Reacción de griess optimizada para UV-Vis y determinación a vista desnuda de primaquina antipalúdica

Este protocolo describe un nuevo método colorimétrico para la detección de primaquinas antipalúdicas (PMQ) en orinas sintéticas y sueros humanos.

Primaquina (PMQ), un importante medicamento antipalúdico, ha sido recomendado por la Organización Mundial de la Salud (OMS) para el tratamiento de infecciones potencialmente mortales causadas por P. vivax y ovale. Sin embargo, PMQ tiene efectos adversos no deseados que conducen a la hemólisis aguda en pacientes con deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD). Hay una necesidad de desarrollar métodos simples y confiables para la determinación de PMQ con el propósito de la supervisión de dosis. A principios de 2019, hemos informado de un enfoque basado en UV-Vis y a simple vista para la cuantificación colorimétrica PMQ. La detección se basó en una reacción similar a la Griess entre PMQ y anilines, que puede generar productos azoicos de color. El límite de detección para la medición directa de PMQ en orina sintética está en el rango nanomolar. Además, este método ha demostrado un gran potencial para la cuantificación de PMQ a partir de muestras de suero humano a concentraciones clínicamente relevantes. En este protocolo, describiremos los detalles técnicos relativos a las síntesis y caracterización de los productos azo de color, la preparación del reactivo y los procedimientos para la determinación de PMQ.

PMQ es uno de los fármacos antipalúdicos más importantes, funciona no sólo como un esquizontocida tisular para prevenir la recaída sino también como un gametocitocidio para interrumpir la transmisión de la enfermedad^1,2,3,4. La hemólisis intravascular es uno de los efectos secundarios preocupantes de La PMQ, que se vuelve extremadamente grave en aquellos deficientes en G6PD. Se sabe que el trastorno genético G6PD se distribuye en todo el mundo con una frecuencia genética entre el 3 y el 30% en las zonas endémicas de la malaria. La gravedad de la debilidad de PMQ depende del grado de deficiencia de G6PD, así como de la dosis y de la duración de la exposición a PMQ^5,6. Para reducir el riesgo, la OMS ha recomendado una dosis única baja (0,25 mg de base/kg) de PMQ para el tratamiento del paludismo. Sin embargo, esto todavía se desafia por las variaciones en la sensibilidad a los medicamentos del paciente^5,7. El control de la dosis es necesario para evaluar la farmacocinética después de la administración de PMQ, lo que puede afectar el ajuste de dosis para un tratamiento exitoso con toxicidad limitada.

La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) es la técnica más utilizada para la determinación clínica de PMQ. Endoh et al. informaron de un sistema HPLC con un detector UV para la cuantificación de PMQ sérica utilizando una columna de gel de polímero C-18⁸. En su sistema, las proteínas séricas se precipitaron primero con acetonitrilo, y luego el PMQ en el sobrenadante se separó para HPLC. La curva de calibración fue lineal en el rango de concentración de 0,01-1,0 g/mL⁸. Otro método basado en un HPLC de fase inversa con detección UV a 254 nm se ha informado para la cuantificación de PMQ y sus principales metabolitos⁹. La curva de calibración para PMQ era lineal en el rango entre 0,025-100 g/ml. Se utilizó una extracción adicional líquido-líquido con hexano mezclado y acetato de etilo como fase orgánica para la separación de PMQ con una recuperación porcentual alcanzada al 89%^9. Más recientemente, Miranda y otros desarrollaron un método UPLC con detección UV a 260 nm para el análisis de PMQ en formulaciones de comprimidos con un límite de detección a 3 g/mL¹⁰.

Aunque los métodos HPLC exhiben una sensibilidad prometedora en la determinación de fármacos y la sensibilidad puede mejorarse aún más si el HPLC está equipado con un espectrómetro de masas, todavía hay algunas desventajas. Las mediciones directas de fármacos en fluidos biológicos suelen ser inaccesibles por HPLC, ya que muchas biomoléculas pueden influir en gran medida en el análisis. Se requieren extracciones adicionales para eliminar moléculas endógenas antes del análisis de HPLC^11,12. Además, la detección de PMQ por un detector HPLC-UV se realiza típicamente en su longitud de onda de absorción máxima (260 nm);; sin embargo, hay muchas moléculas endógenas en fluidos biológicos con una fuerte absorbancia a 260 nm (por ejemplo, aminoácidos, vitaminas, ácidos nucleicos y pigmentos urocromos), interfiriendo así con la detección UV PMQ. Es necesario desarrollar métodos simples y rentables para la determinación de PMQ con una sensibilidad y selectividad razonables.

