This work was supported by the Swiss National Science Foundation grant 315230_156929/1. M.C.M. is a recipient of a fellowship (Beca Chile Postdoctorado from CONICYT, Ministerio de Educacion, Chile).

Los experimentos con animales han sido aprobados por el comité local del cantón de Berna Kantonstierarzt, Kantonaler Veterinärdienst Berna (BE85 / 15). 1. Preparación de Xenopus Los ovocitos <ol><li> Mantener ranas (Xenopus laevis) en un 12 h / 12 h luz / oscuridad ciclo en el agua que está estrictamente mantuvo a 20 ° C. </li><li> Retire los lóbulos de los ovarios de las ranas hembra 9. NOTA: La eliminación de los lóbulos es un estímulo para la regeneración, y con frecuencia la calidad de los ovocitos mejora con la cirugía. El ovocito está cubierta por una capa vitelina, una capa de células del folículo, y el tejido conectivo que contiene los vasos sanguíneos 21. Toda la estructura se denomina &quot;folículo.&quot; </li><li> Coloque los lóbulos de los ovarios que están muy cargado de los folículos que contienen los ovocitos en estériles de Barth Saline 7 (MBS) suplementado con penicilina y estreptomicina (NaCl 88 mM, KCl 1, 2,4 mMDe NaHCO3, 0,82 mM MgSO 4, 0,41 mM CaCl 2 mM, Ca 0,33 (NO 3) 2, 10 mM ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico; HEPES (pH 7,5, NaOH), 100 mg / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina). </li><li> Single-a cabo la etapa V-VI 21 folículos. Mantenga el lóbulo ovario con fórceps. Bajar el asa de platino (Figura 1) a través de los folículos y retirar suavemente el bucle de perturbar el tejido conectivo que contiene el folículo del tejido de ovario. NOTA: Etapa V-VI 21 folículos se caracterizan por su tamaño (1,0 a 1,2 mm de diámetro) y por el buen contraste entre el hemisferio animales pigmentada oscura y el hemisferio vegetal amarillento. </li><li> Transferencia sólo folículos de aspecto saludable (es decir perfectamente esféricas y con pigmentación intacto) a un diámetro del plato Petri 35 mm por medio de una pipeta de plástico Pasteur (cortar la parte posterior a un diámetro de abertura de 1,5 mm). </li></ol> Nota: El sistema de microinyección se describe aquí se deriva de la reportada por Kressmann y Birnstiel 22. <ol><li> Preparar ARNc de los respectivos ADNc que codifican las subunidades de la α 4 β 2 δ receptor GABA A por transcripción in vitro, la adición de un poli (A +) de la cola, y la cuantificación del ARN por electroforesis en gel de 23. </li><li> Preparar pipetas de microinyección de los capilares de borosilicato de vidrio (1,0 mm de diámetro exterior (OD), 0,58 mm de diámetro interior (ID), 100 mm de longitud), utilizando un extractor de micropipeta. Romper las puntas de los capilares de vidrio con un microscopio utilizando un micromanipulador y microfilamentos para crear un diámetro de punta de 12 - 15 micras con una punta biselada. </li><li> Rellene las pipetas de microinyección con aceite de parafina utilizando una jeringa de 10 ml, y luego montar la pipeta de microinyección en un micr de construcción caseraoinjection aparato (Figura 2). NOTA: El aparato de inyección de aceite hidráulico de construcción casera consiste en un motor parrilla controlado por un interruptor de pedal. Un interruptor adicional cambia el modo de giro del motor. Este motor acciona un tornillo micrométrico (0,5 mm / vuelta) que avanza o se retrae el émbolo de una jeringa de vidrio de 10 mL. La inyección es a una velocidad de alrededor de 3 rpm y un giro de 0,5 corresponde a una inyección de 50 nL en un folículo. La punta de la jeringa está conectado a un tubo de paredes gruesas de politetrafluoroetileno que está a su vez conectado a la aguja de inyección por una pieza muy corto de tubo Tygon. El capilar de inyección se lleva a cabo por un portabrocas que está controlada por un micromanipulador. Todo el sistema se llena con aceite de parafina. Cualquier burbuja de aire debe evitarse, ya que poner en peligro el sistema de inyección. La configuración se ilumina con una fuente de luz fría. Se requiere un microscopio estereoscópico para el control óptico. Los folículos se visualizaron bajo luz fría con un stereomicroscope (40 aumentos). El rendimiento de la configuración de la inyección se prueba por la inyección de un trazador radioactivo en oocitos de Xenopus. Un volumen de 45 - 55 nL debe ser entregado por inyección. </li><li> Con una pipeta con una punta de plástico estéril, probar la configuración mediante la colocación de una gota de agua estéril en el interior limpio de un termoplástico resistente a la humedad (2 x 2 cm). Sumergir la punta de la pipeta de inyección en esta gotita, y luego girar el motor para retraer el émbolo (presión negativa dentro de la pipeta de inyección). NOTA: El agua debe entrar en la pipeta y formar una interfaz visible con el aceite. </li><li> Retraer la punta de la pipeta de la gotita y aplicar presión positiva en el interior de la pipeta de inyección. Una gota de agua debe formar en la punta de la pipeta de inyección. </li><li> Prepararse para la inyección de los folículos por alineándolos con los polos vegetales apuntando hacia arriba en los intersticios de una malla de nylon (G: 0,8 mm) pegados a la parte inferior de un Peplato de tri (60 mm) cubierta con MBS. </li><li> Prescindir de 2 l de ARNm utilizando una pipeta con una punta de plástico estéril en el interior limpio de un termoplástico. Tome el mRNA arriba en la pipeta de inyección mediante la aplicación de presión negativa en el interior de la pipeta de inyección. </li><li> Coloque la pipeta de inyección más de un folículo individual utilizando el micromanipulador. </li><li> Insertar la aguja de inyección en el centro de la polo vegetal e inyectar 50 nL de mRNA a un caudal de 0,6 l / min mediante la aplicación de presión positiva en el interior de la pipeta. Esperar 5 - 10 s antes de retirar la punta de la pipeta de inyección del folículo para evitar ARNm de escape. NOTA: El ARNm se debe inyectar en el polo vegetal (amarillenta) para evitar la inyección en el núcleo, que se encuentra en el hemisferio animal. </li><li> La transferencia de los folículos inyectados a una nueva placa de Petri (35 mm) llena con 2 ml de MBS. Coloque el plato en un enfriador de vino establecido a 18 ° C. Incubar los folículos inyectados por 1 -7 d antes de la grabación, dependiendo de la identidad de la nueva proteína expresada. </li></ol> 3. Decapado de los folículos (Figura 3) NOTA: Como se mencionó anteriormente, el ovocito cubierta por una capa vitelina, las células del folículo, y el tejido conectivo, que contiene los vasos sanguíneos 24, que se conoce como un &quot;folículo.