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Este artículo describe métodos para la síntesis y marcaje fluorescente de nanopartículas (NPs). Los NPs se aplicaron en los experimentos de pulso-caza para etiquetar el sistema de endo-lisosomal de las células eucariotas. La manipulación del sistema de endo-lisosomal por las actividades del patógeno intracelular Salmonella enterica fueron seguidos por imágenes de células vivas y cuantificada.
Nanopartículas fluorescentes (PN) con química deseable, propiedades ópticas y mecánicas son herramientas prometedoras para etiquetar orgánulos intracelulares. Aquí, presentamos un método que utiliza oro-BSA-rodamina PN para etiquetar el sistema endo-lisosomal de las células eucariotas y supervisar la manipulación de las vías celulares de acogida por el patógeno intracelular Salmonella enterica. Los parlamentos nacionales se internalizan fácilmente por las células HeLa y localizados en endosomas tardíos / lisosomas. Infección por Salmonella indujo reordenamiento de las vesículas y la acumulación de los PN en estructuras de membrana Salmonella inducidos. Desplegamos el paquete de software Imaris para análisis cuantitativos de imágenes de microscopía confocal. El número de objetos y su distribución de tamaño en las células no infectadas eran distintos de los de las células infectadas por Salmonella, lo que indica extremadamente remodelación del sistema de endo-lisosomal por WT Salmonella.
Nanopartículas fluorescentes (PN), incluidos los PN de metal, puntos cuánticos, polímeros PN, PN sílice, puntos de carbono, etc., han atraído una atención considerable durante las últimas décadas 1,2. En comparación con los tintes orgánicos tradicionales, NPs fluorescentes muestran propiedades químicas deseables, ópticas y mecánicas, tales como fuerte intensidad de la señal, la resistencia a photobleaching y alta biocompatibilidad 3,4. Estas ventajas que el método de elección para la detección intracelular y imágenes de células vivas hacen. Además, una variedad de NPs electrón-densos son visibles por microscopía electrónica (EM), facilitando su uso para el análisis microscópico correlacionada, que permite la combinación de células vivas de seguimiento con microscopía de luz (LM) y mayor resolución a nivel ultraestructural con EM 5. Por ejemplo, los NPs de oro han sido mucho tiempo utilizado eficientemente como biosensores en células sensibles para el diagnóstico de vida, así como en el campo de la inmuno-etiquetado 6. S recientesos estudios indican que NP de oro con diferente tamaño y forma pueden ser fácilmente captación por una gran variedad de líneas celulares y transportar de forma rutinaria a través de la vía endosomal, por lo tanto tienen un gran potencial de ser aplicado para el seguimiento de la vesícula de transporte intracelular y el sistema de etiquetado endo-7,8 lisosomal .
Patógenos microbianos, como Salmonella enterica, Shigella flexneri y Listeria monocytogenes, se han desarrollado diferentes mecanismos para invadir las células huésped no fagocíticas 9. Después de ser interiorizado, los agentes patógenos, ya sean localizadas en el citosol o secuestradas en compartimentos de membrana, interactuando con su entorno de acogida y modulan estos para favorecer su propia supervivencia 10. Por ejemplo, Salmonella enterica reside y se replica dentro de un compartimiento intracelular phagosomal denomina -Con vacuola Salmonella (SCV) después de la infección 11. El SCV maduracióntráficos hacia el aparato de Golgi, sufriendo continuas interacciones con la vía endocítica, e induce la formación de estructuras tubulares extensos, tales como Salmonella filamentos inducidos (SIF), clasificación túbulos nexina, Salmonella portadoras secretora inducida por proteínas de membrana (3) SCAMP3 túbulos, etc. . 12-14. Estudiando cómo estos patógenos bacterianos manipulan las vías de la célula huésped es esencial para la comprensión de las enfermedades infecciosas.
Aquí, NPs de oro-BSA-rodamina fueron utilizados como trazadores de fluidos para etiquetar el sistema de endo-lisosomal celular del huésped, y el patógeno gastrointestinal Salmonella enterica serovar Typhimurium humana (Salmonella) se utilizó como un modelo de bacteria para estudiar las interacciones del patógeno con la acoger vía endocítica. PN oro-BSA-rodamina intracelular en las células no infectadas y las células infectadas con WT Salmonella o cepas mutantes se obtuvieron imágenes de un microscopio de escaneo láser confocal (CLSM).Entonces software Imaris se utilizó para cuantificar la distribución de los NPs, lo que indica que la infección por Salmonella inducida reordenamiento extremo de los endosomas / lisosomas. Después de la descripción de este método, los experimentos análogos pueden ser diseñados para rastrear el destino a largo plazo de los NPs internalizadas y para investigar la influencia de diferentes sustancias exógenas o factores endógenos en la vía endocítica de las células eucariotas.
