Nos gustaría agradecer a profesor Anders Jeppsson por ayuda con el abastecimiento de los vasos sanguíneos utilizados en los experimentos. Este estudio fue financiado por la subvención de LUA ALF para SSH.

El tejido utilizado, y el protocolo de este trabajo sigue las directrices éticas de la Universidad de Gotemburgo.
1. almacenamiento y preparación de tejido
<ol><li>Cortar el tejido circundante de la vena safena obtenido usando tijeras y pinzas quirúrgicas. Nota: Se diseca la vena safena de la extremidad inferior de seres humanos por cirujanos vasculares. La vena safena utilizada en este trabajo es una parte no utilizada después de la cirugía de bypass.</li>
	<li>Para evitar fugas durante la perfusión, ligar todas las ramas de lado en sus extremos con suturas y pinzas.</li>
	<li>Mantener la vena en un tubo de 50 mL que contiene 40 mL de solución salina buffer fosfato (PBS). Lavar la vena cambiando PBS 2 - 3 veces para quitar el exceso de sangre. Almacenar la vena por congelación a-80 ° C.</li>
</ol>2. preparación de configuraciones de descelularización y recelularización biorreactor
Nota: Con unas tijeras, cortadas los tubos de silicio como se muestra en la tabla 1.
<ol><li>
Configuración de descelularización 1 (para perfusión Triton X-100 y lavado)
	<ol>
<li>A un 2 L compartimiento (recipiente de plástico), cinta todas las tres piezas de tubo como se muestra en la figura 1A. Nota: La cinta un tubo a una pared donde el borde toque la parte inferior de la cámara (entrada de detergente) y los otros dos tubos a la pared opuesta con una distancia de 5-10 cm en función de la longitud de la vena. Por lo menos 5 cm de estos tubos debe también ser adherida con cinta al piso de la cámara (entrada y salida de la vena).</li>
		<li>Utilizando los conectores Luer macho y hembra, se conectan en serie entrada del detergente al tubo B seguido por el tubo F, tubo C y finalmente a la entrada de la vena. Lugar el tubo F en el cassette de la peristáltica de la bomba me.</li>
		<li>Tomar otro tubo y conecte un extremo al enchufe de la vena. Coloque el otro extremo en el tarro de cristal con salida de la manguera inferior que se coloca a 45 cm por encima de la cámara (toma de detergente) y cinta adhesiva para asegurar. Tomar el tubo G y empuje un extremo de la salida de la manguera de la jarra de vidrio y coloque el otro extremo en la cámara de la vena. Nota: Las imágenes de instalación completa (flechas rojas), cámara y dirección (flechas blancas) se muestran en la figura 1A.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Descelularización configuración 2 (TnBP para perfusión)
	<ol>
<li>Tomar un frasco de vidrio de 1 L y coloque un extremo del tubo C (entrada de detergente) en la jarra hasta que el tubo toque el fondo de la jarra.</li>
		<li>Conecte el otro extremo al tubo F seguido de tubo C. Coloque el otro extremo del tubo C en la jarra hasta la mitad de profundidad (entrada de la vena). Coloque el tubo de F en el cartucho de la bomba peristáltica.</li>
		<li>Tomar el tubo D y coloque un extremo en la jarra (salida de la vena) hasta la mitad de la profundidad y el otro extremo en el tarro de cristal con el tubo inferior colocado a una altura de 45 cm de la entrada de la vena (toma de detergente). Para asegurar, cintas tubos de entrada y salida de detergente.</li>
		<li>Coloque la jarra de vidrio de 1 L en un agitador magnético y mantener el imán dentro de la botella.</li>
		<li>Tomar el tubo G y empuje un extremo en la salida de la manguera de la jarra y coloque el otro extremo un tarro de cristal 1 L. Nota: La imagen de instalación completa (flechas rojas), cámara y flujo de dirección (flechas blancas) se muestra en la figura 1B.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Descelularización configuración 3 (perfusión de DNasa)
	<ol>
<li>Tome una botella de vidrio de 250 mL y colocar ambos extremos del tubo C. lugar la zona media del tubo en el cartucho de la bomba peristáltica II. Nota: Un extremo del tubo es la entrada de la solución y el otro extremo del tubo está conectado a la entrada de la vena. Salida de la vena queda libre en la solución.</li>
		<li>Coloque la configuración entera incluyendo la bomba a 37 ° C. La imagen de instalación completa y la dirección del flujo se muestra en la figura 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Biorreactor de recelularización
	<ol>
<li>Mantenga todas las piezas como se muestra en la figura 2A.</li>
		<li>Como se muestra en la figura 2B, tomar el tapón de 4 Inserte en cada puerto, H (salida de la vena) del tubo, tubo I (entrada de los medios de comunicación) y tubo J (entrada de la vena). Inserte el otro extremo del tubo de H en el puerto 4 deth (medio de comunicación). Nota: La vista de la tapa de 4 puertos de la parte superior se muestra en la figura 2. Para una fácil inserción de tubos, corte los bordes a un punto agudo con una tijera.</li>
		<li>Doble el otro extremo del tubo de J en forma de U y atar con una sutura. Conecte los conectores reductores a los extremos interiores de los tubos H & J.</li>
		<li>Coloque el tubo de 60 mL con una base plana en la botella de vidrio de 250 mL y luego colocar la anterior configuración hecha en el tubo como se muestra en la Figura 2D. Como se muestra en la Figura 2E, conecte los tubos K, E y K en la serie. Conecte un tubo K a la entrada de la vena y otro tubo K a la entrada de los medios de comunicación. Nota: El diagrama esquemático de la configuración y la dirección del flujo se observa en la figura 2F.</li>
		<li>Esterilice en autoclave los el biorreactor.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparación de soluciones
<ol><li>Solución 1 (10 x agua): para 1 L de agua ultrapura, añadir 2 g de azida de sodio y 18,6 g de ácido etilendiaminotetracético (EDTA). Revolver hasta que sales se disuelven.</li>
	<li>Solución 2 (agua de x 1): 100 mL de solución 1 y añadir 900 mL de agua ultrapura.</li>
	<li>Solución 3 (5 x Triton X-100): A 950 mL de agua ultrapura, añadir 50 mL de Triton X-100, 1 g de azida de sodio y 9,3 g de EDTA. Revuelva hasta que se disuelva.</li>
	<li>Solución 4 (1 x Triton X-100): 200 mL de solución 3 y añadir 800 mL de agua ultrapura.</li>
	<li>Solución 5 (1 x TnBP): Añadir 10 mL de TnBP con una pipeta de 10 mL a 990 mL de solución 2.</li>
	<li>Solución 6 (40 Kunitz unidades/mL DNasa): Añadir Kunitz de 2.000 unidades de DNaseI en 50 mL de fosfato Buffer salino de Dulbecco que contiene CaCl2 y MgCl2. Preparar fresco y utilizar inmediatamente.</li>