La reacción griess fue presentada por primera vez en 1879 como una prueba colorimétrica para la detección de nitrito^13,14,15,16. Recientemente, esta reacción ha sido ampliamente explorada para detectar no sólo nitrito, sino también otras moléculas biológicamente relevantes^17,18,19,20. Hemos informado previamente del primer estudio sistemático de una reacción inesperada de Griess con PMQ(Figura 1). En este sistema, PMQ es capaz de formar azos de color cuando se combina con anilinas sustituidas en presencia de iones de nitrito en condiciones ácidas. Hemos encontrado además que el color de los azos variaba de amarillo a azul al aumentar el efecto de donación de electrones del sustituito en anilinas²¹. Se ha desarrollado un método colorimétrico basado en absorción UV para la cuantificación de PMQ a través de la reacción optimizada entre 4-metoxianilina y PMQ. Este método ha demostrado un gran potencial para la detección sensible y selectiva de PMQ en fluidos biorelevantes. Aquí, nuestro objetivo es describir los procedimientos detallados para la determinación de PMQ basados en esta estrategia colorimétrica.

1. Síntesis de Azos de colores

1. En un matraz inferior redondo de 25 ml (RBF), disolver anilina (0,1 mmol) y bisfosfato de primaquina (45,5 mg, 0,1 mmol) en 10 ml de solución de H₃PO₄ (5% v/v). Coloque el RBF en un baño de hielo, agregue una barra de agitación con el tamaño adecuado en la solución y coloque el RBF en una placa de agitación.
   NOTA: Para la síntesis de azo 3g (Figura 2), utilice 0,2 mmol de bisfosfato de primaquina.
2. Disolver NaNO₂ (6,9 mg, 0,1 mmol) en 1 ml de agua enfriada y luego añadir en la mezcla de reacción en forma de gota. Retire el baño de hielo y mantenga la mezcla de reacción agitada a temperatura ambiente.
3. Supervise la reacción con una placa de cromatografía de capa fina (TLC) recubierta de gel de sílice. Utilice una mezcla de diclorometano (DCM)/metanol (MeOH) (vol/vol a 5:1) como eluyente para TLC. El producto azo exhibe manchas de colores en la placa TLC, que es fácil de distinguir por los ojos desnudos. Detenga la reacción cuando las manchas PMQ desaparezcan en TLC.
4. Ajuste la mezcla de reacción a pH >10 por NaOH (2 M) en un baño de hielo. Utilice un embudo de separación de 50 ml para extraer la mezcla 3 veces con 20 ml de acetato de etilo para cada uno, combinar y concentrar la fase orgánica al vacío utilizando un evaporador rotatorio.
   NOTA: Antes de la extracción, ajuste el valor de pH de las soluciones de reacción por encima de 10. Esto puede mantener la amina primaria como su forma no ionizada, facilitando así la extracción.
5. Purificar los residuos mediante cromatografía flash con gel de sílice de fase inversa bajo presión normal, utilizando MeOH/H₂O como eluyente. Secar la solución del producto a través de la liofilización para dar los productos de azo deseados.
   NOTA: La misma reacción también se puede realizar en soluciones de HCl diluidas (0,2 M).