&quot; Todas las capas excepto para la capa vitelina, que proporciona estabilidad mecánica sin impedir el acceso de las soluciones a la superficie celular, se deben quitar antes de los experimentos electrofisiológicos. El folículo sin las capas de células que rodean previamente se ha denominado un ovocito &quot;denudada&quot; 25. Este paso se realiza generalmente en el mismo día de los experimentos electrofisiológicos. <ol><li> Transferencia diez inyecta folículos a un tubo de vidrio de borosilicato que contiene 0,5 ml de MBS, 1 mg / ml de colagenasa y 0,1 mg / ml de inhibidor de tripsina. Sumergir el tubo en un baño de agua a 36 ° C. incubar lafolículos durante 20 minutos y agitar los tubos de vez en cuando. </li><li> Enjuagar los folículos mediante la transferencia a un segundo tubo que contiene 1 ml de MBS a TA. Dejarlos en el tubo durante unos 10 s. </li><li> La transferencia de los folículos a un tercer tubo que contiene 0,5 ml de MBS doblemente concentradas que contienen 4 mM etilenglicol-bis (2-aminoetiléter) - N, N, N &#39;, N&#39;-ácido tetraacético (EGTA), y se incuba durante 4 min a RT. Agitar el tubo de vez en cuando. NOTA: La solución hipertónica (MBS doblemente concentrados) se utiliza para inducir la contracción de los ovocitos dentro de las capas de células del folículo, separando de esta forma las capas de células foliculares de la ovocito; se añade EGTA para inhibir la actividad de la colagenasa. </li><li> Enjuagar los folículos mediante la transferencia a un segundo tubo que contiene 1 ml de MBS a TA. Dejarlos en el tubo durante unos 10 s. </li><li> La transferencia de los ovocitos a una placa de Petri (35 mm de diámetro) que contiene 2 ml de MBS. Bajo un microscopio estereoscópico, separar los sobres exteriores de los folículos porsimplemente empujando el oocito desnudo de distancia utilizando el asa de platino. NOTA: Los sobres exteriores de los ovocitos se adhieren firmemente a la placa de cultivo y se pueden separar fácilmente de los ovocitos. Algunos ovocitos perderán de forma espontánea sus sobres externos y serán recuperados como desprovistas de ovocitos. Este procedimiento resulta en una preparación relativamente estable que mantiene la apariencia esférica de los ovocitos. </li></ol> 4. Cambio rápido de soluciones en todo el ovocito <ol><li> Realizar un experimento de fijación de voltaje, como se describe a 9,26. </li><li> Cambie la solución del sistema de perfusión por gravedad girando los conmutadores de perfusión como se requiere por el experimento. <ol><li> Aplicar la solución de perfusión en 6 ml / min a través de un capilar de vidrio con un diámetro interior de 1,35 mm, la boca del que se coloca alrededor de 0,4 mm de la superficie del ovocito, para permitir cambios rápidos en la concentración de agonista alrededor del oocito. NOTA: La tasa de cambio ha sido previamente estimadod como 70% en menos de 0,5 s 27. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Gurdon, J. B., Lane, C. D., Woodland, H. R., Marbaix, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+frog+eggs+and+oocytes+for+the+study+of+messenger+RNA+and+its+translation+in+living+cells.">Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells.</a> Nature. 233 (5316), 177-182 (1971).</li><li>Soreq, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biosynthesis+of+biologically+active+proteins+in+mRNA-microinjected+Xenopus+oocytes.">The biosynthesis of biologically active proteins in mRNA-microinjected Xenopus oocytes.</a> CRC Crit Rev Biochem. 18 (3), 199-238 (1985).</li><li>Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Xenopus+oocytes+for+the+functional+expression+of+plasma+membrane+proteins.">Use of Xenopus oocytes for the functional expression of plasma membrane proteins.</a> J Membr Biol. 117 (3), 201-221 (1990).</li><li>Dascal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Xenopus+oocytes+for+the+study+of+ion+channels.">The use of Xenopus oocytes for the study of ion channels.</a> CRC Crit Rev Biochem. 22 (4), 317-387 (1987).</li><li>Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+single+sodium+channels+translated+by+Xenopus+oocytes+after+injection+with+messenger+ribonucleic+acid.">Properties of single sodium channels translated by Xenopus oocytes after injection with messenger ribonucleic acid.</a> J Physiol. 386, 73-90 (1987).</li><li>Sigel, E., Minier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+oocyte:+system+for+the+study+of+functional+expression+and+modulation+of+proteins.">The Xenopus oocyte: system for the study of functional expression and modulation of proteins.</a> Mol Nutr Food Res. 49 (3), 228-234 (2005).</li><li>Colman, A., Hames, B. D., Higgins, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+exogenous+DNA+in+Xenopus+oocytes.">Expression of exogenous DNA in Xenopus oocytes.</a> Transcription and Translation'A Practical Approach. , 49-69 (1984).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defolliculation+of+Xenopus+oocytes.">Defolliculation of Xenopus oocytes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (12), 1377-1379 (2010).</li><li>Smart, T. G., Krishek, B. J., Boulton, A. A., Baker, ., Wolfgang, W. a. l. z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+oocyte+microinjection+and+ion-channel+expression.">Xenopus oocyte microinjection and ion-channel expression.</a> Patch-Clamp Applications and Protocols. , 259-305 (1995).</li><li>Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+sites+involved+in+modulation+of+the+GABA+receptor+channel+by+the+intravenous+anesthetics+propofol,+etomidate+and+pentobarbital.">Functional sites involved in modulation of the GABA receptor channel by the intravenous anesthetics propofol, etomidate and pentobarbital.</a> Neuropharmacology. 105, 207-214 (2016).</li><li>Maldifassi, M. C., Baur, R., Pierce, D., Nourmahnad, A., Forman, S. A., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+positive+allosteric+modulators+of+GABAA+receptors+with+anesthetic+activity.">Novel positive allosteric modulators of GABAA receptors with anesthetic activity.</a> Sci Rep. 6, 25943 (2016).</li><li>Wongsamitkul, N., Baur, R., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+understanding+functional+properties+and+subunit+arrangement+of+&#945;4&#946;2&#948;+GABAA+receptors.">Towards understanding functional properties and subunit arrangement of &#945;4&#946;2&#948; GABAA receptors.</a> J Biol Chem. 291 (35), 18474-18483 (2016).</li><li>Burgunder, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chloride+channel+mutations+leading+to+mild+myotonia+among+Chinese.">Novel chloride channel mutations leading to mild myotonia among Chinese.</a> Neuromuscul Disord. 18 (8), 633-640 (2008).</li><li>Steinmann, M. E., Gonzalez-Salgado, A., Butikofer, P., Maser, P., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+heteromeric+potassium+channel+involved+in+the+modulation+of+the+plasma+membrane+potential+is+essential+for+the+survival+of+African+trypanosomes.">A heteromeric potassium channel involved in the modulation of the plasma membrane potential is essential for the survival of African trypanosomes.</a> FASEB J. 29 (8), 3228-3237 (2015).