un tornillo sin fin 6. Recinto ventral describe uno de estos eventos morfogenéticos, cuando las células epidérmicas ventrales migran hacia la línea media ventral para cubrir la superficie ventral del embrión (Figura 1). En primer lugar, dos pares de anteriores situada células principales del borde migran hacia la línea media ventral, donde se adhieren y se fusionan con sus vecinos contralaterales 6. Esto es seguido por la migración de las células de bolsillo posterior situado, que forman cuña formas creando un bolsillo ventral 6-7. El mecanismo que cierra el bolsillo no se entiende bien. Una posibilidad es que una estructura contráctil miosina actina supracellular ata las células de bolsillo juntos en un cordón de bolsa como la moda, similar a la cicatrización de la herida 8. Curiosamente, la migración de algunas de las células de bolsillo está mediada por subconjuntos específicos de neuroblastos subyacentes 9 (precursores neuronales que se encuentran debajo de la epidermis; Figura 1B). Estudios anteriores mostraron que los neuroblastos regulan la migración de las células epidérmicas ventrales y recinto ventral. VAB-1 (receptor de Efrina) y VAB-2 (Efrina ligando) son altamente expresado en los neuroblastos y facilitar la clasificación de los neuroblastos anterior y posterior entre sí, y mutaciones en VAB-1 o VAB-2 causa recinto ventral fenotipos 10-13. Sin embargo, experimentos de rescate promotoras mostraron que también se requiere VAB-1 en las células epidérmicas ventrales suprayacentes y receptores para otras señales de orientación secretadas por los neuroblastos se expresan en las células epidérmicas ventrales 9. Aunque las mutaciones en cualquiera de estos receptores causan fenotipos recinto ventrales, no está claro si surgen defectos debido a problemas en el posicionamiento de los neuroblastos o por insuficiencia de las células epidérmicas ventrales para responder a la orientación Tacos de 14. La alteración de la división de wi neuroblastosthout que afecta su capacidad para secretar señales de orientación podría arrojar luz sobre el papel de los neuroblastos y su capacidad para proporcionar energía mecánica durante la morfogénesis epidérmica. Recientemente, se encontró que un gen de la división celular, ani-1 (anillin) es altamente expresado en los neuroblastos (figura 2A) y su agotamiento causa defectos de división de neuroblastos. Curiosamente, estos embriones exhiben fenotipos recinto ventrales (Fotopoulos, Wernike y Piękny, observaciones no publicadas). Anillin se requiere para la división celular, y en particular para la citocinesis, que describe el proceso en el que una célula madre divide físicamente en dos células hijas. La citocinesis es impulsado por la formación de un anillo contráctil actomiosina, que debe ser estrechamente controlada en el espacio y el tiempo para asegurarse de que está acoplado correctamente con la segregación de cromátidas hermanas. El regulador maestro de la citocinesis metazoos es RhoA (RHO-1 en C. elegans), una pequeña GTPasa que es unctive en su forma unida a GTP. El FMAM Ect2/ECT-2 activa RhoA, después de lo cual RhoA-GTP interactúa con los efectores que forman el anillo contráctil y median su ingresión 15. Anillin es una proteína de dominio múltiple que se une a RhoA a través de su C-terminal y a la actina y la miosina a través de su extremo N-terminal. Anillin se requiere para estabilizar la posición del anillo contráctil en células de mamífero o de Drosophila S2 16. Agotamiento Anillin causa anillos contráctiles a someterse a oscilaciones laterales, y la citocinesis finalmente falla la formación de células multinucleadas 17-19. Curiosamente, a pesar C. elegans ani-1 coordina la contractilidad actomiosina en el embrión temprano, no es esencial para la citocinesis. Sin embargo, como se describió anteriormente, se requiere ani-1 para la citocinesis neuroblastos durante la mitad de la embriogénesis (Fotopoulos, Wernike y Piękny, observaciones no publicadas). Fracaso Citocinesis alteraría el número y posición de los neuroblastos y podría afectar a la locción de señales de orientación químicos, o podría alterar las propiedades mecánicas del tejido. Ambos modelos destacan el papel no autónoma de neuroblastos de cerramiento ventral, y la importancia de la comunicación de tejidos tejidos durante el desarrollo embrionario. Este protocolo experimental se describe cómo la división celular imagen durante la C. elegans mediados embriogénesis mediante microscopía de fluorescencia. La mayoría de los experimentos que estudian los mecanismos de la división celular se realizaron en células individuales dentro de placas de cultivo (por ejemplo. HeLa o células S2) o en embriones tempranos con un número limitado de células (por ejemplo, C. elegans embrión de una célula, de Xenopus, o equinodermo embriones). Sin embargo, es importante para estudiar la división celular también dentro de los tejidos, ya que hay señales externas que pueden influir en el tiempo y la colocación del plano de división. Además, las células pueden proporcionar señales químicas o mecánicas para influir en el desarrollo de los tejidos vecinoss, y es importante entender cómo la comunicación intercelular ayuda a los tejidos para formar durante el desarrollo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1056">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Agar</td>
			<td style="width:247px;">BioShop Canada Inc.</td>
			<td style="width:185px;">#AGR001.1</td>
			<td style="width:335px;">For making C. elegans NGM and RNAi plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Bio Basic Inc.</td>
			<td>#9002-18-0</td>
			<td>For making bacteria LB agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>#AGA001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-mouse Alexa 488 antibody</td>
			<td>Life Technologies Corporation (Invitrogen)</td>
			<td>#A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-mouse anti-GFP antibody</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>#11814460001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-rabbit Alexa 568 antibody</td>
			<td>Life Technologies Corporation (Invitrogen)</td>
			<td>#A11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>#AMP201.5</td>
			<td>Store powder at 4 &#176;C and dissolved ampicillin at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bactopetone&#160; (peptone-A)</td>
			<td>Bio Basic Inc.</td>
			<td>#G213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2 (calcium chloride)</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>#C302.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cholesterol</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>#CHL380.25</td>
			<td>Dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>#D9542</td>
			<td>Use to stain nucleic acids (DNA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>#GLY001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IPTG (isopropylthio-&#946;-galactoside)</td>
			<td>Bio Basic Inc.</td>
			<td>#367-93-1</td>
			<td>Store powder and dissolved IPTG at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic)</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>#PPM666.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic)</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>#PPD303.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L4440&#160; (feeding vector)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#1654</td>
			<td>Keep as glycerol stock at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4&#160;&#160; (magnesium sulfate)</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>#MAG511.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl (sodium chloride)</td>
			<td>Bio Basic Inc.</td>
			<td>#7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4 (sodium phosphate, dibasic)</td>
			<td>Bio Basic Inc.</td>
			<td>#7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Donkey Serum (NDS)</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>#035-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">n-propyl 3.4.5-trihydroxybenzoate (propyl gallate)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>#A10877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>#P8920</td>
			<td>For optimal results coat microscope slides three times&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptomycin</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>#STP101.50</td>
			<td>Store powder at 4 &#176;C and dissolved streptomycin at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetracyclin</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>#TET701.10</td>
			<td>Store powder at 4 &#176;C and dissolved tetracycline at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Bio Basic Inc.</td>
			<td>CAS#9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>#TRP402.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>Bio Basic Inc.</td>
			<td>#8013-01-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing neuroblast cytokinesis during c. elegans embryogenesis