2. Mediciones UV-Vis y Cálculo Teórico

1. Disolver el azo puro (50 oM) en agua destilada o en una solución de 5% H₃PO₄ (pH 1.1), respectivamente. Registre espectros de absorción UV-vis (250-700 nm) en un espectrofotómetro a temperatura ambiente (25 oC). Exporte los datos como archivos .xls/.xlsx para su posterior análisis.
2. Realice todos los cálculos teóricos para los productos PMQ y azo utilizando el programa Gaussian 16. Utilice la teoría funcional de densidad dependiente del tiempo (TD-DFT) con un conjunto de base 6-31G. Incluir efectos solventes por formalismo del modelo continuo polarizado (PCM) utilizando agua.
   1. Utilice software (por ejemplo, Chemdraw Office) para dibujar las estructuras y luego guardar la estructura como un archivo de entrada gaussiano (.gif).
   2. Abra el archivo gif con Vista Gauss y haga clic en el botón Calcular. Seleccione Configuración de cálculo gaussiano, Opt+Freqy estado de tierra-DFT-B3LYP-6-31G; a continuación, haga clic en Enviar. La optimización de geometría generará un archivo .log.
   3. Siguiendo el procedimiento anterior, utilice Gauss View para abrir este archivo de registro. Haga clic en Calcular configuración de cálculo gaussiano y seleccione energía y TD-SCF-DFT-B3LYP-6-31G-Singlet solamente. A continuación, Enviar. El cálculo de energía generará otro archivo de registro y un archivo de cubo.
   4. Utilice la Vista Gauss para abrir el archivo de registro desde el cálculo de energía. Haga clic en Resultados-UV/Vis para ver la absorción prevista.
   5. Utilice la Vista Gauss para abrir el archivo de cubo. Haga clic en Resultados y seleccione acciones de superficie y contornos y nueva superficie para ver las órbitas.
3. Compare los resultados de la medición experimental y el cálculo gaussiano. Calcule el error de porcentaje entre los valores calculados y medidos, de acuerdo con la siguiente ecuación.
                 Error ? (W_max cal.-W_maxexper.) / W_maxexper. | • 100%
   donde W_max cal. representa la longitud de onda de absorción máxima del cálculo teórico y W_max exper. representa la longitud de onda del resultado experimental.

3. Determinación de PMQ

1. Medición PMQ utilizando una placa de 96 pocillos (Figura5)
   1. Disolver 4-metoxianilina en 0.2 M HCl para una solución de anilina de 200 mM, R1. Disolver el nitrito sódico en agua destilada para obtener una solución de 5 mM, R2. Mantener todas las soluciones en la nevera a 4 oC antes de su uso.
   2. Agregue 100 l de R1 en una placa de 96 pocillos y agregue 50 s de PMQ que contenga la muestra en la placa para mezclar con R1. A continuación, agregue 50 s l de R2 en la placa. Mezcle las soluciones mediante pipeteo repetido.
   3. Mantenga la placa a temperatura ambiente durante 15 minutos y, a continuación, registre la absorbancia UV-vis a 504 nm. Repita 3x para cada prueba.  El producto azo es estable con exposición a la luz de la habitación; no es necesario mantener la placa bajo la oscuridad.
   4. Exporte los datos como archivos .xls/.xlsx para su posterior análisis.
2. Curva de calibración para la medición directa de PMQ en una muestra de orina
   1. Preparar soluciones PMQ utilizando orina sintética con concentraciones de PMQ a 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 M, respectivamente.
   2. Agregue 100 l de R1 en una placa de 96 pocillos y agregue 50 ml de solución de orina PMQ para mezclar con R1. A continuación, añadir 50 sl de R2 a la mezcla anterior. Mezcle las soluciones mediante pipeteo repetido. Mantenga la placa a temperatura ambiente durante 15 minutos y, a continuación, registre la absorbancia UV-vis a 504 nm.
   3. Genere una curva de calibración basada en las concentraciones de absorbancia I₅₀₄ y PMQ. Utilice los valores de los pozos sin PMQ como espacio en blanco y reste los valores en blanco de todas las pruebas antes del procesamiento de datos.
   4. Realice un ajuste lineal para generar las ecuaciones lineales como Y - aX + b, donde Y es la intensidad de absorción en 504 nm, X es la concentración de PMQ, a es la pendiente, y b es la intercepción y de la línea lineal.
3. Curva de calibración para la medición directa de PMQ en una muestra de suero humano
   1. Preparar soluciones PMQ utilizando suero humano con concentraciones de PMQ a 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, M respectivamente.
   2. Agregue 100 l de R1 en una placa de 96 pocillos y agregue 50 ml de solución sérica PMQ para mezclar con R1. Agregue 50 s l de R2 a la mezcla anterior y mezcle las soluciones mediante pipeteo repetido. Mantenga la placa a temperatura ambiente durante 15 minutos y luego registre la absorbancia UV-vis a 504 nm. Exporte los datos como archivo .xls/.xlsx para su posterior análisis.
   3. Genere una curva de calibración basada en las concentraciones de absorbancia I₅₀₄ y PMQ. Utilice los valores de los pozos sin PMQ como espacio en blanco y reste los valores en blanco de todas las pruebas antes del procesamiento de datos.
   4. Realice un ajuste lineal para generar las ecuaciones lineales como Y - aX + b, donde Y es la intensidad de absorción en 504 nm, X es la concentración de PMQ, a es la pendiente, y b es la intercepción y de la línea lineal.
4. Extracción de PMQ del suero
   1. Agregue una cierta cantidad de PMQ en el suero humano para simular el suero que contiene PMQ. Para la extracción de PMQ, añadir 6 ml de mezcla de acetato de etilo/hexano (7:1 v/v) en 2 ml de suero que contiene PMQ en un tubo centrífugo de 15 ml.
   2. Añadir al sistema de extracción 100 ml de solución de hidróxido de sodio (2 M). Agitar violentamente el tubo usando un mezclador de vórtice durante 30 s. Recoger la capa orgánica y concentrarla usando un evaporador rotatorio al vacío.
   3. Vuelva a disolver el residuo con 200 ml de agua destilada y elimine los componentes lipídicos insolubles mediante filtración a través de una membrana en forma de disco con un tamaño de poro de 220 nm. Utilice la solución final para la prueba.
5. Determinar PMQ a partir del suero con extracción
   1. Siga los pasos 3.2 o 3.3 para generar la curva de calibración para PMQ en agua destilada. Extraiga PMQ de los sueros que contienen PMQ según el paso 3.4.
   2. Agregue 100 s de R1 y 50 l de solución PMQ en una placa de 96 pocillos. Agregue 50 sl de R2 a la mezcla anterior y mezcle las soluciones mediante pipeteo repetido.
   3. Mantenga la placa a temperatura ambiente durante 15 minutos y registre la absorbancia UV-vis a 504 nm. Utilice los pozos con R1 y R2 pero sin PMQ como controles. Exporte los datos como archivos .xls/.xlsx para su posterior análisis.
   4. Restar los valores de control de los valores de absorbancia I₅₀₄ para cada prueba y, a continuación, utilice el resultado para los cálculos de concentración de acuerdo con la ecuación de revestimiento de la curva de calibración.
      NOTA: El límite de detección (LOD) para PMQ en todos los casos se puede calcular según un método estándar^22. El cálculo se basó en la función de calibración: LOD a 3,3 o SD/b, donde SD es la desviación estándar del espacio en blanco y b es la pendiente de la línea de regresión