</li><li>Gonzalez-Salgado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=myo-Inositol+uptake+is+essential+for+bulk+inositol+phospholipid+but+not+glycosylphosphatidylinositol+synthesis+in+Trypanosoma+brucei.">myo-Inositol uptake is essential for bulk inositol phospholipid but not glycosylphosphatidylinositol synthesis in Trypanosoma brucei.</a> J Biol Chem. 287 (16), 13313-13323 (2012).</li><li>Gonzalez-Salgado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+brucei+Bloodstream+Forms+Depend+upon+Uptake+of+myo-Inositol+for+Golgi+Complex+Phosphatidylinositol+Synthesis+and+Normal+Cell+Growth.">Trypanosoma brucei Bloodstream Forms Depend upon Uptake of myo-Inositol for Golgi Complex Phosphatidylinositol Synthesis and Normal Cell Growth.</a> Eukaryot Cell. 14 (6), 616-624 (2015).</li><li>Wu, M., Gerhart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raising+Xenopus+in+the+laboratory.">Raising Xenopus in the laboratory.</a> Methods Cell Biol. 36, 3-18 (1991).</li><li>Gurdon, J. B., Wilt, F. H., Wessels, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+clawed+frogs.">American clawed frogs.</a> Methods in developmental biology. , 75-84 (1967).</li><li>Elsner, H. A., Honck, H. H., Willmann, F., Kreienkamp, H. J., Iglauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poor+quality+of+oocytes+from+Xenopus+laevis+used+in+laboratory+experiments:+prevention+by+use+of+antiseptic+surgical+technique+and+antibiotic+supplementation.">Poor quality of oocytes from Xenopus laevis used in laboratory experiments: prevention by use of antiseptic surgical technique and antibiotic supplementation.</a> Comp Med. 50 (2), 206-211 (2000).</li><li>Green, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+oogenesis+in+the+South+African+clawed+frog+(Xenopus+laevis).">Factors affecting oogenesis in the South African clawed frog (Xenopus laevis).</a> Comp Med. 52 (4), 307-312 (2002).</li><li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+in+Xenopus+laevis+(Daudin).+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals.">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J Morphol. 136 (2), 153-179 (1972).</li><li>Kressmann, A., Celis, J. E., Grassmann, A., Loyter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birnstiel+M.L.+Surrogate+genetics.">Birnstiel M.L. Surrogate genetics.</a> Transfer of Cell Constituents into Eucaryotic Cells. , 388-407 (1980).</li><li>Middendorp, S. J., Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+modulation+of+synaptic+and+extrasynaptic+GABAA+receptors+by+an+antagonist+of+the+high+affinity+benzodiazepine+binding+site.">Positive modulation of synaptic and extrasynaptic GABAA receptors by an antagonist of the high affinity benzodiazepine binding site.</a> Neuropharmacology. 95, 459-467 (2015).</li><li>Dumont, J. N., Brummett, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+in+Xenopus+laevis+(Daudin).+V.+Relationships+between+developing+oocytes+and+their+investing+follicular+tissues.">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). V. Relationships between developing oocytes and their investing follicular tissues.</a> J Morphol. 155 (1), 73-97 (1978).</li><li>Dascal, N., Landau, E. M., Lass, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+oocyte+resting+potential,+muscarinic+responses+and+the+role+of+calcium+and+guanosine+3',5'-cyclic+monophosphate.">Xenopus oocyte resting potential, muscarinic responses and the role of calcium and guanosine 3',5'-cyclic monophosphate.</a> J Physiol. 352, 551-574 (1984).</li><li>Buckingham, S. D., Pym, L., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocytes+as+an+expression+system+for+studying+receptor/channel+targets+of+drugs+and+pesticides.">Oocytes as an expression system for studying receptor/channel targets of drugs and pesticides.</a> Methods Mol Biol. 322, 331-345 (2006).</li><li>Sigel, E., Baur, R., Trube, G., M&#246;hler, H., Malherbe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+subunit+combination+of+rat+brain+GABAA+receptors+on+channel+function.">The effect of subunit combination of rat brain GABAA receptors on channel function.</a> Neuron. 5, 703-711 (1990).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Los métodos descritos en este artículo se desvían de los utilizados tradicionalmente 7-9. Es estándar para exponer los lóbulos del ovario a un tratamiento de colagenasa 1-2 h 8; aislar, desprovistas de ovocitos en buen estado; e inyectarlos con ARNm utilizando dispositivos de inyección comerciales. Este procedimiento clásico tiene los siguientes inconvenientes: 1) Los ovocitos son susceptibles de ser dañados por la exposición prolongada a altas concentraciones de colagenasa. 2) Los ovocitos denudados inestables deben ser almacenados hasta que el experimento. 3) los ovocitos denudados son más propensos a sufrir durante la microinyección de los folículos. dispositivos de inyección comerciales utilizan de gran diámetro (aproximadamente 20 micras) agujas de inyección, probable que resulte en una tasa relativamente alta de daño. Las ventajas del procedimiento mejorado descrito aquí son las siguientes: la exposición a la colagenasa se limita a 20 min, desprovistas de ovocitos no tienen que ser almacenados, y el pequeño diámetro de la punta de las pipetas (alrededor de 12 - 15 m) se utiliza para microinjectien no requiere previa &quot;defolliculation&quot; de los folículos para la inyección de ARNm. El paso crítico único es que la temperatura del folículo incubación en solución de colagenasa se debe ajustar cuidadosamente a 36 ° C y no debe excederlo. Para cambios de soluciones en experimentos electrofisiológicos, muy a menudo se cambia la solución en la cámara de medición, que tiene una cantidad sustancial de tiempo, dependiendo del tamaño de la cámara y la velocidad de perfusión. Usando el capilar de perfusión evitado este. El principal inconveniente de la expresión de canales iónicos en oocitos de Xenopus es su tamaño gigante. El control de tensión más rápido que alrededor de 2 ms es difícil, y muy rápido (&lt;0,5 s) solución cambia requieren procedimientos elaborados. Por otra parte, las sustancias fuertemente hidrófobos pueden ser casi irreversiblemente unido a la yema de huevo del ovocito. Los métodos descritos aquí nos han permitido investigarde una manera de ahorro de tiempo las propiedades funcionales de los receptores de GABA A recombinantes, su modulación por compuestos sintéticos y sustancias vegetales, su disposición subunidad, y la ubicación de los sitios de unión de fármacos en los receptores de diferente composición de la subunidad. Los métodos descritos aquí son adecuados para la expresión de una proteína de elección en el oocito de Xenopus. El método muy simple para cambios rápidos de solución del medio alrededor del ovocito puede aplicarse al estudio de cualquier canal iónicos activados por ligando o portador.