1. Síntesis de 10 nm nanopartículas de oro (Gold PN) 15
2. El recubrimiento de oro PN con BSA y Etiquetado con Rodamina N-hidroxisuccinimidilo Ester (NHS) 16
3. Cultura de células HeLa
4. Cultura de bacterias
5. La infección de células HeLa porSalmonella y Gold-BSA-Rodamina PN pulso Chase-etiquetado (véase la figura 1 para el esquema)
6. Imaging
7. Análisis de Imágenes
NP de oro se han generado a través de un método bien establecido a través de la reducción del ácido cloroaúrico por el citrato y ácido tánico. Como se muestra en la Figura 2A, los NPs de oro sintetizados eran casi de forma esférica con un tamaño de aproximadamente 10 nm. BSA-recubrimiento y rodamina-etiquetado no influyeron en su morfología o tamaño (Figura 2B).
Se ha informado de que NPs de oro pueden ser fácilmente absorbidos por las diversas células de mamíferos y terminaron en los sistemas endocítica 7. De acuerdo con trabajos previos, se observaron señales de fluorescencia de color rojo brillante en las células HeLa después de la incubación de 1 hora con NPs de oro-BSA-rodamina (Figura 3, WT 5 hr pi), lo que indica la internalización eficaz de los NPs por las células. La mayoría de las señales rojas fueron encontrados colocalized con señales verdes, lo que demuestra que los PN fueron confinados en endosomas o lisosomas finales. Sin embargo, a diferencia de la distribución uniforme de los PN en endosomas tardíos / lisosomasen las células no infectadas (Figura 3, mock), sus ubicaciones se reordenan en gran medida en las células infectadas con WT Salmonella. En la fase temprana de la infección (Figura 3, WT 5 h pi), Salmonella se replica dentro del SCV y SIF someterse extensión rápida o movimiento de contracción. En este punto de tiempo, una fracción de los NPs se encontró en SCV y SIF, mientras que otra fracción todavía se encuentra en endosomas tardíos / lisosomas libres. A las 8 h pi (Figura 3, WT 8 pi h), se formó una red estabilizada de SIF, y se encontraron la mayoría de los PN acumulada dentro de las estructuras tubulares, mientras que sólo una porción muy pequeña quedó situado en endosomas tardíos / lisosomas libres. Las cepas mutantes Δ ssaV y Δ SIFA mostraron comportamientos distintos. Como se muestra en la Figura 3 (Δ ssaV), a las 8 hr pi, Δ ssaV estaba confinado dentro de SCV, mientras que no se formaron estructuras SIF. Se observaron algunas PN rodea Salmónella dentro del SCV, pero la mayoría de los parlamentos nacionales aún estaban ubicados en endosomas tardíos / lisosomas libres. Para la cepa Δ SIFA (Figura 3, Δ SIFA), escape de Salmonella en el citoplasma se produjo, y no se observó asociación entre la PN y bacterias.
En nuestro anterior estudio se encontró que la pantalla SIF propiedades altamente dinámicos en la fase temprana de la infección (3-5 h pi), pero estabilizado en el último período (> 8 h pi) 12. Por lo tanto, nos preguntamos si la salmonela en las fases tempranas y tardías de la infección tiene capacidad comparable a reorganizar la distribución de los PN intracelulares. Como se muestra en la Figura 4, NP de oro se incubaron con células HeLa O / N antes de la infección, o en diferentes puntos de tiempo después de la infección (1-7 h pi) durante 1 hora, en todos los casos la mayoría de los PN internalizados se observaron acumulado en SCV o SIF.
Observ microscópicaciones reveló que la infección por Salmonella en los resultados de reordenamiento masiva del sistema endo-lisosomal de las células huésped. Como paso siguiente, se utilizó el paquete de software Imaris para analizar fenotipos de células huésped de Salmonella inducida de una manera cuantitativa. Utilizando la imagen de una célula HeLa infectadas a las 8 hr pi como un ejemplo, una instrucción de paso a paso para el análisis cuantitativo se representa en la Figura 5. A través de un umbral de intensidad de 15 y un "número de voxels> 10 'de filtro, 3D objetos fueron extraídos del archivo de imagen original. Se suponía que los objetos a ser estructuras intracelulares en el que el oro-BSA-rodamina NPs encuentra con. En este ejemplo, los objetos 67 se extrajeron en total, con un área resumió como 1,974.64 m 2. El objeto más grande, que colocalized con la red de SIF, tiene una superficie de 1,836.23 m 2, mientras que los otros son más pequeñas que 50 m 2. Para la comparación, un ejemplo que muestra el quantresultado del análisis itative de una célula no infectada fue dado. Aquí, los objetos 431 se extrajeron en total, dentro de la cual el valor promedio de la zona es 5 m 2 y el objeto más grande tiene una superficie de 34 m 2. El área sumada de los objetos es 2252 m 2, que es comparable a la célula infectada en la Figura 4 (1,975 m 2). Sin embargo, el número de objetos es mucho más grande que la otra (431 y 67 objetos, respectivamente), lo que indica gran medida fusión de vesículas con las estructuras tubulares inducidos por Salmonella.
