Los autores desean agradecer Brogan invitados, Weaver Michelle, y Lippert Kristen. El financiamiento para este estudio fue proporcionado por el NIH Grant R03EB009237, así como subvenciones del NIH Formación T32EB001026-06 del Instituto Nacional de Imágenes Biomédicas y Bioingeniería y T32HL076124 05-.

1. Preparación de tejidos y Experimento de instalación <ol><li> Harvest órgano porcino inmediatamente después de la eutanasia desde una instalación de matadero o de investigación y enjuagar el exceso de sangre. Recorte el corazón del exceso de grasa y tejido, manteniendo las aurículas y la aorta intacta. Recorte la grasa para separar la arteria pulmonar de la aorta. Si hay algunos cortes en el tejido, desechar apropiadamente. </li><li> Envolver cada corazón individualmente en papel de congelador y almacenar todo el tejido en un congelador -80 ° C durante al menos 24 horas para asegurar la congelación completa. </li><li> Cuando esté listo para su uso (generalmente menos de 3 meses), descongelar un corazón intacto congelado de porcino tipo 1 en agua durante la noche sumergido en un vaso de precipitados de 4 L a 4 º C. </li><li> Después de que el corazón está completamente descongelado, acariciar el corazón seco, pesar el corazón, y registrar el peso. El corazón de un cerdo peso de mercado debe pesar aproximadamente 375-450 g. </li><li> Conecte talla 18 a la tubería Masterflex ¼ &quot;fin de un reductor de púas. Inserte el reductor de púas ytubo dentro de la aorta. Coloque 2 abrazaderas de manguera o los lazos zip seguras alrededor de la aorta, justo debajo del tronco braquiocefálico. El reductor y el tubo debe permanecer por encima de la válvula aórtica, así que las arterias coronarias pueden ser perfundidos (Figura 1). </li><li> Usar una jeringa de 30 o 60 ml para llenar el tubo con agua Tipo I. Insertar el tubo dentro del cartucho de una bomba de rodillos Masterflex en su punto medio aproximado. Sumergir la afluencia extremo de la tubería en el fondo de un vaso de precipitados de 4 L con 2,5 L de agua y asegurar la tubería. </li><li> Colocar el corazón en el vaso de precipitados lleno de agua, y cebar la bomba para eliminar burbujas de aire. Si se observan burbujas procedente de la aorta, donde se inserta el tubo, la aorta puede ser necesario reposicionar o fijarse con cintas adicionales. Un sello hermético es importante para mantener la presión adecuada durante el proceso de descelularización (Figura 2). </li><li> Coloque el vaso de precipitados que contiene 3 L 4 L de un 0,2% NaN% Trypsin/0.05 EDTA/0.05%3 solución en una placa de agitación y se calienta a 37 ° C en el proceso de preparación de la descelularización. </li></ol> 2. Tejido Enjuagues <ol><li> Ajustar la bomba a una velocidad de flujo de 400 ml / min, asegurándose de que el tamaño del tubo correcto está seleccionado. Enjuague el corazón con agua de tipo I durante 15-25 min. Como se arranca la bomba, el corazón debe hincharse y efusión de sangre de los ventrículos. Solución fresca debe ser sustituido cada 5-10 minutos, o cuando sea necesario sobre la base de la cantidad de sangre que sale del corazón. Si la sangre no está derramada desde el corazón, ajustar el tubo y las abrazaderas según sea necesario. </li><li> Detener la bomba y transferir el corazón a un vaso de precipitados separado lleno de fosfato 2X salino tamponado (PBS). Después de que el tubo se sumerge en solución, arrancar la bomba y aumentar la velocidad de flujo de 700 ml / min. El corazón debe permanecer en disolución durante 15 minutos, cambiando la solución cada 5 min. Cada cambio de solución requiere que la bomba se detiene temporalmente mientras que el tejido y el tubo se mueveal vaso de precipitados de nuevo. </li><li> Transferir el corazón de tipo I de agua durante 10 minutos y aumentar la velocidad de flujo de 750 ml / min. </li></ol> 3. Descelularización y solución de perfusión <ol><li> Transferir el corazón al vaso de precipitados que contiene 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 a 37 ° C. Aumentar la velocidad de la bomba a 1.200 ml / min y arrancar la bomba. Usar una barra de agitación colocado en el fondo del vaso de precipitados para hacer circular la solución en el vaso de precipitados. El corazón debe permanecer en el 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 disolución a 37 ° C durante un total de tres horas. Después de 1 h, aumentar la velocidad de la bomba a 1.500 ml / min. Después de una hora adicional, aumentar la velocidad de la bomba a 1.800 ml / min. El tejido se lentamente sometido a velocidades de perfusión mayores para acondicionar el tejido y evitar la rotura de los vasos. El corazón se hinchará y