Oocitos de Xenopus se usan ampliamente como un sistema de expresión (Referencias 2 - 3, y las referencias en él). Ellos son capaces de montar y de incorporar proteínas de múltiples subunidades funcionalmente activas en sus membranas plasmáticas correctamente. El uso de este sistema, es posible investigar funcionalmente proteínas de membrana solos o en combinación con otras proteínas, con el fin de estudiar las propiedades de, o proteínas quiméricas concatenados mutados, y a la pantalla de fármacos potenciales. Ventajas del uso de oocitos sobre otros sistemas de expresión heterólogos incluyen el manejo sencillo de las células gigantes, la alta proporción de células que expresan la información genética extranjera, el simple control del entorno de los ovocitos mediante perfusión del baño, y el control del potencial de membrana . El inconveniente de este sistema de expresión es la variación estacional observada en muchos laboratorios 17-20. La razón de esta variaciónestá lejos de ser clara. Además, la calidad de los ovocitos se observa a menudo para variar fuertemente. Los métodos tradicionales 7-9 han incluido el aislamiento de lóbulos de ovario, la exposición de los lóbulos de ovario a la colagenasa para algunos h, la selección de desprovistas de ovocitos, y la microinyección de ovocitos. A continuación, se presentan una serie de procedimientos alternativos y rápidos que han permitido trabajar con este sistema de expresión durante más de 30 años sin variación estacional y la poca variación en la calidad de los ovocitos. Los métodos modificados y mejorados descritos aquí para el aislamiento de ovocitos, microinyección con cRNA, y la eliminación de las capas de células foliculares se pueden utilizar para la expresión de cualquier proteína de elección en el oocito de Xenopus. El método muy simple para cambios rápidos de solución del medio alrededor del ovocito puede aplicarse al estudio de cualquier canal iónicos activados por ligando y de portadores.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P-9541</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M-1880</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>223560</td><td></td></tr><tr><td>Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-148</td><td>100 &amp;mu;g penicillin/mL and 100 &amp;mu;g streptomycin/mL</td></tr><tr><td>Platinum wire loop</td><td>home-made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Zeitz-Instruments GmBH</td><td>DMZ</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton syringe&amp;nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>80300</td><td>10 &amp;mu;L, Type 701N</td></tr><tr><td>Thick walled polytetrafluoroethylene tubing</td><td>Labmarket GmBH</td><td></td><td>1.0 mm OD&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Paraffin oil</td><td>Sigma</td><td>18512</td><td></td></tr><tr><td>Nylon net, G: 0.8 mm&amp;nbsp;</td><td>ZBF Z&amp;uuml;richer Beuteltuchfabrik AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass tube&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>99445-12</td><td>PYREX</td></tr><tr><td>Collagenase NB Standard Grade</td><td>SERVA</td><td>17454</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin inhibitor type I-S</td><td>Sigma</td><td>T-9003</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3389</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Jencons (Scientific ) LTD.</td><td>H15/10</td><td>1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary</td><td>Harvard Apparatus Limited</td><td>30-0019</td><td>1.0 OD x&amp;nbsp; 0.58 ID x 100 Length mm (for microinjection)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus Limited</td><td>30-0044</td><td>1.2 OD x 0.69 ID x 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp)</td></tr><tr><td>&amp;gamma;-Aminobutyric acid (GABA)</td><td>Sigma</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;alpha;,21-Dihydroxy-5&amp;alpha;-pregnan-20-one (THDOC)</td><td>Sigma</td><td>P2016</td><td></td></tr><tr><td>grill motor</td><td>Faulhaber&amp;nbsp;</td><td></td><td>DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2</td></tr><tr><td>micrometer screw</td><td>Kiener-Wittlin</td><td>10400</td><td>TESA, AR 02.11201</td></tr><tr><td>Sterile plastic transfer pipettes</td><td>Saint-Amand&amp;nbsp; Mfg.</td><td>222-20S</td><td></td></tr></tbody></table>