Este protocolo describe el uso de microscopía de fluorescencia a la imagen dentro de la división de células en desarrollo Caenorhabditis elegans embriones. En particular, este protocolo se centra en la forma de imagen dividiendo neuroblastos, que se encuentran por debajo de las células de la epidermis y puede ser importante para la morfogénesis epidérmica. La formación de tejidos es crucial para el desarrollo de los metazoos y se basa en las señales externas de los tejidos vecinos. C. elegans es un organismo modelo excelente para estudiar la morfogénesis de tejidos in vivo debido a su transparencia y organización sencilla, haciendo que sus tejidos fácil de estudiar a través de microscopía. Recinto ventral es el proceso donde la superficie ventral del embrión está cubierto por una capa única de células epiteliales. Este evento se piensa que es facilitado por los neuroblastos subyacentes, que proporcionan señales de orientación química para mediar en la migración de las células epiteliales suprayacentes. Sin embargo, los neuroblastos son altamente proliferativa y también pueden actuarcomo un sustrato mecánico para las células epidérmicas ventrales. Los estudios que utilizan este protocolo experimental podrían descubrir la importancia de la comunicación intercelular durante la formación de tejido, y podrían utilizarse para revelar las funciones de los genes implicados en la división celular dentro de los tejidos en desarrollo.