casi el doble de tamaño durante este paso del protocolo. El tejido pierde su color natural, progresando desde las aurículas hasta el ápice a lo largo de thProtocolo E (Figura 3). </li><li> Después de cada perfusión solución, una de dos pasos de enjuague se realiza para eliminar los desechos celulares, residuos de productos químicos, y la lisis celular ayuda. Cada enjuague se compone de un 10 min enjuague en agua de tipo I seguido por un enjuague de 10 minutos con 2X solución de PBS a temperatura ambiente. Cada lavado consiste en la eliminación de la solución en el vaso de precipitados original, añadiendo soluciones de enjuague, y circulando el líquido de perfusión en el vaso de precipitados que contiene el corazón sumergido. Después de que el 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 solución, el agua perfundir a 1.900 ml / min y, a continuación perfundir 2X PBS a 1950 ml / min. </li><li> Transferir el corazón a una solución de 3% de Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 a temperatura ambiente. Aumentar la velocidad de la bomba a 2.000 ml / min y la solución de perfusión durante una hora. Quitar la solución del vaso de precipitados y reemplazar con solución fresca, aumentar la velocidad de la bomba a 2100 ml / min, y la perfusión de la solución fresca durante una hora adicional y un medio, con lo que el tiempo total en3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 a 2,5 horas. </li><li> Enjuague el tejido en agua de tipo I en 2150 ml / min y PBS 2X a 2180 ml / min durante 10 min cada uno. </li><li> Transferir el corazón a una solución de desoxicolato sódico 4% a temperatura ambiente. Aumentar la velocidad de la bomba a 2.200 ml / min y la solución de perfusión durante 3 horas. </li><li> Enjuague el tejido en el tipo I y el agua en 2X PBS a 2.200 ml / min durante 15 min cada uno, el cambio de las soluciones después de 5-10 minutos para cada solución. Los pasos descritos perfusión se puede dividir en varios días mediante la realización de la etapa de aclarado dos veces y almacenar el corazón con una cánula adherida durante la noche a 4 ° C y se sumerge en agua de tipo I. </li><li> El día siguiente, realizar un enjuague con 5 min de tipo I de agua a 750 ml / min, seguido de un enjuague 5 min en PBS 1X a 1.500 ml / min. El protocolo a continuación, se puede continuar a la velocidad de flujo se describe en la solución apropiada. </li></ol> 4. Desinfección y procesamiento final <ol><li> Transferir el corazón a un 0,1% peracácido etic / 4% de solución de etanol y la solución de perfusión durante 1,5 horas a 2.200 ml / min. </li><li> Los enjuagues finales para el tejido se realizan todas en 2.200 ml / min. Perfundir el tejido con PBS 1X durante 15 min, seguido por dos lavados de 5 min en el tipo I de agua. Esta serie de aclarados se repite una vez más con el fin de completar el procedimiento de perfusión de solución. </li><li> Apague la bomba y retire el corazón de la solución para drenar el corazón. Cortar los lazos de la aorta, eliminar todos los tubos, y colocar el corazón en un vaso de precipitados vacío para drenar durante 1 hora. El exceso de líquido tendrá que ser drenada periódicamente. Coloque el corazón en una almohadilla absorbente para drenar totalmente el corazón (Figura 4). </li><li> Después de la mayor parte del agua se elimina, se registra el peso de la matriz extracelular cardiaca (C-ECM). El corazón se puede esperar que pierden aproximadamente 20-25% de su peso inicial durante el proceso de descelularización. </li><li> Diseccionar los ventrículos derecho e izquierdo, así como el tabique ventricular para el ADN quantificatiy en el procesamiento histológico con el fin de confirmar la descelularización completa del tejido (Figura 5). </li><li> Congelar la C-ECM a -80 º C durante al menos 2 horas antes de la liofilización. </li></ol>

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	<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung.">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. Med. 16, 927-933 (2010).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. , (2008).</li><li>Petersen, T. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Right+ventricular+outflow+tract+repair+with+a+cardiac+biologic+scaffold.">Right ventricular outflow tract repair with a cardiac biologic scaffold.</a> Cells, tissues, organs. 195, 159-170 (2012).</li></ol>

Dr. Gilbert estaba en el Consejo Asesor Científico de ACELL, Inc., mientras que el estudio se está haciendo, y recientemente se convirtió en el vicepresidente de Investigación y Desarrollo. ACELL, Inc. vende matriz vejiga urinaria y no tiene interés comercial en el presente estudio.