xenopus oocytes: optimized methods for microinjection, removal of follicular cell layers, and fast solution changes in electrophysiological experiments

El ovocito Xenopus como un sistema de expresión heteróloga para las proteínas, fue descrito por primera vez por Gurdon et al. 1 y ha sido ampliamente utilizado desde su descubrimiento (Referencias 2 - 3, y sus referencias). Una característica que hace que el ovocito atractivo para la expresión del canal exterior es el pobre abundancia de canales iónicos endógenos 4. Este sistema de expresión ha demostrado ser útil para la caracterización de muchas proteínas, entre ellas los canales iónicos activados por ligando. La expresión de los receptores GABA A en oocitos de Xenopus y su caracterización funcional se describe aquí, incluyendo el aislamiento de ovocitos, microinyecciones con cRNA, la eliminación de capas de células foliculares, y cambios rápidos en solución experimentos electrofisiológicos. Los procedimientos fueron optimizados en este laboratorio 5,6 y se desvían de las que se usan rutinariamente 7-9. Tradicionalmente, desprovistas de ovocitos se preparancon un tratamiento prolongado de la colagenasa de los lóbulos de ovario a TA, y estas desprovistas de ovocitos se microinyectan con mRNA. Utilizando los métodos optimizados, diversas proteínas de membrana se han expresado y estudiado con este sistema, tales como los receptores recombinantes GABA A, 10-12 humanos recombinantes canales de cloruro, canales de potasio 13 tripanosoma 14, y un transportador de myo -inositol 15, 16. Los métodos detallados aquí pueden ser aplicados a la expresión de cualquier proteína de elección en oocitos de Xenopus, y el cambio de solución rápida se pueden utilizar para estudiar otros canales iónicos activados por ligando.