Este protocolo experimental se describe cómo la división celular en la imagen C. elegans embriones durante mediados de la embriogénesis. En particular, se describe cómo los neuroblastos de la imagen, lo que puede facilitar la morfogénesis epidérmica. Morfogénesis epidérmico se produce debido a una combinación de cambios en la forma de células epidérmicas, la migración y la adhesión, pero también se basa en señales químicas o mecánicas de los neuroblastos subyacentes (Figura 1B). Los neuroblastos secretan las señales de orientación que son recibidas por los receptores en la superficie de las células epidérmicas ventrales, que regula su 10,14,25 migración. Además, los neuroblastos son altamente proliferativa, que puede proporcionar las fuerzas mecánicas que contribuyen a la migración de las células epidérmicas ventrales 26. Este protocolo se puede utilizar para estudiar la división celular neuroblastos durante mediados embriogénesis. En primer lugar, los embriones coexpressing marcadores para visualizar neuroblastos se generan:: (PH mCherry) (HAM-1 GFP) de someterse a la citocinesis. HAM-1: GFP expresa GFP (proteína verde fluorescente) etiquetados proteína que se localiza en neuroblast núcleos 27, y es necesario el uso, ya que hay muchos otros tipos de células presentes durante mediados de la embriogénesis (&gt; 300 células; Figura 3). Esto también actúa como un buen marcador para la división de las células, ya que el ADN se condensa en los cromosomas durante la mitosis. mCherry: PH es una proteína fluorescente de etiquetado mCherry que se expresa por un promotor materna (PIE-1), y contiene el dominio de unión de lípidos de PLC1 ∂ 1 28, que se localiza en las membranas celulares. Esta proteína se necesita para visualizar la citocinesis, cuando la membrana y el citosol pellizco en separar la célula madre en dos células hijas; Figura 3; vídeo 1). Aunque este protocolo se describe cómo la imagen división neuroblastos, (mostrado por HAM-1: la expresión de GFP), otros marcadores podrían usarse para visualizar otros tipos de células. Para visualizar la división de los neuroblastos, embriones coexpressing HAM-1: GFP y mCherry: PH son expuestas cada 2 minutos (para un total de 10 min). Cada neuroblast es sólo ~ 1.4 m de diámetro, y es &lt;1 m de espesor, y lo mejor es utilizar un objetivo con gran aumento (por ejemplo. 100X). Por otra parte, numerosos Z-pilas (~ 20) se recogen con un tamaño de paso pequeño (0,2 m) para asegurar que los diferentes ángulos de cada célula (de forma esférica) se crean imágenes. Para recoger esta cantidad de imágenes sin comprometer los puntos de tiempo, se recomienda una etapa altamente motorizados (por ejemplo Piezo Z Stage). Después de recoger una serie de imágenes, que se analizan para detectar células dentro de unos Z-pilas que se están dividiendo, el ADN se condensa, la membrana se ingressed y las nuevas células hijas están formando (puntos de tiempo de la pila proyectada de los canales combinados están muestran en la Figura 3A, y las pilas seleccionadas de canales fusionadas se muestran en la Figura 3B; vídeo 1). Para visualizar mejor las células, se recomiendamantener a cada canal en escala de grises e invertir las imágenes (por ejemplo, la figura 4). La resolución de la imagen es diferente para el sistema de campo amplio con una cámara CCD de alta resolución (1344 x 1024 píxeles) vs. el sistema de barrido de campo utilizando una cámara EMCCD alta velocidad con alta sensibilidad (~ 35 cuadros / seg y 512 x 512 píxeles). Imágenes invertidas de dividir los neuroblastos a partir de embriones de control adoptadas con ambos sistemas se presentan para la comparación (Figura 4 vs. 5). Como se muestra en la Figura 4A (sistema de campo amplio; vídeo 2), las imágenes son más claras frente a la Figura 5A. (Sistema de campo de barrido; vídeo 4). Sin embargo, cuando se utiliza el sistema de campo amplio, los embriones son susceptibles a la fototoxicidad y los puntos de tiempo más rápidos no son posibles con la cámara de alta resolución. Por ejemplo, para examinar los cambios en la localización de varias proteínas (por ejemplo. To estudiar los cambios en su dinámica), podría ser necesario recopilar más a menudo puntos de tiempo. También, puede que no sea posible la imagen por períodos más largos de tiempo sin reducir el número de Z-pilas y los puntos de tiempo. Utilizando una cámara EMCCD en el sistema de campo amplio puede permitir una gama más amplia de aplicaciones de imagen. Las cámaras que tienen alta resolución y alta velocidad se han desarrollado, pero los conductores pueden no estar disponibles dependiendo del software de adquisición que se utilice, y que todavía pueden no ser tan sensibles como cámaras EMCCD. Otro sistema que se usa comúnmente para la formación de imágenes C. elegans es el confocal de disco giratorio, que también tiene un menor fototoxicidad y se puede equipar con cualquiera EMCCD o cámaras CCD (ver Discusión). Para estudiar los genes que se requieren para la división celular, hermafroditas se tratan con ARNi contra un gen de interés (por ejemplo, ani-1; véanse las Secciones 1.2 y 3 del protocolo) y sus embriones se crean imágenes de la misma manera como control embriones. Para comparar las