	<li>Solución 7 (PBS): Añadir 24 g de cloruro de sodio, 0.6 g de cloruro de potasio, 4,32 g de fosfato de sodio y 0,72 g de fosfato de potasio al 3 L de agua ultrapura. Revuelva hasta que se disuelva. Ajustar el pH a 7.4. 1 L de PBS en el autoclave de esterilizar y almacenar por separado.</li>
	<li>Solución 8 (0,1% de ácido peracético): Añadir a 50 mL de solución estéril 7, 50 μl de ácido peracético. Preparar fresco y utilizar inmediatamente.</li>
</ol>4. preparación del medio endotelial
<ol><li>Añadir 5 mL de L-glutamina, 5 mL de anti-anti, 50 mL de suero humano AB y todos los componentes del kit de factor de crecimiento de EGM-2 excepto suero fetal bovino a 500 mL del medio de MCDB131 bajo una campana de estéril.</li>
</ol>5. descelularización de vena safena
<ol><li>Descongelar la vena safena humana de-80 ° C a temperatura ambiente. Otra vez congelar a-80 ° C y descongelar otra vez a temperatura ambiente.</li>
	<li>Una biopsia de 2 mm de longitud con unas tijeras de cortar y fijar en formol durante 24-48 h a temperatura ambiente. Atar cada extremo de la vena a las barbas de un conector Luer macho y hembra con una sutura.</li>
	<li>Conectar la vena a la configuración de la descelularización 1 y llenar 1 L de solución 2. Perfusión de 15 min a 35 mL/min vaciar el contenido de la configuración.</li>
	<li>Añadir 1 L de solución 4 y perfusión de 4 h a 35 mL/min vaciar el contenido de la configuración.</li>
	<li>Añadir 500 mL de solución 2 y perfusión de 5 minutos vaciar el contenido de la configuración. Repita este paso. Desconecte la vena de configuración de perfusión 1 y conectar a instalación de perfusión 2.</li>
	<li>Añadir 1 L de solución 5, encienda el agitador y perfusión durante 4 h a 35 mL/min. Nota: Solución 5 parece nublado después de convertirse en el agitador y la perfusión.</li>
	<li>Desconecte la vena de configuración perfusión 2 y lavar la vena fuera y por dentro con jeringa o una pipeta de 10 mL en 4 cambios de agua ultrapura para 5-10 minutos.</li>
	<li>Conectar la vena a configuración de perfusión 3, añadir 50 mL de solución 6 y perfusión de 10 mL/min en una cámara de 37 ° C por 4 h. vaciar el contenido de la instalación y desconecte la vena de la configuración.</li>
	<li>Conectar la vena para configuración de perfusión 1, llenar 1 L de solución 2 y perfusión durante la noche a 35 mL/min, repita el paso 5.4 paso 5.9 4 veces (para un total de 5 ciclos). Tomar una biopsia otra vez como se ha dicho en el paso 5.2. Nota: Omitir paso 5.8 segunda parte en los ciclos 1 y 3.</li>
	<li>Vacíe el contenido de la configuración. Llenar 1 L de solución 2 y perfusión durante 24 h a 35 mL/min solución el cambio 2 después de 12 h. vaciar el contenido de la configuración. Llenar 1L de agua ultrapura y perfusión durante 24 h a 35 mL/min cambio agua ultrapura después de 12 h.Empty el contenido de la configuración. Llenar 1 L de solución 7 y perfusión durante 24 h a 35 mL/min solución el cambio 7 después 12 h.</li>
</ol>6. verificación de descelularización
<ol><li>El formol fijada biopsias en agua ultrapura para proceso a 15 minutos en un procesador de tejidos siguiendo protocolos de lavado e incrustar en parafina22.</li>
	<li>Cortar 5 secciones μm utilizando un micrótomo y mancha con hematoxilina y 0.2% alcohólica eosina Meyer (H & E) siguiendo protocolos estándar22.</li>
	<li>Ver bajo un microscopio para verificar la pérdida de los núcleos en el tejido decellularized en comparación al tejido normal.</li>
</ol>7. recelularización
<ol><li>Esterilizar la vena colocando en un tubo de 50 mL que contenga 50 mL de solución 8. Agitar a 80 revoluciones por minuto (rpm) en la coctelera por 1 h a 37 ° C.</li>
	<li>Manejar una vena bajo la cabina de flujo laminar (LAF) de ahora en adelante para mantener la esterilidad. La transferencia de la vena utilizando pinzas estériles a un nuevo tubo de 50 mL que contenga 50 mL de solución estéril 7 y 500 μl de anti-anti. Menee como arriba de 12 h. cambio solución 7 al menos dos veces en el medio.</li>
	<li>Utilizando pinzas estériles, transferir la vena a un nuevo tubo de 50 mL y agregar 50 mL de medio de endotelial. Menee como arriba de 11 h.</li>
	<li>Montar el biorreactor utilizando guantes estériles en el gabinete de LAF. Atar la vena a vena entrada y salida con sutura estéril y pinzas el biorreactor.</li>
	<li>Conectar la vena con el biorreactor y el relleno con el mismo medio. Añadir heparina 50 IU/ml y perfusión de 1 h a 2 mL/min a 37 ° C.</li>
	<li>Recoge 15-25 mL de sangre fresca (dependiendo de la longitud de la vena) de la donante en tubos de vacutainer heparina cubierto y diluir 1:1 con solución Steen. Después, agregar derivados de glándula endocrina factor crecimiento endotelial vascular (EG-VEGF, 80 ng/mL), factor de crecimiento básico del fibroblasto (b-FGF, 4 μL/mL) y acetil salicílico ácido (5 μg/mL).</li>
	<li>El biorreactor se mueven a una incubadora de 37 ° C con 5% CO2 y perfusión durante 48 h a 2 mL/min.</li>
	<li>Aproximadamente después de 12 h, mover el biorreactor a un gabinete, LAF tomar una gota de sangre y medir la glucosa usando un dispositivo de monitoreo de glucosa en sangre. Si el nivel es menos de 3 mmol/L, añadir glucosa a traer en el rango de 7 a 9 mmol/L. repetir este paso cada 8-12 h.</li>
	<li>Después de 48 h, el biorreactor en el gabinete de LAF y drenar la sangre del biorreactor. Añadir 30 mL de solución estéril 7 y perfusión por 5 min la solución de drenaje. Añadir 30 mL de solución estéril 7 y perfusión durante 5 minutos repetir dos veces o hasta que el color rojo de la sangre se pierde. Nota: La biopsia se puede tomar para la verificación del accesorio de la célula. Desconectar la vena, cortar los bordes de 5 mm de la vena con tijera y deshacerse de ellos. Tomar una biopsia como se indica en el paso 5.2 y conectar la vena de nuevo al reactor biológico (paso opcional).</li>
	<li>Agregue 30-45 mL de medio de endotelial y perfusión durante 96 horas en la incubadora a 2 mL/min. Nota: Agregue medio endotelial hasta que la vena esté sumergida.</li>
	<li>Mover el biorreactor en el gabinete LAF, desconectar la vena recellularized, cortar los bordes de 5 mm de la vena utilizando tijeras y deseche. Tomar una biopsia como se indica en el paso 5.2.</li>
</ol>8. verificación de recelularización
<ol><li>Siga las instrucciones en la sección 6 y realizar la tinción H & E. Examinar los portaobjetos en un microscopio para detectar la presencia de células.</li>
</ol>