Para optimizar las condiciones de reacción(Figura 2), se utilizaron varias anilinas para acoplarse con PMQ a través de la reacción Griess. Hemos logrado una serie de azos con diferentes colores. Se ha encontrado que las anilinas con un sustituito de donación de electrones pueden causar un cambio rojo en el espectro de absorción UV-vis. Los cálculos teóricos se llevaron a cabo a través de la teoría funcional de la densidad dependiente del tiempo (TD-DFT). Como se presenta en la Figura 2A, el resultado del cálculo fue en buen acuerdo con las mediciones ópticas con un error medio del 3,1%. 4-metoxianilina se utilizó entonces para llevar a cabo la reacción de detección PMQ debido a su buen rendimiento en la velocidad de reacción, solubilidad del producto, y la estabilidad²¹. Además, el producto azo de 4-metoxianilina es de color rojo, que es fácil de distinguir con ojos desnudos. Por lo tanto, esta reacción ofrece potencial para la detección de PMQ a vista desnuda (Figura 3).

La Figura 4A muestra el efecto de pH en el espectro de absorción UV-vis del producto azo 3d. I₅₀₄ no cambia al aumentar el pH de 1.0 a 6.0. I₅₀₄ bajo pH 7.0 exhibe una ligera disminución, mientras que un pH básico (8.0 y 9.0) afecta en gran medida la absorción. La Figura 4B muestra los efectos del pH de las soluciones PMQ en la reacción de Griess. PMQ (50 M) en el búfer de PBS con varios pHs (4.0, 5.0 ,6.0, 7.0, 8.0, 9.0) se mezclaron individualmente con el reactivo de prueba como se describe en la sección 3.1. I₅₀₄ se midió después de 15 minutos a temperatura ambiente. Como se indica, los pH básicos (8.0, 9.0) de las soluciones de PMQ pueden influir en la reacción. La Figura 5 muestra el procedimiento general para realizar la reacción Griess para la detección de PMQ. Como se describe en la sección de protocolo, se requieren cuatro pasos para obtener los datos de absorción I₅₀₄ para el análisis. Las figuras 6A y 6B muestran las curvas de calibración para la detección directa de PMQ a partir de muestras de orina y suero, respectivamente, sin pretratamiento de muestras. Se encontró una excelente relación lineal (R² a 0,998) cuando PMQ en orina sintética oscila entre 0 y 200 m. En términos de la muestra sérica, se encontró una relación lineal en la concentración que oscilaentre entre 10 y 200 m.