células a partir de embriones de RNAi para controlar los embriones, lo mejor para la imagen es en etapas similares de desarrollo embrionario (para ayudar a las formas celulares de los partidos y posiciones). Por ejemplo, hay una célula más grande visible en el centro del embrión durante recinto ventral que puede actuar como un buen punto de referencia para los neuroblastos de formación de imágenes (Figuras 4 y 5). El gen estudiado aquí, los ani-1 (anillin), organiza la contractilidad actomiosina, pero no se requiere para la citocinesis en el embrión temprano 23,29-30. Homólogos de anillin, sin embargo, son necesarios para la citocinesis en eucariotas superiores 16 y ani-1 se requiere para la citocinesis neuroblastos (Fotopoulos, Wernike y Piekny, observaciones no publicadas). Como se muestra en las Figuras 4B (vídeo 3) y 5B (vídeo 5), varios neuroblastos iniciar la citocinesis y sus membranas pellizco en, pero en lugar de formar dos hija separadacélulas, sus membranas regresión y las células se vuelven multinucleadas (&gt; 1 núcleo / célula). Debe tenerse en cuenta que ani-1 puede ser necesaria para la división o la forma de cambio de otros tipos de células, que no se revela en este protocolo. Además, este protocolo no muestra resultados de ARNi específico de tejido (ver Discusión). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51188/51188fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51188/51188fig1.jpg" /> Figura 1. Recinto ventral durante C. elegans morfogénesis epidérmica. A) Proyecciones Z-stack (3 Z-pilas de 0,5 m de espesor) de un AJM-1 de control: las buenas prácticas agrarias (marcador de unión adherente de visualizar los límites celulares epidérmicas; ID deformación a la CGC SU159) embriones sometidos intercalación dorsal (izquierda, vista dorsal ) y un control AJM-1: Embrión GFP someterse recinto ventral (a la derecha, vista ventral). Las imágenes son invertidos para una mejor relaciónualize límites de las celdas. B) Dibujos animados muestran vistas ventrales de C. embriones elegans sometidos recinto ventral. En primer lugar, dos pares de células de borde de ataque (azul) utilizan actina rica filopodios (líneas negras) a migrar hacia la línea media ventral (embrión de la izquierda). A continuación, las células de bolsillo ventral posterior (rojo) migran hacia la línea media la creación de un agujero en la superficie ventral que puede cerrar por una bolsa de tabaco como mecanismo (B &#39;; negro punteada línea / círculo, que recuerda a la cicatrización de heridas) 25. También se muestran los neuroblastos subyacentes (como círculos grises). El segundo embrión (B &quot;) muestra cómo la migración de subconjuntos específicos de células epidérmicas están mediadas por un&quot; puente &quot;formado a partir de la reorganización de las células PLX-2/plexin y VAB-1/Ephrin que expresan el receptor &#39;de la banda plexin&#39; (verde círculos). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51188/51188fig1highres.jpg" target="_blank">Haz click aquí para ver la imagen más grande</a>. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51188/51188fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51188/51188fig2.jpg" /> Figura 2. ANI-1 localización en C. elegans embriones. Una) C. Una fijo elegans embrión expresar HMR-1: GFP (E-cadherina, marcador de límites celulares epidérmicas) costained para GFP (verde) y ANI-1 (rojo). Confocal de imágenes de las capas de células exteriores (4 Z-pilas de 0,2 micras de espesor) muestran que las células de la epidermis suprayacente y neuroblastos subyacentes, que son ANI-1 B positivo) fija N2 y N2;. Ani-1 RNAi embriones se tiñeron para co ANI-1. ANI-1 se reduce en gran medida en el embrión ani-1-empobrecido. Las barras de escala: 10 micras. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51188/51188fig2highres.jpg" target="_blank">Haz click aquí para ver la imagen más grande.</a> <p class="jove_content" fo:páginas together.within-keep = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51188/51188fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51188/51188fig3.jpg" /> Figura 3. Visualización dividiendo neuroblast durante C. embriogénesis elegans. proyecciones pila Z (A) (20 Z-pilas de 0,2 m de espesor) se muestran a partir de un embrión de control de la coexpresión de HAM-1: GFP (para visualizar los núcleos neuroblast; verde) y mCherry: PH (para visualizar las membranas celulares; rojo) . Muchos neuroblastos y otros tipos de células son visibles en las proyecciones (b) proyecciones de Z-pila utilizando un número menor de aviones Z se muestran de otro embrión de control de la coexpresión de HAM-1:. GFP (verde) y mCherry: PH (rojo). Un área está ampliada (caja blanca) para mostrar más claramente un neuroblast divisoria individual. Las flechas blancas indican la membrana plasmática ingressing de una célula en división como círculos verdes resaltar el ADN condensado durante la mitosis y recientementeformación de núcleos hijos hacia el final de la mitosis. La célula grande sirve como un punto de referencia (asterisco blanco) para determinar la etapa de desarrollo y la ubicación dentro del embrión. Las barras de escala:. 