<ol>
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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspirin+and+other+platelet-aggregation+inhibiting+drugs.">Aspirin and other platelet-aggregation inhibiting drugs.</a> Medical Journal of Asutralia. 142 (1), 41-47 (1985).</li></ol>

SSH tiene acciones en Verigraft, una empresa que ha licenciado la tecnología de la ingeniería de los vasos sanguíneos de tejidos. Otros autores no tienen nada que revelar.

La técnica presentada aquí de descelularización de venas safenas es un método fácil, sencillo y rentable que puede aplicarse también a todas las venas de pequeño diámetro como las venas umbilicales y mamarias. Las soluciones de descelularización y sus concentraciones utilizadas en este método son de nuestros anteriores resultados6,7. Aunque se recomiendan 5 ciclos de descelularización, en ciertas venas también notamos descelularización completa en 3 ciclos. Sin embargo, se obtuvieron resultados reproducibles mediante el uso de 5 ciclos. Aplicación de este protocolo, decellularized las venas de distintas longitudes hasta 30 cm con éxito (inédito resultado). Salida de la solución de la descelularización de elevación de 45 cm creará una presión de 33 mmHg dentro de la vena. En nuestra experiencia, nos dimos cuenta de esto como un paso clave en decellularizing la vena todo uniforme y reproducible en 5 ciclos. La presión solicitada es 3 veces mayor que la presión de la vena safena normal (5-10 mmHg) pero es que el mismo como incompetente de las venas (varices)23. Además, especulamos que esta alta presión crea una fuerza significativa en las paredes de la vena y puede, por lo tanto, ayudar en la remoción de células más rápido y eficiente.
Ya TnBP es un solvente orgánico insoluble en agua, revolviendo el detergente hasta que se convierte en turbia es importante; de lo contrario, flotará el detergente. Por la misma razón, para mantener TnBP mezclado en solución, se colocó el tubo de salida de detergente en la parte superior de la jarra de cristal con salida de la manguera. Eliminación eficiente de TnBP de la vena después de su uso en cada ciclo se aprecia por la ausencia de flotante TnBP gotitas en el agua lavado. También hemos notado que también omitiendo el paso de la ADNasa produce un tejido decellularized pero en algunos casos, se observó un relativamente alto contenido de ADN en el tejido decellularized. Como de alta presión y alto caudal no es necesarios para la eficiente actividad de DNasa, puede utilizarse una tasa de perfusión baja (10 mL/min). Se utilizó una bomba peristáltica diferentes debido a su tamaño más pequeño ayuda en el fácil manejo de la configuración. Puesto que nos dimos cuenta de que el daño de la mayoría de las células durante resultados de descelularización en ciclo 2, sugerimos saltar tratamiento de DNasa durante los ciclos 1 y 3 (resultados no publicados). A pesar de la caracterización y cuantificación de proteínas de matriz extracelular no se realizaron en este manuscrito, nuestra experiencia anterior con protocolos similares de descelularización demostró la preservación de propiedades biomecánicas, estructura y proteínas de matriz extracelular7. Aunque nuestros experimentos de cuantificación preliminar con estas venas produjeron un resultado similar (inédito), nuestros resultados ya publicados van a fortalecer esta confianza.
Recelularización con sangre es un proceso fácil y práctico sobre las células de la médula ósea ampliada como uno puede evitar largos tiempos de expansión celular, mutaciones espontáneas en células ampliadas, invasión quirúrgica y molestias para el paciente. Ya se sabe que endotelialización también puede ocurrir por circulación de EPCs, presumimos la perfusión de sangre seguido de perfusión con endotelial medio será suficiente para recelularización. La seguridad de los tejidos vena diseñado usando un método similar es vista desde resultados exitosos de trasplante cuando dos tales venas fueron implantadas en niños con obstrucción de vena porta extra hepática7. Especulamos que los factores de crecimiento en decellularized matriz extracelular permite el accesorio de EPCs de circulación de sangre24. Recelularización de venas siguiendo un protocolo similar demostró las células positivas para el receptor VEGF-2 y cluster de diferenciación (CD) 14 en el lumen y CD45 se observaron células expresa en adventicia7. También nos imaginamos que una continua capa endotelial puede no observarse en todos los casos sobre todo cuando con sangre de pacientes mayores y enfermas como es sabido que tales individuos han disminuido el número de circulación de las células progenitoras25. Sin embargo, postulamos que la perfusión con el destinatario sangre muchos de los antígenos que están expuestos debido a descelularización y así pueden disminuir las posibilidades de reacciones inflamatorias adversas cuando trasplantados en comparación con sólo el trasplante puede enmascarar decellularized de los vasos sanguíneos. Además, la perfusión de la sangre puede depositar aumento en los niveles de factores de crecimiento en la luz y la adventicia, que a su vez puede reclutar mayor número de células progenitoras, lo que resulta en un rápido proceso de recelularización en vivoen circulación.
Las ventajas del diseño del biorreactor utilizado en este estudio son completa esterilización en autoclave, fácil montaje, rentabilidad, fácil manejo y la menor posibilidad de daños. En nuestra experiencia, utilizando el diseño actual, las venas se recellularized hasta 10 cm de longitud. A pesar de las venas hasta 25 cm de largo también puede ser recellularized manteniendo la vena en forma de "U" en el biorreactor, esto debe ser validado. El diseño del biorreactor muestra que la dirección del flujo en la vena es contra la gravedad y está diseñada como tal porque es la dirección normal del flujo de estas venas en los seres humanos. La perfusión de 12 h del paso medio endotelial es requisito la vena y aumenta la afinidad para la fijación de las EPCs. Además de la heparina adicional y perfusión de 1 h disminuirá el riesgo de formar coágulos de sangre en los tubos durante la perfusión de la sangre.
El volumen de sangre requerido depende de la longitud de la vena. El principio básico que seguimos para el volumen de sangre es que la vena debe estar sumergida en la sangre. Durante la manipulación de volúmenes de sangre mayores de 45 mL, mezclando ocasionalmente podría ser necesario para evitar la acumulación de células en la parte inferior del biorreactor. Hemos añadido solución de Steen sangre ya que contiene una alta cantidad de proteínas y componentes necesarios para mantener los tejidos sanos durante el trasplante de órgano26,27. Adición de VEGF y FGF b es beneficioso ya que son factores de crecimiento de angiogenic potente28 y su presencia induce la migración, proliferación y diferenciación de EPCs29,30,31,32 . La cantidad de VEGF añadido se basa en nuestros anteriores resultados inéditos donde fue vista la proliferación de las EPCs a 80 ng/mL. Además de la aspirina inhibe la activación de las plaquetas33 disminuyendo las posibilidades de su adhesión a la capa endotelial. Monitoreo continuo y la adición de glucosa también será beneficiosos para prevenir la hemólisis de glóbulos rojos y proliferación celular.
Ya que sólo una muestra de sangre simple se requiere del receptor, puede considerarse como un procedimiento fácil y factible que requieren menos técnicos. A pesar de todo el procedimiento que se muestra aquí de principio a fin tarda 20 días, guardar las venas decellularized como un producto acortará el procedimiento para 8 días para los pacientes fuera de la plataforma. Aunque almacenamiento de venas decellularized técnicamente no debería afectar la eficiencia de recelularización, deben ser evaluado. Ingeniería de tejidos las venas generadas siguiendo este procedimiento pueden utilizarse en la clínica para cirugías de bypass, reemplazando las venas obstruidas, insuficiencia venosa a las venas varicosas sin necesidad de inmunosupresión y proporcionando así una mejor calidad de vida para el paciente.