La Figura 7A muestra el procedimiento para extraer PMQ del suero. Los residuos fueron redisueltos en agua destilada después de la extracción y concentración, y luego filtrados. Para simular un suero real que contiene PMQ, se añadió PMQ en suero humano con concentraciones finales a 0, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0 m. Utilizando los pasos 3.4 y 3.5, se encontró que las concentraciones de PMQ en sueros eran 0.02, 0.14, 0.44, 0.90 y 1.78 M, respectivamente(Figura 7C). Según el resultado, se encontró que el porcentaje de recuperación de PMQ era de alrededor del 90% cuando PMQ era superior a 0,5 m en suero, lo que era comparable a los informes anteriores⁹.

Figura 1: Esquema de la reacción del Griess en PMQ. (A) Una reacción clásica de Griess para el análisis de nitrito. (B) La reacción de la sonrisa en el método de detección PMQ propuesto. Esta cifra se ha modificado con el permiso de la obra anterior²¹. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Propiedades fotofísicas de los azos sintéticos. (A) medición UV-vis y cálculo teórico de la absorción máxima de azos generados a partir de diferentes anilinas. Los números fuera de los soportes representan para la medición de máxima absorbancia en condiciones de pH h₂O destiladas cerca de condiciones de pH neutro; los números entre corchetes se refieren a la medición en la solución 5% H₃PO₄ (pH a 1,1). Á_abs/nm exper. representa los datos del experimento y_abs/calc. representa los datos de cálculo teóricos. E_exc es la energía de excitación (eV), y f es la fuerza del oscilador. (B) Imágenes fotográficas de PMQ y de los productos azocon diferentes sustituidores, 50 m en solución de ácido fosfórico al 5%. (C) espectros UV-vis de los productos sintéticos. Los valores se normalizaron a un rango entre 0 y 1. Esta cifra se ha modificado con el permiso de la obra anterior²¹. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Determinación colorimétrica de PMQ. (A) Supervisión de los cambios de absorbancia a un máximo de I₅₀₄ de forma dependiente del tiempo. La reacción se realizó utilizando 4-metoxianilina, y PMQ se utilizó a 100 m; (B) Cambios de color de la reacción con diferentes concentraciones de PMQ: 400 l de solución de 4-metoxianilina (200 mM en 0,2 M HCl) y 200 ml de nitrito sódico en agua (5 mM), con 200 ml de solución de PMQ de diferentes concentraciones (0, 1, 2, 5 , 10, 20, 50, 100 m). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: efecto de pH en ladetección de PMQ. (A) efectos de pH en la absorción UV-vis del producto azoá 3d (50 m); (B) PMQ (50 m) en el búfer de PBS con diferentes pHs (4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0) se utilizaron para realizar la reacción como se describe en el paso 3.1. Quince minutos más tarde, se midió la absorbancia a 504 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Determinación dePMQ a través de una reacción Griess en un sistema basado en placas de 96 pocillos. R1 se refiere a 200 mM 4-metoxianilina solución en 0.2 M HCl; R2 se refiere a 5 mM de nitrito sódico en agua destilada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Curvas de calibración para ladeterminación de PMQ a partir de (A) orina sintética y (B) muestras de suero humano. La concentración de PMQ oscila entre 0 y 200 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Determinación dePMQ a partir de muestras de suero. (A) Ilustración esquemática de la extracción de PMQ de muestras de suero para el análisis cuantitativo. (B) La relación lineal encontrada entre I₅₀₄ y la concentración de PMQ dentro del rango de 0 a 100 m. (C) PMQ en suero se cuantificaron mediante el método basado en reacciones Griess en comparación con la cantidad exacta añadida al suero. Esta cifra se ha modificado con el permiso de la obra anterior²¹. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1. Cálculo teórico del Registro D y el porcentaje de distribución de agua de PMQ y CPMQ.