10 micras (blancos) y 3,5 m (amarillo) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51188/51188fig3highres.jpg" target="_blank">Haz click aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51188/51188fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51188/51188fig4.jpg" /> Figura 4. Visualización citocinesis neuroblast durante C. elegans embriogénesis utilizando un sistema de campo amplio. Proyecciones Z-stack A) invertidos (2 Z-pilas de 0,2 m de espesor) se muestran a partir de un embrión de control coexpressing HAM-1: GFP y mCherry: PH recogido desde el sistema de campo amplio utilizando una cámara CCD de alta resolución. Puntas de flechas rojas apuntan a neuroblastos divisorias con ingressing las membranas celulares. Los círculos verdes destacan ADN condensado durante las primeras fases de la mitosis o de nueva formación de núcleos hijos hacia el final de la mitosis / citocinesis. La célula grande sirve como un punto de referencia (asterisco amarillo) para determinar la etapa de desarrollo. B) Las imágenes mostradas son similares a A), pero son de un embrión tratado con ani-1 RNAi. Los ingresses de la membrana celular en que la célula procede a través de la mitosis, pero relaja poco después, dejando una célula multinucleadas. Barra de escala:. 10 m (negro), 3,5 m (amarillo) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51188/51188fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="La figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51188/51188fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51188/51188fig5.jpg" /> Figura 5. Visualización citocinesis neuroblast durante C.<html> elegans embriogénesis utilizando un sistema de barrido de campo. Proyecciones Z-stack A) invertidos de 2 Z-pilas de 0,2 micras (total 0,4 micras) se muestran a partir de un embrión coexpressing HAM-1: GFP y mCherry: PH recogido del sistema de campo de barrido utilizando una cámara EMCCD con alta sensibilidad, pero resolución más baja. La punta de flecha roja apunta a una citocinesis sometido neuroblastos. Los círculos verdes destacan ADN condensado durante la mitosis y la hija núcleos de nueva formación después de la citocinesis. La célula grande sirve como punto de referencia (asterisco amarillo) para determinar el grado de desarrollo. B) Las imágenes que se muestran son similares a A), pero son de un embrión tratado con ani-1 RNAi, y 3 Z-pilas se utilizan (total 0,6 micras ). Como se describió anteriormente, los ingresses de membrana en células a medida que avanza a través de la mitosis, pero luego se relaja haciendo que la célula se convierta en multinucleadas. Barra de escala: 10 m (negro), 3,5 m (amarillo).188/51188fig5highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver la imagen más grande. Video 1. Visualizar neuroblastos dividen en C. embriogénesis elegans. Proyecciones Z-stack de dos planos Z (0,4 m / avión) de un embrión de control coexpressing HAM-1: GFP (verde) y mCherry: PH (rojo). Imágenes recogidas desde el microscopio de campo amplio se muestran para ambos canales. El vídeo se corresponde con el embrión se muestra en el tercer panel de la Figura 3B. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51188/Video1.mov" target="_blank">Haga clic aquí para ver el vídeo.</a> Video 2. Visualizar neuroblastos dividen en C. embriogénesis elegans. Proyecciones Z-stack de dos planos Z (0,4 m / avión) de un embrión de control coexpressing HAM-1: GFP (verde) y mCherry: PH (rojo). El video corresponde a imágenes invertidas recogidas del microscopio de campo amplio para la mCherry: onl canal PHy (embrión en la figura 4A). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51188/Video2.mov" target="_blank">Haga clic aquí para ver el vídeo.</a> Video 3. Visualización de los neuroblastos dividen en C. embriogénesis elegans. Proyecciones Z-stack de dos planos Z (0,4 m / plano) de un embrión tratado ani-1 RNAi coexpressing HAM-1: GFP (verde) y mCherry: PH (rojo). El video corresponde a imágenes invertidas recogidas del microscopio de campo amplio para la mCherry:. Único canal PH (embrión en la figura 4B) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51188/Video3.mov" target="_blank">Haga clic aquí para ver el vídeo.</a> Video 4. Visualización dividiendo neuroblast durante C. embriogénesis elegans. Proyecciones Z-stack de dos planos Z (0,4 m / avión) de un embrión de control coexpressing HAM-1: GFP (verde) y mCherry: PH (rojo). El vídeo corresponde a invertirimágenes recogidas desde el microscopio confocal de barrido de campo para el mCherry ed:. único canal PH (embrión en la figura 5A) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51188/Video4.mov" target="_blank">Haga clic aquí para ver el vídeo.</a> Video 5. Visualización dividiendo neuroblast durante C. embriogénesis elegans. Proyecciones Z-pila de tres planos Z (0,4 m / plano) de un embrión tratado ani-1 RNAi coexpressing HAM-1: GFP (verde) y mCherry: PH (rojo). El video corresponde a imágenes invertidas recogidas del microscopio confocal de barrido de campo para el mCherry:. Único canal PH (embrión en la Figura 5B) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51188/Video5.mov" target="_blank">Haga clic aquí para ver el vídeo.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis at JoVE.com