Conductos vasculares son necesarios para varias condiciones clínicas como aneurismas, estenosis de la arteria carótida y ateroesclerosis llevando a problemas vasculares severos. Cirujanos utilizan conductos vasculares autólogos, alogénicos o sintéticos para restaurar el suministro de sangre funcional. Aunque el uso de vasos sanguíneos autólogos todavía se considera el enfoque ideal, la disponibilidad en pacientes está mayormente limitada. Las alternativas tales como injertos alogénicos o sintéticos tienen profundos problemas con tratamientos inmunosupresores y pobre permeabilidad hacia la reintervención1,2, resultando en salud importante cargas económicas a los países. Ingeniería del tejido fino de los vasos sanguíneos pretende ofrecer injertos con una homología natural y células autólogas. Así, el recipiente sistema inmune reconoce el injerto trasplantado como uno mismo y desde tal injerto contiene las células en la configuración original y proteínas naturales, podría funcionar mejor en comparación con las alternativas actuales. Tejido había diseñado órganos, tales como la vejiga3la uretra4, la tráquea5y las venas6,7, se han utilizado con éxito en la clínica.
Ingeniería de tejidos para producir injertos personalizados requiere un injerto de un donante, seguido de descelularización y recelularización. Descelularización es una prometedora tecnología para eliminar las células de los tejidos y órganos8,9,10. Descelularización puede realizarse por métodos físicos, químicos y enzimáticos específicos11 o combinándolas. En el uso óptimo de estos métodos, los tejidos decellularized pueden tener proteínas estructurales y funcionales similares en una matriz extracelular similar al tejido nativo. Tales órganos poseen la capacidad intrínseca para mejorar el apego, la migración, proliferación y diferenciación de las células madre.
Recelularización es un proceso dinámico de la siembra de células en el injerto y receptor de las células madre pueden utilizarse para trasplante de la clínico. Células madre actualmente utilizadas para tales propósitos incluyen la médula ósea, mesenquimal y órgano residentes3,5,6. Animales y estudios orientados a la investigación han utilizado células madre de origen mesenquimal que son pluripotentes inducidas y fetal12,13,14. Este proceso requiere un biorreactor (una cámara que contiene la vena y proporciona las condiciones necesarias como temperatura, gases, pH y presión), las células y los medios de cultivo. El reto de recelularización es obtener el número de células de un tipo particular y una estrategia de siembra por el cual las células pueden llegar a todo tejido u órgano. A pesar de que ningún órgano o tejido completo estructural y funcionalmente ha generado y evaluado hasta ahora, varios avances en el campo y los resultados iniciales demuestran la posibilidad futura de15. La función clave de la vena se encuentra en el endotelio luminal que controla la infiltración de células inflamatorias en los tejidos y la capa media de músculo liso que ayuda en la constricción y también proporciona la fuerza necesaria para mantener la presión arterial16. Los estudios han demostrado que durante el daño, endotelialización ocurre de anastomosis o de circulación de las células progenitoras endoteliales (EPCs) en sangre17,18,19. Nuestra estrategia de recelularización de venas se basa en las EPCs presentes en la sangre circulante.
Ingeniería de tejidos de venas y arterias se realizó por varios grupos siguiendo diferentes descelularización y recelularización estrategias20,21. Nuestro grupo también ha actuado y desarrollado estrategias descelularización y recelularización para venas ilíacas y mamaria6,7. Descelularización fue realizada por la agitación de la vena en Tritón X-100, tri-n-butil fosfato (TnBP) y la enzima desoxirribonucleasa (DNasa). La recelularización fue realizada usando médula ósea derivado de células endoteliales y musculares lisas6 o7de la sangre periférica. Las venas recellularized por cualquier protocolo demostrada promesa clínica en la prestación de suministro de sangre funcional en el trasplante de pacientes pediátricos con extra hepática de la vena porta obstrucción6,7.
Actualmente hemos desarrollado una versión modificada del mismo protocolo para la actuación mejorada y fácil de descelularización y recelularización biorreactor manejo de venas de pequeño diámetro. El protocolo actual de descelularización requiere perfusión de detergentes a través de la vena utilizando presión en lugar de agitación con detergentes. El protocolo de recelularización implica un paso adicional de preacondicionamiento para mejorar la adhesión celular y la adición de factores de crecimiento en la circulación de la sangre para mejorar la supervivencia, proliferación y adhesión celular. También hemos mejorado el diseño del biorreactor utilizando productos comercialmente disponibles. En este trabajo presentamos una descripción detallada del protocolo modificado para realizar descelularización y recelularización de venas safenas humanas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1159px;" width="1158">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:333px;">4-Port Cap</td>
			<td style="width:208px;">CPLabSafety</td>
			<td style="width:119px;">WF-GL45-4Kit</td>
			<td style="width:499px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Acetyl salicylic acid</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Anti-Anti</td>
			<td style="width:208px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">B-FGF</td>
			<td style="width:208px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">cc-4113B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:333px;">Blood Glucose monitoring system - Free style Lite</td>
			<td style="width:208px;">Abbott</td>
			<td style="width:119px;">70808-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">DNase-I</td>
			<td style="width:208px;">Worthington</td>
			<td style="width:119px;">LS0020007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:333px;">Dulbecco&#39;s PBS with CaCl2 and MgCl2</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td style="width:208px;">AlfaAesar</td>
			<td style="width:119px;">A15161.OB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">EGM-2 Growth Factors Kit</td>