Hemos descrito un método colorimétrico para la cuantificación conveniente de PMQ. Es potencialmente el método actual más simple y rentable. Lo que es más importante, este método ofrece la medición de PMQ basada en ojos desnudos sin utilizar ningún equipo.

La reacción Griess optimizada para la detección de PMQ puede generar un azo de color rojo con una absorción máxima a 504 nm. La influencia potencial de la absorción UV-vis de biomoléculas endógenas es limitada, lo que hace que el método sea prometedor para la medición directa de PMQ en fluidos biológicos. Como se indica en el resultado, se encontró una excelente relación lineal (R² a 0,998) para la detección de PMQ de orina en el rango de concentración de 0-200 m(Figura 6A). Se encontró que el límite de detección (LOD) para PMQ era de 0,63 m. Este método también ha demostrado grandes potenciales para la medición directa de PMQ en suero humano. Se encontró una excelente relación lineal en la concentración que oscila entre 10 y 200 m para la detección de PMQ sérica(Figura 6B). Podemos mejorar aún más la sensibilidad mediante el tratamiento previo de la muestra sérica a través de la extracción y la concentración. Como muestra la Figura 7 con un proceso de extracción simple, este método puede cuantificar el suero PMQ en rangos clínicamente relevantes. Basado en el mecanismo de reacción, el principal metabolito de carboxilo de PMQ (CPMQ) puede potencialmente formar un producto azoico con propiedades similares UV-Vis. Sin embargo, la extracción líquido-líquido en condiciones básicas de pH puede potencialmente minimizar la interferencia de CPMQ. El Cuadro 1 muestra el registro Calculado D y la distribución del agua de PMQ y CPMQ. Como se muestra, a pH >10, menos del 6,33% de PMQ se encuentra en la fase de agua, mientras que más del 98,54% de CPMQ estará en la fase de agua. Por lo tanto, teóricamente, más del 93,7% de PMQ y menos del 1,56% de CPMQ podrían extraerse para su prueba. Se puede concluir que la interferencia del metabolito principal CPMQ es limitada.

El procedimiento para la detección de PMQ es muy fácil de manejar. Tomando como ejemplo el sistema basado en placas de 96 pocillos, todo el procedimiento consta de cuatro pasos: 1) añadir 100 l de solución de 4-metoxianilina (200 mM en 0,2 M HCl) R1 en una placa de 96 pocillos; 2) añadir 50 l de muestra desconocida de concentración de PMQ para mezclar con R1; 3) añadir 50 l de R2 (solución de nitrito sódico de 5 mM) para realizar la reacción a temperatura ambiente; y 4) registrar la absorción UV-vis a 504 nm utilizando un espectrómetro. La concentración de PMQ a partir de una muestra desconocida se puede calcular en función de la intensidad de absorción I₅₀₄ y la ecuación lineal de la curva de calibración. Todo el procedimiento se realiza a temperatura ambiente sin necesidad de incubación. Un ambiente oscuro no es necesario para todo el procedimiento, ya que el producto de color no es sensible a la luz de la habitación.

Cabe señalar que el tiempo para que la solución de reacción alcance su Saturado I₅₀₄ depende de la temperatura. Como se muestra en la Figura 3, se requirieron al menos 12 min a temperatura ambiente (25 oC). El tiempo de reacción sería más largo si se realiza la reacción a temperaturas inferiores a 25 oC. La condición básica del pH de las soluciones PMQ puede afectar potencialmente a la absorbancia I₅₀₄. Para solucionar este problema, ajuste el pH de la solución PMQ para que sea inferior a 7.0. De lo contrario, se necesita una nueva curva de calibración para la solución con pH sobre 7.0. Además, los nitritos intrínsecos en las muestras analizadas pueden influir en la detección. Sin embargo, esto sólo puede ocurrir cuando la concentración de nitritos intrínsecos es extremadamente alta ya que se utilizó una alta concentración de nitrito (5 mM) en una prueba estándar.

Los autores no tienen nada que declarar.

Los autores reconocen la beca Start-Up de la Universidad de Medicina China de Guangzhou y el proyecto de formación en investigación científica juvenil de GZUCM (2019QNPY06). También reconocemos el Centro de Investigación Médica Lingnan de la Universidad de Medicina China de Guangzhou por el apoyo en instalaciones.