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

Este protocolo describe cómo reproducir la división de células dentro de un tejido en Caenorhabditis elegans embriones. Mientras que varios protocolos describen cómo la división celular imagen en el embrión temprano, este protocolo se describe cómo la imagen de la división celular dentro de un tejido en desarrollo durante la embriogénesis tardía mediados.

Visualizar Neuroblast Citocinesis Durante<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriogénesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

visualizing-neuroblast-cytokinesis-during-c-elegans-embryogenesis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

11.8K vistas.  Concordia University.  Este protocolo describe cómo reproducir la división de células dentro de un tejido en Caenorhabditis elegans embriones. Mientras que varios protocolos describen cómo la división celular imagen en el embrión temprano, este protocolo se describe cómo la imagen de la división celular dentro de un tejido en desarrollo durante la embriogénesis tardía mediados. 

Video: Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant mechanism(s) of toxicity are still unclear. A&beta; is also deposited intramuscularly in Inclusion Body Myositis, a severe human myopathy. The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express human A&beta;. Depending on the tissue or timing of A&beta; expression, transgenic worms can have readily measurable phenotypes that serve as a read-out of A&beta; toxicity. For example, transgenic worms with pan-neuronal A&beta; expression have defects is associative learning (Dosanjh et al. 2009), while transgenic worms with constitutive muscle-specific expression show a progressive, age-dependent paralysis phenotype (Link, 1995; Cohen et al. 2006). One particularly useful C. elegans model employs a temperature-sensitive mutation in the mRNA surveillance system to engineer temperature-inducible muscle expression of an A&beta; transgene, resulting in a reproducible paralysis phenotype upon temperature upshift (Link et al. 2003). Treatments that counter A&beta; toxicity in this model [e.g., expression of a protective transgene (Hassan et al. 2009) or exposure to Ginkgo biloba extracts (Wu et al. 2006)] reproducibly alter the rate of paralysis induced by temperature upshift of these transgenic worms. Here we describe our protocol for measuring the rate of paralysis in this transgenic C. elegans model, with particular attention to experimental variables that can influence this measurement.

Assaying &#946;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express the human &beta;-amyloid peptide (A&beta;). Induced expression of A&beta; in C. elegans muscle leads to a rapid, reproducible paralysis phenotype that can be used to monitor treatments that modulate A&beta; toxicity.