El actual estudio se describe la metodología para la descelularización coherente y eficaz de un corazón porcino. El protocolo era una modificación de un informe publicado anteriormente 1, e incluyó una exposición más larga al caudal y la presión aumentada, que proporcionan resultados más reproducibles. El tejido resultante descelularizado cumplido con todos los criterios publicados por descelularización éxito de tejido 2. Los cambios frecuentes de solución se realiza para limitar la reintroducción de material celular para el tejido, y la duración de la exposición a cada agente descelularización se minimiza para reducir los efectos adversos en el ECM. Durante las etapas iniciales del protocolo, la tasa de perfusión se incrementó gradualmente a la condición del tejido y permiten velocidades de flujo más altas durante las etapas posteriores del protocolo. Sin acondicionado el tejido en las primeras etapas, la vasculatura del corazón se puede romper, por lo que la perfusión del corazón imposible. El protocol se utilizó debido a su eficiencia, y no se hacen afirmaciones de su superioridad sobre otros protocolos. La composición precisa de agentes descelularización y las tasas de perfusión concebiblemente puede variarse para producir un protocolo con mejores características mecánicas o biológicas, pero los principios generales para la entrega de los agentes para el corazón son aplicables. La preservación de la nativa estructura tridimensional del corazón se atribuyó a varios procedimientos realizados en todo el protocolo descelularización. En primer lugar, el tejido se recortó y se congelaron a la llegada. Congelación promovido la lisis celular y era importante para pre-acondicionamiento del tejido para los ciclos de perfusión. El tejido fue inspeccionada cuidadosamente para cortes y 2 cm de aorta intacta intacta superiores a la válvula aórtica. Si cualquier pericardio o epicardio fue cortado, el órgano se descartó debido a que el perfusado no alcanzó abajo regiones del corazón, y el corazón no se descelularizado completamente.A continuación, el tejido fue descongelado completamente en el tipo I de agua antes de su uso. El agua que se permite que el tejido se relaje como se descongelaron y ayudado también la eliminación de los coágulos de sangre residual dentro del corazón. Finalmente, cuando el tubo se inserta, se tuvo cuidado para asegurar que la válvula aórtica se mantuvo intacto, de manera que se formó un sello hermético alrededor de la tubería, de modo que una presión adecuada y que se mantuvo la solución entró en las arterias coronarias. Después de cada protocolo descelularización se completó, una serie de medidas de control de calidad fueron completados para asegurar la completa eliminación de material celular. El presente estudio verificó que el protocolo de tinción histológica para eliminar los núcleos celulares, mostró que menos de 50 ng de ADN estaba presente por mg de peso seco del tejido, y que cualquier ADN era inferior a 200 pb de tamaño 6. Métodos previamente publicados para descelularización cardíaca mostró niveles similares de descelularización en la tinción de ADN y cuantificación2,5,9,10. Descelularización completa se logró en estos estudios mediante tratamientos similares de enzimas y detergentes. Sin embargo, en el presente estudio, la duración de la exposición a cada producto químico se incrementó, hubo más cambios de solución, y los caudales se incrementaron. El presente protocolo también aumentó la longitud de enjuagues químicos, conduciendo potencialmente a una eliminación más eficiente de los residuos químicos de la matriz extracelular. Recelularización de corazones de ratas descelularizados con células cardíacas específicas ha producido resultados prometedores in vitro 2,5. Descelularización toda la perfusión de órganos permitido para el mantenimiento de la vasculatura nativa, que es crítica en recelularización del tejido. Los factores de crecimiento inherentes, proteínas de la matriz, y arquitectura tridimensional de fibra también se promueve la unión celular apropiada, la migración, y la señalización para reconstituir tejido contráctil del miocardio. Porcino cardíaco extracelularlar matriz será más difícil de recellularize debido al tamaño del andamio y el número de células necesarias para la comunicación celular apropiado y transporte de nutrientes. Sin embargo, los parches cortadas a partir de la matriz cardiaca puede ser útil para aplicaciones in vivo. Múltiples estudios han demostrado la ventaja potencial de usar una matriz específica de sitio para la reconstrucción del tejido dañado en modelos animales 11-13. Por lo tanto, una extracelular andamio matriz derivada de tejido cardíaco es deseable para aplicaciones de reconstrucción de miocardio. La arquitectura inherente del tejido cardiaco puede presentar ventajas sobre un andamio ECM derivado de otro órgano o un biomaterial artificial. Un sitio específico de andamio puede apoyar la infiltración de células huésped y promover una respuesta remodelación constructiva, en oposición a la formación de tejido cicatricial. Hasta la fecha, parches cardíacos ECM han sido investigados in vivo para reconstruir un defecto creado en la pared del miocardio 14. Futuros estudiantestroqueles se pueden realizar in vitro para examinar la capacidad de la andamio para apoyar las células cardíacas sembradas y cultivadas en la matriz. Los métodos descritos en este documento también pueden ser aplicables a la descelularización de los corazones humanos. En conclusión, la descelularización de corazón porcino es posible y los métodos son claros. Investigación continuada de este material permitirá conocer su potencial para el uso clínico.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / material </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Gibco </td><td> 15090 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Pescador </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> NaN 3 </td><td> Sigma </td><td> S2002-500G </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> X100-1L </td><td></td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Pescador </td><td> BP399-20 </td><td></td></tr><tr><td> Desoxicolato de sodio </td><td> Sigma </td><td> D6750-500G </td><td></td></tr><tr><td> El ácido peracético </td><td> Pfaltz y Bauer </td><td> P05020 </td><td> 35% CAS # 79-21-0 </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Pharmco </td><td> 111000200 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Masterflex Drive Pump </td><td> Cole Parmer </td><td> SI-07.524-50 </td><td></td></tr><tr><td> Tubería Masterflex </td><td> Cole Parmer </td><td> 96400-18 </td><td> Tamaño 18 </td></tr><tr><td> Reductor de púas </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-30612-20 </td><td></td></tr><tr><td> Beaker 4L </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-540T </td><td></td></tr></tbody></table>

procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion

Perfusión basada descelularización órgano completo recientemente ha ganado interés en el campo de la ingeniería de tejidos como un medio para crear un sitio determinado andamios de matriz extracelular, mientras que en gran medida se mantiene la arquitectura nativa del andamio. Hasta la fecha, este enfoque se ha utilizado en una variedad de sistemas de órganos, incluyendo el corazón, pulmón, hígado y 1-5. Los métodos anteriores para descelularización tejidos sin una red vascular fácilmente accesible se han basado en la exposición prolongada del tejido a soluciones de detergentes, ácidos, o tratamientos enzimáticos como un medio para eliminar los componentes celulares y nucleares del medio ambiente circundante extracelular 6-8. Sin embargo, la eficacia de estos métodos con bisagras en la capacidad de las soluciones para impregnar el tejido por medio de difusión. En contraste, la perfusión de órganos a través del sistema vascular natural, reduce eficazmente la distancia de difusión y transporte facilitado de decellularizatien agentes en el tejido y los componentes celulares de los tejidos. En este documento, se describe un método para decellularize completamente un corazón porcino intacta a través de perfusión retrógrada coronaria. El protocolo produjo un completamente descelularizado cardíaco matriz extracelular (ECM-c) andamio con la estructura tridimensional del corazón intacto. Nuestro método utiliza una serie de enzimas, detergentes y ácidos junto con enjuagues hipertónicas e hipotónicas para ayudar en la lisis y la eliminación de las células. El protocolo utilizado una solución de tripsina para separar las células de la matriz seguido por soluciones de Triton X-100 desoxicolato de sodio y para ayudar en la eliminación de material celular. El protocolo descrito también utiliza una velocidad de perfusión de más de 2 L / min durante largos períodos de tiempo. La alta velocidad de flujo, junto con los cambios solución permitió el transporte de agentes para el tejido sin contaminación de restos celulares y se aseguró eficaz enjuague del tejido. El método descrito eliminado todo el material nuclear de natiVE tejido cardíaco porcino, la creación de un sitio específico cardíaco ECM andamio que se puede utilizar para una variedad de aplicaciones.