			<td style="width:208px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:333px;">EG-VEGF</td>
			<td style="width:208px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">100-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:333px;">Glass bottle 250ml</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2151593</td>
			<td>Any bottle with GL45 cap can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Glass bottle 1L</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2151595</td>
			<td>Any bottle with GL45 cap can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Glass jar 500ml with bottom hose outlet</td>
			<td style="width:208px;">Kimble Chase Life Science</td>
			<td style="width:119px;">14607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Heparin</td>
			<td style="width:208px;">Leo</td>
			<td style="width:119px;">387107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Heparin Coated Vacutainer Tubes</td>
			<td style="width:208px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">368480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Human AB Serum</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:208px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Luer Female with 1/8&#34; ID Barb</td>
			<td style="width:208px;">Oina</td>
			<td style="width:119px;">LF-2PP-QC</td>
			<td>For 3X5mm silicon tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Luer Female with 3/32&#34; ID Barb</td>
			<td style="width:208px;">Oina</td>
			<td style="width:119px;">LF-1.5PP-QC</td>
			<td>For 2X4mm silicon tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Luer Male with 3/32&#34; ID Barb</td>
			<td style="width:208px;">Oina</td>
			<td style="width:119px;">LM-1.5PP-QC</td>
			<td>For 2X4mm silicon tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Luer Male with 1/8&#34; ID Barb</td>
			<td style="width:208px;">Oina</td>
			<td style="width:119px;">LM-2PP-QC</td>
			<td>For 3X5mm silicon tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Luer Male with 5/32&#34; ID Barb</td>
			<td style="width:208px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">EW-45518-06</td>
			<td>For 5X8mm silicon tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">MCDB 131</td>
			<td style="width:208px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10372-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Per acetic acid</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">433241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Peristaltic pump I</td>
			<td style="width:208px;">Masterflex</td>
			<td style="width:119px;">7524-45</td>
			<td>For Decellularization setup 1 and 2. The cassette used is 7519-75</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Peristaltic pump II</td>
			<td style="width:208px;">Ismatec</td>
			<td style="width:119px;">ISM941</td>
			<td>For Decellularization setup 3 and Recellularization bioreactor.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Potassium hydrogen phosphate</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Reducing Connector 1.5mmX2.5mm</td>
			<td style="width:208px;">Biotech</td>
			<td style="width:119px;">ISM569A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Shaker</td>
			<td style="width:208px;">Ika</td>
			<td style="width:119px;">KS4000 i&#160; control</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">71290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">13423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Sodium hydrogen phosphate</td>
			<td style="width:208px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">71640-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Steen solution</td>
			<td style="width:208px;">Xvivo</td>
			<td style="width:119px;">19004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Suture</td>
			<td style="width:208px;">Agnthos</td>
			<td style="width:119px;">14817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Tri-n-butyl Phosphate</td>
			<td style="width:208px;">AlfaAesar</td>
			<td style="width:119px;">A16084.AU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:208px;">AlfaAesar</td>
			<td style="width:119px;">A16046.OF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Tube 60ml with flat base</td>
			<td style="width:208px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">60596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube A</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280706</td>
			<td>Cut 3 pieces, each of 25 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube B</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280706</td>
			<td>Cut 1 piece of 35 cm length for decellularization perfusion steup</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube C</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280706</td>
			<td>Cut 5 pieces, each of 75 cm length for decellularization perfusion steups 1-3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube D</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280706</td>
			<td>Cut 1 piece of 90 cm length for decellularization perfusion steup 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube E</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280706</td>
			<td>Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube F</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280713</td>
			<td>Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube G</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280713</td>
			<td>Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube H</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280703</td>
			<td>Cut 1 piece of 15 cm length for recellularization perfusion steup</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube I</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280703</td>
			<td>Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube J</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280703</td>
			<td>Cut 1 piece of 25 cm length for recellularization perfusion steup</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube K</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280703</td>
			<td>Cut 2 pieces, each of 35 cm length for recellularization perfusion steup</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