Oocitos de Xenopus fueron escogidos mecánicamente a cabo utilizando un asa de platino (Figura 1). Los oocitos se microinyectaron con mRNA que codifica para el receptor de GABA A subunidades alfa 4, ß 2, δ, 0,5: 0,5: 2,5 fmol / ovocito (Figura 2). Después de 4 días, las capas de células foliculares se eliminaron (Figura 3). Los oocitos se sujetan voltaje a -80 mV y se expusieron a concentraciones crecientes de ácido γ-aminobutírico (GABA) en presencia de 1 mM 3α, 21-dihidroxi-5α-pregnan-20-ona (THDOC), un modulador alostérico positivo potente de el receptor GABA A. La figura 4A muestra trazas de corriente originales grabadas en un experimento de este tipo. La Figura 4B muestra la amplitud de corriente suscitó en función de las concentraciones de GABA. Esto permite la determinación de la sensibilidad de esta combinación de subunidades hacia GABA. Las curvas individuales eranamueblada y estandarizado a lo máximo y, posteriormente, en promedio. La ecuación utilizada fue I (c) = / (1+ (CE 50 / c) n), donde c es la concentración de GABA, EC 50 la concentración de GABA (en presencia de 1 THDOC M) la obtención de un medio I max amplitud de la corriente -maximal, I max es la amplitud de la corriente máxima, I es la amplitud de la corriente, y n es el coeficiente de Hill. La CE 50 de la α 4 β 2 δ receptor GABA A ascendió a 0,41 ± 0,12 m, y n fue de 0,76 ± 0,04. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55034/55034fig1.jpg" /> Figura 1: Platino Loop. El bucle de alambre de platino menciona en el paso 1.4 del protocolo. El platino es un metal que se puede doblar sin producir astillas, y que no se pegueal material biológico. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55034/55034fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55034/55034fig2.jpg" /> Figura 2: Aparato de construcción casera microinyección. El aparato se describe en el paso 2. protocolo de un motor de la parrilla; b, tornillo micrométrico; c, primavera entre la jeringa y el émbolo; d, 10 l jeringa de vidrio; e, de pared gruesa tubo de politetrafluoroetileno; f, parte del mandril; g, pipeta de inyección; h, microscopio estereoscópico; y yo, el control motor. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55034/55034fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 3. Esquema que muestra la Defolliculation de un ovocito. Los ovocitos se incuban primero en una solución de colagenasa en un baño de agua a 36 ° C durante 20 min. Los ovocitos se lavan luego en un medio de Barth modificada. El paso de incubación final es en una solución hipertónica EGTA a TA durante 4 min. Como resultado, el tejido conectivo y las células del folículo se eliminan para dar paso a la ovocito denudada. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55034/55034fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55034/55034fig4.jpg" /> Figura 4. Gráficos de corriente de un voltaje de dos electrodos abrazadera experimento. UN, Gráficos de corriente de una curva de respuesta a la concentración de GABA en las prescia de 1 THDOC M obtenido a partir de un oocito de Xenopus que expresa el GABA α 4 β 2 δ Un receptor. Las barras indican el período de tiempo de GABA / 1 M THDOC perfusión. El aumento de las concentraciones de GABA se aplicaron a la ovocitos, y se determinaron las amplitudes de corriente correspondientes. las concentraciones de GABA se indican encima de las barras. B, Las curvas de respuesta de concentración promediados de la GABA α 4 β 2 δ Un receptor. curvas individuales fueron los primeros normalizado a la amplitud de la corriente máxima equipada y posteriormente se promediaron. Los datos se muestran como media ± SD, n = 3. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55034/55034fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments at JoV