El efecto de la descelularización sobre corazones porcinos enteros, naturalmente, varía debido a las diferencias de tamaño, las presiones y disposición de los vasos. Por lo tanto, la composición exacta de los medios de andamiaje de la matriz extracelular derivados no será el mismo de corazón a corazón. La realización del protocolo descrito producirá un corazón que aparece blanco o translúcido, lo que indica la pérdida de material celular. Sin embargo, está ampliamente aceptado que un tejido puede ser considerado &quot;descelularizado&quot;, basada en la combinación de unos pocos parámetros cuantitativos más 8. Un protocolo de descelularización exitoso producirá una matriz con menos de 50 ng de ADN de doble cadena por mg de tejido (Figura 6). Con el fin de evitar una respuesta inmune del huésped tras la implantación de la matriz, el ADN que queda también debe contener menos de 200 pares de bases (Figura 7). Para confirmar estos hallazgos, la tinción de hematoxilina y eosina debe revelar la ausencia de materiales nuclearestinción en secciones representativas de los ventrículos y el tabique ventricular (Figura 8). Tricrómico de Masson confirma, además, la pérdida de paquetes musculares cardiacas y la retención de las redes de colágeno (Figura 9). <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. El extremo de púas de la tubería se inserta en la aorta del corazón nativo. El tubo debe ser fijada con abrazaderas o bandas de sujeción por encima de la válvula aórtica para asegurar la perfusión través de las arterias coronarias. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. El corazón se sumerge en agua en un vaso de precipitados de 4 l y burbujas de aire debe ser retirado de la tubería. Si se observan burbujas que salen de la aorta cerca de la tubería, los lazos adicionales debe ser utilizado para fijar el tubo a t<html> él aorta con el fin de mantener la presión adecuada en el tejido. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Como soluciones se perfunde a través de las arterias coronarias, el corazón pierde su color nativo, progresando desde las aurículas a la punta del corazón y localizado alrededor de las coronarias. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Después de la terminación de la desinfección y enjuague etapas del protocolo, el tubo se retira y el corazón se coloca sobre una almohadilla absorbente para permitir que el exceso de agua drene fuera del corazón. Esto garantiza una medición exacta de pesaje cuando el tejido y también permite que el tejido se relaje antes de seccionar. pg &quot;alt =&quot; Figura 5 &quot;/&gt; Figura 5. El ventrículo izquierdo (VI), el ventrículo derecho (VD) y el tabique ventricular se eliminó todo desde el corazón descelularizado para el procesamiento histológico de congelación y liofilización, y la cuantificación de ADN. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig6.jpg" alt="La figura 6" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50059/50059fig6highres.jpg"/> Figura 6. El análisis cuantitativo del contenido de ADN usando un ensayo de Verde Pico. Los ventrículos del corazón CECM muestran una disminución significativa en el contenido de ADN en comparación con ventrículos nativos. Los valores observados de ADN a partir de este protocolo se observan en o por debajo del 50 ng / mg de estándar para tejidos descelularizados. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig7.jpg" alt="Figura 7"/> Figura 7. Tamaño de fragmento de ADN, tal como se determina por ethidium bromuro de gel, mostró poco ADN residual en los ventrículos descelularizados cuando se compara con una matriz de vejiga urinaria (UBM) estándar. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig8.jpg" alt="Figura 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50059/50059fig8highres.jpg"/> Figura 8. Hematoxilina y eosina tinción mostró la eliminación completa de materiales nucleares de los ventrículos después de la finalización del protocolo de descelularización. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig9.jpg" alt="Figura 9" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50059/50059fig9highres.jpg"/> Figura 9. Tinción tricrómica de Masson de A) y B nativo) ventrículo descelularizado.

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Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Un método para eliminar rápida y completamente los componentes celulares de un corazón porcino intacta a través de perfusión retrógrada se describe. Este método rinde un sitio específico cardíaco extracelular andamio matriz que tiene el potencial para su uso en diversas aplicaciones clínicas.

Procedimiento para descelularización de corazón porcino por perfusión coronaria retrógrada

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

procedure-for-decellularization-porcine-heart-retrograde-coronary

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.8K vistas.  McGowan Institute for Regenerative Medicine. Un método para eliminar rápida y completamente los componentes celulares de un corazón porcino intacta a través de perfusión retrógrada se describe. Este método rinde un sitio específico cardíaco extracelular andamio matriz que tiene el potencial para su uso en diversas aplicaciones clínicas.