decellularization and recellularization methodology for human saphenous veins

Conductos vasculares utilizados en la mayoría de las cirugías vascular son injertos alogénicos o sintéticos que a menudo conducen a las complicaciones causadas por la inmunodepresión y pobre permeabilidad. Ingeniería de tejidos ofrece una solución novedosa para generar injertos personalizados con una matriz extracelular natural que contiene células del destinatario utilizando el método de descelularización y recelularización. Mostramos un método detallado para realizar la descelularización de la vena safena humana y recelularización por la perfusión de la sangre periférica. La vena fue decellularized por perfusión 1% Tritón X-100, 1% tri-n-butil-fosfato (TnBP) y 2.000 unidades de Kunitz de desoxirribonucleasa (DNasa). Triton X-100 y TnBP fueron perfundidos a 35 mL/min durante 4 h y DNasa se perfunde en 10 mL/min a 37 ° C por 4 h. La vena fue lavada en agua ultrapura y PBS y luego esterilizada en 0,1% de ácido peracético. Se lavó otra vez en PBS y precondicionada en medio endotelial. La vena fue conectada a un biorreactor y perfundida con medio endotelial que contiene 50 IU/mL heparina por 1 h. recelularización fue realizada por llenar el biorreactor con sangre fresca, diluido 1:1 en solución Steen y agregando derivados de glándula endocrina vascular factores de crecimiento endotelial (80 ng/mL), factores de crecimiento básico del fibroblasto (4 μL/mL) y acetil salicílico ácido (5 μg/mL). El biorreactor fue trasladado a una incubadora y perfundido durante 48 h a 2 mL/min, manteniendo la glucosa entre 3-9 mmol/L. Más tarde, la vena se lavaron con PBS, lleno de medio endotelial y perfundida durante 96 horas en la incubadora. Tratamiento con Tritón X-100, TnBP y DNasa decellularized la vena safena en 5 ciclos. La vena decellularized parecía blanca a diferencia de las venas normales y recellularized (rojo claro). La hematoxilina y eosina (H & E) coloración demostró la presencia de núcleos sólo en normal pero no en las venas decellularized. En la vena recellularized, H & E tinción demostraron la presencia de células en la superficie luminal de la vena.