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.

Los oocitos de Xenopus: Métodos optimizados para la microinyección, la eliminación de las capas de células foliculares y Cambios solución rápida en experimentos electrofisiológicos

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

xenopus-oocytes-optimized-methods-for-microinjection-removal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

20.1K vistas.  University of Bern. Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented. 

Video: Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

La manipulación y<em&gt; In Vitro</em&gt; La maduración de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Los ovocitos, seguido de inyección intracitoplasmática de espermatozoides, para estudiar el desarrollo embrionario

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Uso del análisis confocal de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Encargado de investigar moduladores de Wnt y Shh morfógeno Degradados

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where real-time measurements of fluorescence and currents simultaneously report on local rearrangements and global function, respectively1. While high-resolution structural techniques such as cryo-electron microscopy or X-ray crystallography provide static images of the proteins of interest, VCF provides dynamic structural data that allows us to link the structural rearrangements (fluorescence) to dynamic functional data (electrophysiology). Until recently, the thiol-reactive chemistry used for site-directed fluorescent labeling of the proteins restricted the scope of the approach because all accessible cysteines, including endogenous ones, will be labeled. It was thus required to construct proteins free of endogenous cysteines. Labeling was also restricted to sites accessible from the extracellular side. This changed with the use of Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) to specifically incorporate a small fluorescent probe in response to stop codon suppression using an orthogonal tRNA and tRNA synthetase pair2. The VCF improvement only requires a two-step injection procedure of DNA injection (tRNA/synthetase pair) followed by RNA/fUAA co-injection. Now, labelling both intracellular and buried sites is possible, and the use of VCF has expanded significantly. The VCF technique thereby becomes attractive for studying a wide range of proteins and &#8211; more importantly &#8211; allows investigating numerous cytosolic regulatory mechanisms.