Ensayo β-amiloide toxicidad con un transgénico C. elegans Modelo

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant ...

Investigación

Neurociencias

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment through neuron-specific detection of food and chemical odors1, 2, and can associate nutritive states with chemical odors3, temperature4, and the pathogenicity of a food source5.
Here, we describe assays of C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. We modified an aversive olfactory learning paradigm6 to instead produce a positive response; the assay involves starving ~400 worms, then feeding the worms in the presence of the AWC neuron-sensed volatile chemoattractant butanone at a concentration that elicits a low chemotactic index (similar to Toroyama et al.7). A standard population chemotaxis assay1 tests the worms' attraction to the odorant immediately or minutes to hours after conditioning.
After conditioning, wild-type animals' chemotaxis to butanone increases ~0.6 Chemotaxis Index units, its "Learning Index". Associative learning is dependent on the presence of both food and butanone during training. Pairing food and butanone for a single conditioning period ("massed training") produces short-term associative memory that lasts ~2 hours. Multiple conditioning periods with rest periods between ("spaced training") yields long-term associative memory (&lt;40 hours), and is dependent on the cAMP Response Element Binding protein (CREB),6 a transcription factor required for long-term memory across species.8
Our protocol also includes image analysis methods for quick and accurate determination of chemotaxis indices. High-contrast images of animals on chemotaxis assay plates are captured and analyzed by worm counting software in MatLab. The software corrects for uneven background using a morphological tophat transformation.9 Otsu's method is then used to determine a threshold to separate worms from the background.10 Very small particles are removed automatically and larger non-worm regions (plate edges or agar punches) are removed by manual selection. The software then estimates the size of single worm by ignoring regions that are above a specified maximum size and taking the median size of the remaining regions. The number of worms is then estimated by dividing the total area identified as occupied by worms by the estimated size of a single worm.
We have found that learning and short- and long-term memory can be distinguished, and that these processes share similar key molecules with higher organisms.6,8 Our assays can quickly test novel candidate genes or molecules that affect learning and short- or long-term memory in C. elegans that are relevant across species.

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

Here we describe methods to test C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. These population assays employ the worms abilities to chemotax toward volatile odorants, and form positive associations upon pairing food with the chemoattractant butanone. Increasing the number of conditioning periods induces long-term memory.

C. elegans de aprendizaje positivo butanona, a corto plazo y largo plazo Ensayos de la memoria asociativa

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment ...

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

En vivo láser axotomía en C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

La cuantificación automática de la fluorescencia en el Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. elegans Seguimiento y Medición del Comportamiento

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Una lectura molecular de adaptación a largo plazo olfativa en<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance imaging. However, use of such methods in animal models requires anesthesia and hence both alters the brain state and prevents behavioral measures. An alternative method is the use of in vivo microdialysis to take continuous measurement of brain extracellular fluid concentrations of glucose, lactate, and related metabolites in awake, unrestrained animals. This technique is especially useful when combined with tasks designed to rely on specific brain regions and/or acute pharmacological manipulation; for example, hippocampal measurements during a spatial working memory task (spontaneous alternation) show a dip in extracellular glucose and rise in lactate that are suggestive of enhanced glycolysis1-3,4-5, and intrahippocampal insulin administration both improves memory and increases hippocampal glycolysis6. Substances such as insulin can be delivered to the hippocampus via the same microdialysis probe used to measure metabolites. The use of spontaneous alternation as a measure of hippocampal function is designed to avoid any confound from stressful motivators (e.g. footshock), restraint, or rewards (e.g. food), all of which can alter both task performance and metabolism; this task also provides a measure of motor activity that permits control for nonspecific effects of treatment. Combined, these methods permit direct measurement of the neurochemical and metabolic variables regulating behavior.

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Modulation of hippocampally-dependent spatial working memory by direct intrahippocampal microinjection, accompanied and followed by in vivo microdialysis for metabolites in conscious, behaving animals.

Microinyección insulina hipocampo y<em&gt; En vivo</em&gt; Microdiálisis durante la prueba de memoria espacial

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Formación de imágenes in vivo de calcio neuronal en C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

En vivo de imágenes de Dauer-específica neuronal Remodelación en C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Un ensayo para medir los efectos del etanol sobre la velocidad de locomoción<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...