La morfología gruesa de una vena normal es luz roja (Figura 3A). El color rojo se pierde en la descelularización progresiva ciclos (ciclo 2, figura 3B; ciclo 3, figura 3) y por el 5to ciclo, se ve pálido y blanco (figura 3D). La vena recellularized después de la perfusión de la sangre (figura 3E) y perfusión de medios endotelial (figura 3F) se ve rojo brillante en color. Los 5 ciclos de tratamiento de descelularización habían quitado con éxito las células de la vena como no se ven núcleos azul en la tinción H & E (Figura 4B). En contraste, varios núcleos fueron vistos en la vena normal (Figura 4A). La presencia de células conectadas en el lado luminal se observa tinción H & E en el recellularized de la vena con sangre durante 48 h (figura 4, flechas negras) y después de la perfusión con el medio endotelial de 96 h (figura 3D, flechas negras).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig1.jpg"> Figura 1 : Montaje de instalaciones de perfusión de descelularización. A) la imagen que muestra la configuración de descelularización montado 1 para Triton X-100 y lavado. Las flechas blancas indican la trayectoria del flujo de soluciones y flechas rojas indican las entradas y salidas para vena y soluciones. B) el cuadro que muestra la configuración de descelularización montado 2 para perfusión TnBP. Del mismo modo, como en configuración de descelularización 1, las flechas blancas indican la trayectoria del flujo de soluciones y flechas rojas indican las entradas y salidas para vena y soluciones. C) el cuadro que muestra la configuración de descelularización montado 3 para perfusión de desoxirribonucleasa. Las flechas blancas indican la trayectoria del flujo de soluciones y flechas rojas indican entradas de vena y soluciones. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57803/57803fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig2.jpg"> Figura 2 : Preparación y montaje del biorreactor de recelularización. A) cuadro muestra materiales necesarios para montar el biorreactor. B) imagen del interior de la tapa del puerto de 4 que muestra la colocación de conectores (flechas rojas), de reducir los puntos para conectar la vena de entrada y salida (flechas blancas) y arreglo de tubos de H, I y J. El extremo libre del tubo de H se coloca en el biorreactor para devolver los medios de comunicación. C) se observan los tubos respectivos entrando y saliendo de la parte superior del tapón de 4. D) foto mostrando el biorreactor montado. E) cuadro que muestra la configuración entera del biorreactor con la bomba peristáltica. Los tubos K amplían las conexiones desde el biorreactor a la bomba peristáltica. F) la representación esquemática del sistema de perfusión de biorreactor todo. Las flechas naranjas indican la dirección del flujo. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57803/57803fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig3.jpg"> Figura 3 : Bruto morfología de las venas durante la descelularización y recelularización. A) la morfología gruesa vena normal se ve rojo brillante en color. El color se pierde con el aumento del número de ciclos de descelularización B) ciclo 2 y C) ciclo 3. D) por 5 ciclos, la vena se ve pálido y blanco. La vena después de perfundiendo con E) sangre durante 48 h y F) con el medio endotelial de 96 h se ve rojo brillante una vez más en color. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57803/57803fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig4.jpg"> Figura 4 : Caracterización de las venas decellularized y recellularized. La hematoxilina y eosina tinción imagen de A) vena normal contiene muchos núcleos azul pero están ausentes en B) la vena decellularized. En la vena recellularized con C) sangre durante 48 h y con D) observó medio endotelial por 96 h, fijación de las células (flechas negras) en el lumen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57803/57803fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Descelularización y recelularización metodología de venas safenas humanas

Aquí, describimos un protocolo para la vena safena descelularización mediante detergentes y recelularización, perfusión de la sangre periférica y la endotelial.

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

decellularization-recellularization-methodology-for-human-saphenous

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.1K vistas.  University of Gothenburg. Aquí, describimos un protocolo para la vena safena descelularización mediante detergentes y recelularización, perfusión de la sangre periférica y la endotelial.

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Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

Descelularización y recelularización de hígados enteros

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Investigación

Bioingeniería

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use of destructive assessment is not acceptable. A proposed alternative is the use of an imaging process called magnetic resonance elastography. Elastography is a nondestructive method for determining the engineered outcome by measuring local mechanical property values (i.e., complex shear modulus), which are essential markers for identifying the structure and functionality of a tissue. As a noninvasive means for evaluation, the monitoring of engineered constructs with imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) has seen increasing interest in the past decade1. For example, the magnetic resonance (MR) techniques of diffusion and relaxometry have been able to characterize the changes in chemical and physical properties during engineered tissue development2. The method proposed in the following protocol uses microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE) as a noninvasive MR based technique for measuring the mechanical properties of small soft tissues3. MRE is achieved by coupling a sonic mechanical actuator with the tissue of interest and recording the shear wave propagation with an MR scanner4. Recently, &mu;MRE has been applied in tissue engineering to acquire essential growth information that is traditionally measured using destructive mechanical macroscopic techniques5. In the following procedure, elastography is achieved through the imaging of engineered constructs with a modified Hahn spin-echo sequence coupled with a mechanical actuator. As shown in Figure 1, the modified sequence synchronizes image acquisition with the transmission of external shear waves; subsequently, the motion is sensitized through the use of oscillating bipolar pairs. Following collection of images with positive and negative motion sensitization, complex division of the data produce a shear wave image. Then, the image is assessed using an inversion algorithm to generate a shear stiffness map6. The resulting measurements at each voxel have been shown to strongly correlate (R2&gt;0.9914) with data collected using dynamic mechanical analysis7. In this study, elastography is integrated into the tissue development process for monitoring human mesenchymal stem cell (hMSC) differentiation into adipogenic and osteogenic constructs as shown in Figure 2.

The procedure demonstrates the methodology of magnetic resonance elastography for monitoring the engineered outcome of adipose and osteogenic tissue engineered constructs through noninvasive local assessment of the mechanical properties using microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE).

Metodología elastografía por resonancia magnética para la Evaluación de los tejidos Diseñado crecimiento Construct

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

Citometría de masas: Protocolo para la afinación y servicio diario muestras de células en un citómetro de masas CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Perfusion-based whole organ decellularization has recently gained interest in the field of tissue engineering as a means to create site-specific extracellular matrix scaffolds, while largely preserving the native architecture of the scaffold. To date, this approach has been utilized in a variety of organ systems, including the heart, lung, and liver 1-5. Previous decellularization methods for tissues without an easily accessible vascular network have relied upon prolonged exposure of tissue to solutions of detergents, acids, or enzymatic treatments as a means to remove the cellular and nuclear components from the surrounding extracellular environment6-8. However, the effectiveness of these methods hinged upon the ability of the solutions to permeate the tissue via diffusion. In contrast, perfusion of organs through the natural vascular system effectively reduced the diffusion distance and facilitated transport of decellularization agents into the tissue and cellular components out of the tissue. Herein, we describe a method to fully decellularize an intact porcine heart through coronary retrograde perfusion. The protocol yielded a fully decellularized cardiac extracellular matrix (c-ECM) scaffold with the three-dimensional structure of the heart intact. Our method used a series of enzymes, detergents, and acids coupled with hypertonic and hypotonic rinses to aid in the lysis and removal of cells. The protocol used a Trypsin solution to detach cells from the matrix followed by Triton X-100 and sodium deoxycholate solutions to aid in removal of cellular material. The described protocol also uses perfusion speeds of greater than 2 L/min for extended periods of time. The high flow rate, coupled with solution changes allowed transport of agents to the tissue without contamination of cellular debris and ensured effective rinsing of the tissue. The described method removed all nuclear material from native porcine cardiac tissue, creating a site-specific cardiac ECM scaffold that can be used for a variety of applications.