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

This article describes an enhancement of conventional Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) where Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) are used instead of maleimide dyes, to probe structural rearrangements in ion channels. The procedure includes Xenopus oocyte DNA injection, RNA/fUAA coinjection, and simultaneous current and fluorescence measurements.

Pinza de tensión Fluorometría en<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocitos Usando Fluorescentes Aminoácidos No Naturales

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Bioquímica

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinyección de oocitos de Xenopus laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Biología

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Visualizar la localización del ARN en Xenopus Los ovocitos

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

La fertilización de Oocitos de Xenopus Utilizando el método de transferencia de acogida

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

La microinyección de ovocitos de ratón, Maduración y Evaluación de ploidía

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Microtransplantation of Synaptic Membranes to Reactivate Human Synaptic Receptors for Functional Studies

Excitatory and inhibitory ionotropic receptors are the major gates of ion fluxes that determine the activity of synapses during physiological neuronal communication. Therefore, alterations in their abundance, function, and relationships with other synaptic elements have been observed as a major correlate of alterations in brain function and cognitive impairment in neurodegenerative diseases and mental disorders. Understanding how the function of excitatory and inhibitory synaptic receptors is altered by disease is of critical importance for the development of effective therapies. To gain disease-relevant information, it is important to record the electrical activity of neurotransmitter receptors that remain functional in the diseased human brain. So far this is the closest approach to assess pathological alterations in receptors' function. In this work, a methodology is presented to perform microtransplantation of synaptic membranes, which consists of reactivating synaptic membranes from snap frozen human brain tissue containing human receptors, by its injection and posterior fusion into the membrane of Xenopus laevis oocytes. The protocol also provides the methodological strategy to obtain consistent and reliable responses of &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) and &#947;-aminobutyric acid (GABA) receptors, as well as novel detailed methods that are used for normalization and rigorous data analysis.

The protocol demonstrates that by performing microtransplantation of synaptic membranes into Xenopus laevis oocytes, it is possible to record consistent and reliable responses of &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid and &#947;-aminobutyric acid receptors.

Microtrasplante de membranas sinápticas para reactivar los receptores sinápticos humanos para estudios funcionales

Excitatory and inhibitory ionotropic receptors are the major gates of ion fluxes that determine the activity of synapses during physiological neuronal ...

Neurociencias

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis como modelo para identificar Traducción Deterioro

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

Los oocitos de Xenopus: Métodos optimizados para la microinyección, la eliminación de las capas de células foliculares y Cambios solución rápida en experimentos electrofisiológicos

Resumen

Explorar más videos

Capítulos en este video

La manipulación y

Uso del análisis confocal de

Pinza de tensión Fluorometría en

Microinyección de oocitos de Xenopus laevis

Visualizar la localización del ARN en Xenopus Los ovocitos

La fertilización de Oocitos de Xenopus Utilizando el método de transferencia de acogida

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados en Xenopus Ovocitos

La microinyección de ovocitos de ratón, Maduración y Evaluación de ploidía

Microtrasplante de membranas sinápticas para reactivar los receptores sinápticos humanos para estudios funcionales

Xenopus laevis como modelo para identificar Traducción Deterioro

Los oocitos de Xenopus: Métodos optimizados para la microinyección, la eliminación de las capas de células foliculares y Cambios solución rápida en experimentos electrofisiológicos

Resumen

Explorar más videos

Capítulos en este video

La manipulación y

Uso del análisis confocal de

Pinza de tensión Fluorometría en

Microinyección de oocitos de Xenopus laevis

Visualizar la localización del ARN en Xenopus Los ovocitos

La fertilización de Oocitos de Xenopus Utilizando el método de transferencia de acogida

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

La microinyección de ovocitos de ratón, Maduración y Evaluación de ploidía

Microtrasplante de membranas sinápticas para reactivar los receptores sinápticos humanos para estudios funcionales

Xenopus laevis como modelo para identificar Traducción Deterioro

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados en Xenopus Ovocitos