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Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

Descelularización y recelularización de hígados enteros

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Investigación

Bioingeniería

Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths annually; chronic obstructive pulmonary disease is currently the fourth leading cause of death in the United States1. Contributing to this mortality is the fact that lungs do not generally repair or regenerate beyond the microscopic, cellular level. Therefore, lung tissue that is damaged by degeneration or infection, or lung tissue that is surgically resected is not functionally replaced in vivo. To explore whether lung tissue can be generated in vitro, we treated lungs from adult rats using a procedure that removes cellular components to produce an acellular lung extracellular matrix scaffold. This scaffold retains the hierarchical branching structures of airways and vasculature, as well as a largely intact basement membrane, which comprises collagen IV, laminin, and fibronectin. The scaffold is mounted in a bioreactor designed to mimic critical aspects of lung physiology, such as negative pressure ventilation and pulsatile vascular perfusion. By culturing pulmonary epithelium and vascular endothelium within the bioreactor-mounted scaffold, we are able to generate lung tissue that is phenotypically comparable to native lung tissue and that is able to participate in gas exchange for short time intervals (45-120 minutes). These results are encouraging, and suggest that repopulation of lung matrix is a viable strategy for lung regeneration. This possibility presents an opportunity not only to work toward increasing the supply of lung tissue for transplantation, but also to study respiratory cell and molecular biology in vitro for longer time periods and in a more accurate microenvironment than has previously been possible.

We have developed a decellularized lung extracellular matrix and novel biomimetic bioreactor that can be used to generate functional lung tissue. By seeding cells into the matrix and culturing in the bioreactor, we generate tissue that demonstrates effective gas exchange when transplanted in vivo for short periods of time.

Procedimiento para la Ingeniería de pulmón

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

Successful tissue engineering involves the combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo. Scaffolds may be synthetic, naturally-derived or derived from tissues/organs. The latter are obtained using a technique called decellularization. Decellularization may involve a combination of physical, chemical, and enzymatic methods. The goal of this technique is to remove all cellular traces whilst maintaining the macro- and micro-architecture of the original tissue.
Intestinal tissue engineering has thus far used relatively simple scaffolds that do not replicate the complex architecture of the native organ. The focus of this paper is to describe an efficient decellularization technique for rat small intestine. The isolation of the small intestine so as to ensure the maintenance of a vascular connection is described. The combination of chemical and enzymatic solutions to remove the cells whilst preserving the villus-crypt axis in the luminal aspect of the scaffold is also set out. Finally, assessment of produced scaffolds for appropriate characteristics is discussed.

The article describes a methodology for the production of an acellular matrix from rat intestine. The derivation of intestinal scaffolds is important for future applications in tissue engineering, stem cell biology and drug testing.

Una Metodología Descelularización para la Producción de una matriz Intestinal Natural acelular

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

Procedimiento para Descelularización de rata hígados en un dispositivo de perfusión oscilante presión

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor biocompatibility, and cost. Plant tissues have favorable characteristics that make them uniquely suited for use as scaffolds, such as high surface area, excellent water transport and retention, interconnected porosity, preexisting vascular networks, and a wide range of mechanical properties. Two successful methods of plant decellularization for tissue engineering applications are described here. The first method is based on detergent baths to remove cellular matter, which is similar to previously established methods used to clear mammalian tissues. The second is a detergent-free method adapted from a protocol that isolates leaf vasculature and involves the use of a heated bleach and salt bath to clear the leaves and stems. Both methods yield scaffolds with comparable mechanical properties and low cellular metabolic impact, thus allowing the user to select the protocol which better suits their intended application.

Here we present, and contrast two protocols used to decellularize plant tissues: a detergent-based approach and a detergent-free approach. Both methods leave behind the extracellular matrix of the plant tissues used, which can then be utilized as scaffolds for tissue engineering applications.

Dos métodos de descelularización de tejidos vegetales para aplicaciones de ingeniería de tejidos