A method to rapidly and completely remove cellular components from an intact porcine heart through retrograde perfusion is described. This method yields a site specific cardiac extracellular matrix scaffold which has the potential for use in multiple clinical applications.

Procedimiento para descelularización de corazón porcino por perfusión coronaria retrógrada

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

Successful tissue engineering involves the combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo. Scaffolds may be synthetic, naturally-derived or derived from tissues/organs. The latter are obtained using a technique called decellularization. Decellularization may involve a combination of physical, chemical, and enzymatic methods. The goal of this technique is to remove all cellular traces whilst maintaining the macro- and micro-architecture of the original tissue.
Intestinal tissue engineering has thus far used relatively simple scaffolds that do not replicate the complex architecture of the native organ. The focus of this paper is to describe an efficient decellularization technique for rat small intestine. The isolation of the small intestine so as to ensure the maintenance of a vascular connection is described. The combination of chemical and enzymatic solutions to remove the cells whilst preserving the villus-crypt axis in the luminal aspect of the scaffold is also set out. Finally, assessment of produced scaffolds for appropriate characteristics is discussed.

The article describes a methodology for the production of an acellular matrix from rat intestine. The derivation of intestinal scaffolds is important for future applications in tissue engineering, stem cell biology and drug testing.

Una Metodología Descelularización para la Producción de una matriz Intestinal Natural acelular

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

Procedimiento para Descelularización de rata hígados en un dispositivo de perfusión oscilante presión

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are an emerging treatment for photoreceptor degenerative diseases that seek to restore vision by artificially stimulating the surviving retinal neurons in the hope of eliciting comprehensible visual perception in patients. Current retinal prostheses have demonstrated success in restoring limited vision to patients using an array of electrodes to electrically stimulate the retina but face substantial physical barriers in restoring high acuity, natural vision to patients. Chemical neurostimulation using native neurotransmitters is a biomimetic alternative to electrical stimulation and could bypass the fundamental limitations associated with retinal prostheses using electrical neurostimulation. Specifically, chemical neurostimulation has the potential to restore more natural vision with comparable or better visual acuities to patients by injecting very small quantities of neurotransmitters, the same natural agents of communication used by retinal chemical synapses, at much finer resolution than current electrical prostheses. However, as a relatively unexplored stimulation paradigm, there is no established protocol for achieving chemical stimulation of the retina in vitro. The purpose of this work is to provide a detailed framework for accomplishing chemical stimulation of the retina for investigators who wish to study the potential of chemical neuromodulation of the retina or similar neural tissues in vitro. In this work, we describe the experimental setup and methodology for eliciting retinal ganglion cell (RGC) spike responses similar to visual light responses in wild-type and photoreceptor-degenerated wholemount rat retinas by injecting controlled volumes of the neurotransmitter glutamate into the subretinal space using glass micropipettes and a custom multiport microfluidic device. This methodology and protocol are general enough to be adapted for neuromodulation using other neurotransmitters or even other neural tissues.

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

This protocol describes a novel method for investigating a form of chemical neurostimulation of wholemount rat retinas in vitro with the neurotransmitter glutamate. Chemical neurostimulation is a promising alternative to the conventional electrical neurostimulation of retinal neurons for treating irreversible blindness caused by photoreceptor degenerative diseases.

Metodología para la neuromodulación química Biomimetic de Retinas de ratas con el neurotransmisor glutamato In Vitro

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are ...

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components are presented as a surface coating. These culture systems constitute a simplification of the complex nature of the tissue ECM that encompasses biochemical composition, structure, and mechanical properties. To better emulate the ECM-cell communication shaping the cardiac microenvironment, we developed a protocol that allows for the decellularization of the whole fetal heart and adult left ventricle tissue explants simultaneously for comparative studies. The protocol combines the use of a hypotonic buffer, a detergent of anionic surfactant properties, and DNase treatment without any requirement for specialized skills or equipment. The application of the same decellularization strategy across tissue samples from subjects of various age is an alternative approach to perform comparative studies. The present protocol allows the identification of unique structural differences across fetal and adult cardiac ECM mesh and biological cellular responses. Furthermore, the herein methodology demonstrates a broader application being successfully applied in other tissues and species with minor adjustments, such as in human intestine biopsies and mouse lung.

The cardiac extracellular matrix (ECM) is a complex network of molecules that orchestrate key processes in tissues and organs while enduring physiological remodeling throughout life. Standardized decellularization of fetal and adult hearts permits comparative experimental studies of both tissues in a 3D context by capturing native architecture and biomechanical properties.

Descelularización comparable de explantes de tejido cardíaco Fetal y adulto como 3D-como plataformas para estudios In Vitro

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor biocompatibility, and cost. Plant tissues have favorable characteristics that make them uniquely suited for use as scaffolds, such as high surface area, excellent water transport and retention, interconnected porosity, preexisting vascular networks, and a wide range of mechanical properties. Two successful methods of plant decellularization for tissue engineering applications are described here. The first method is based on detergent baths to remove cellular matter, which is similar to previously established methods used to clear mammalian tissues. The second is a detergent-free method adapted from a protocol that isolates leaf vasculature and involves the use of a heated bleach and salt bath to clear the leaves and stems. Both methods yield scaffolds with comparable mechanical properties and low cellular metabolic impact, thus allowing the user to select the protocol which better suits their intended application.

Here we present, and contrast two protocols used to decellularize plant tissues: a detergent-based approach and a detergent-free approach. Both methods leave behind the extracellular matrix of the plant tissues used, which can then be utilized as scaffolds for tissue engineering applications.

Dos métodos de descelularización de tejidos vegetales para aplicaciones de ingeniería de tejidos

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...