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and poor patency. Tissue engineering offers a novel solution to generate personalized grafts with a natural extracellular matrix containing the recipient&#39;s cells using the method of decellularization and recellularization. We show a detailed method for performing decellularization of the human saphenous vein and recellularization by perfusion of peripheral blood. The vein was decellularized by perfusing 1% Triton X-100, 1% tri-n-butyl-phosphate (TnBP) and 2,000 Kunitz units of deoxyribonuclease (DNase). Triton X-100 and TnBP were perfused at 35 mL/min for 4 h while DNase was perfused at 10 mL/min at 37 &#176;C for 4 h. The vein was washed in ultrapure water and PBS and then sterilized in 0.1% peracetic acid. It was washed again in PBS and preconditioned in endothelial medium. The vein was connected to a bioreactor and perfused with endothelial medium containing 50 IU/mL heparin for 1 h. Recellularization was performed by filling the bioreactor with fresh blood, diluted 1:1 in Steen solution, and adding endocrine gland-derived vascular endothelial growth factors (80 ng/mL), basic fibroblast growth factors (4 &#181;L/mL), and acetyl salicylic acid (5 &#181;g/mL). The bioreactor was then moved into an incubator and perfused for 48 h at 2 mL/min while maintaining glucose between 3 - 9 mmol/L. Later, the vein was washed with PBS, filled with endothelial medium and perfused for 96 h in the incubator. Treatment with Triton X-100, TnBP and DNase decellularized the saphenous vein in 5 cycles. The decellularized vein looked white in contrast to normal and recellularized veins (light red). The hematoxylin &#38; eosin (H&#38;E) staining showed the presence of nuclei only in normal but not in decellularized veins. In the recellularized vein, H&#38;E-staining showed the presence of cells on the luminal surface of the vein.

Here, we describe a protocol for the saphenous vein decellularization using detergents and recellularization by perfusion of the peripheral blood and the endothelial medium.

Descelularización y recelularización metodología de venas safenas humanas

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ultimately rejection can occur. Creating a functional, autologous bio-artificial heart could solve these challenges. Biofabrication of a heart comprised of scaffold and cells is one option. A natural scaffold with tissue-specific composition as well as micro- and macro-architecture can be obtained by decellularizing hearts from humans or large animals such as pigs. Decellularization involves washing out cellular debris while preserving 3D extracellular matrix and vasculature and allowing &#34;cellularization&#34; at a later timepoint. Capitalizing on our novel finding that perfusion decellularization of complex organs is possible, we developed a more &#34;physiological&#34; method to decellularize non-transplantable human hearts by placing them inside a pressurized pouch, in an inverted orientation, under controlled pressure. The purpose of using a pressurized pouch is to create pressure gradients across the aortic valve to keep it closed and improve myocardial perfusion. Simultaneous assessment of flow dynamics and cellular debris removal during decellularization allowed us to monitor both fluid inflow and debris outflow, thereby generating a scaffold that can be used either for simple cardiac repair (e.g. as a patch or valve scaffold) or as a whole-organ scaffold.

This method enables decellularization of a complex solid organ using a simple protocol based on osmotic shock and perfusion of ionic detergent with minimal organ matrix disruption. It comprises a novel decellularization technique for human hearts inside a pressurized pouch with real-time monitoring of flow dynamics and cellular debris outflow.

Descelularización de todo humano corazón dentro de una bolsa presurizada en una orientación invertida

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an allogeneic or xenogeneic source with human cells. A demonstration of methods for the efficient dissection, decellularization, and recellularization of porcine pancreas might benefit the field. Akin to human pancreases, porcine pancreases have a special anatomical arrangement with three lobes (splenic, duodenal, and connection) rounded by the duodenum and small intestine. The duodenal lobe of the pancreas connects to the duodenum by several small blood vessels. Tissue engineering of the pancreas is complicated because of its exocrine and endocrine nature. In this paper, we show a detailed protocol to dissect the whole porcine pancreas and decellularize it with detergents while saving its structure and some extracellular matrix components. To achieve complete perfusion, the aorta is chosen as inlet and the portal vein as outlet. The other blood vessels (hepatic artery, splenic vein, splenic artery,&#160;mesenteric artery and vein tree) and bile duct are ligated. To prevent the formation of thrombus, the pig is heparinized and, immediately after dissection, the organ is flushed with cold heparin. To inhibit the action of exocrine enzymes, the pancreas decellularization is set at 4 &#176;C. The decellularization is performed by perfusion of Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease, with an intermittent and final extensive washing. With a successful decellularization, the pancreas appears white, and a histological evaluation with hematoxylin and eosin shows an absence of nuclei with a preserved extracellular matrix structure. Thus, the proposed method can be used to successfully dissect and decellularize whole porcine pancreas.

Tissue engineering of the whole pancreas is a challenge because of its exocrine and endocrine functions. We show a method for the dissection of an intact porcine pancreas and the process of successful decellularization by perfusion of detergents Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease.

Aislamiento y la descelularización de un páncreas todo porcino

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.