Figura 1. Esquema para la preparación de células HeLa por imágenes de células vivas. Células HeLa se sembraron en portaobjetos de cámara, infectadas de forma simulada, o infectados con diferentes cepas de Salmonella de 30 min, se lavó 3 veces con PBS, a continuación, incubat ed con medio que contiene 100 mg / ml de gentamicina durante 1 hr. Posteriormente, el medio fue reemplazado por imágenes de medio que contiene 10 nm de oro NPs-BSA-rodamina (OD 520 = 0,1) y 10 mg / ml de gentamicina, se incubaron durante 1 hr, y luego perseguido por medio de NP-libre para el resto del experimento . Imágenes de células vivas se realizó en diferentes momentos después de la infección (pi). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Imágenes de TEM de coloidales PN oro antes (a) y después de etiquetado (b). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Accesibilidad del sistema endo-lisosomal en diversas fases de la infección por Salmonella. HeLalas células se pulsaron con 10 nm de oro NPs-BSA-rodamina (OD 520 = 0,1) O / N infección previa, o durante 1 hora a varios puntos de tiempo pi como se indica. Imágenes de células vivas se realizó a 8-9 pi hr proyecciones de intensidad máxima de CLSM Z-pilas se muestran. Las barras de escala, 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Paso a paso las instrucciones para el análisis cuantitativo por Imaris usando una imagen de una célula HeLa infectadas a las 8 h pi como ejemplo. (A) Abra los datos haciendo clic en "Abrir" y elegir el archivo. (B) En la barra de herramientas de objetos de la vista Surpass agregar un nuevo elemento de superficie. (C) Para analizar un retorno de la inversión, a continuación, seleccione un segmento de retorno de la inversión. (D) Introduzca los valores en las direcciones x correspondiente, y-, y z campos o (E) haga clic directamente sobre las flechas en el rectángulo de vista previa para modificar el tamaño y la posición de la ROI. En este ejemplo, un ROI no se necesita y la imagen entera se analizó. (F) Como canal de origen, seleccione el canal 3 (señal de Oro-BSA-Rodamina PN). Marque la opción suave para establecer la suavidad de la superficie resultante. Defina un valor manualmente o acepte el valor generado automáticamente. Aquí, se utilizó 0,1 m. Para 'Umbral' seleccione la opción 'Intensidad absoluta'. (G) Para el ajuste del umbral seleccionar la opción manual y establecer un valor (en este ejemplo 15 se utilizó). En el área de visualización de una superficie umbral vista previa se muestra en gris. (H) En la pestaña 'Clasificar Superficies' la superficie resultante se puede filtrar por diversos criterios. Un filtro por defecto es 'número de voxels> 10. Lafiltro se puede ajustar por introducir un nuevo valor y otros filtros puede agregarse. En este ejemplo, hemos mantenido el 'número de voxels> 10' filtro. (I) para completar la creación de superficies clic en "Finalizar". En la lista de objetos ahora desmarca la casilla para el volumen del elemento y la nueva superficie creada se muestra en el área de visualización en rojo. (J) En la vista Superar el color de los temas varían de púrpura a rojo en función de su área. (K) La tabla de números de las parcelas de la zona 'muestra la información estadística. Las estadísticas de exportación a un archivo de Excel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. resultado del análisis cuantitativo de una célula no infectada. ( A) Imagen de microscopia confocal. (B) La nueva superficie creada. (C) La nueva superficie en la vista de superar. (D) La mesa 'Números Parcela' muestra la información estadística. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El sistema de endo-lisosomal de las células de mamíferos controles importantes procesos fisiológicos, incluyendo la absorción de nutrientes, la transducción de señales mediada por la hormona, la vigilancia inmune, y la presentación de antígeno 17. Hasta ahora, una variedad de marcadores se han utilizado para el etiquetado de los estudios de la vía endocítica y seguimiento. Por ejemplo, las sondas son sondas LysoTracker acidotropic fluorescentes desarrollados por Molecular Probes (Life Technologies, EE.UU.) para el etiquetado de lisosoma, que pueden acumularse selectivamente en los compartimentos celulares con bajo pH interno y eficaz etiquetar las células vivas a concentraciones nanomolares 18. Sin embargo, a largo tiempo de incubación de sondas LysoTracker con células puede inducir un aumento del pH lisosomal y conducir a posibles cambios fisiológicos de los lisosomas 19. Algunas biomoléculas grandes, tales como dextranos marcados con fluoróforo, también se utilizan con frecuencia para endosoma / etiquetado lisosomas. Sin embargo, bajo fotoestabilidad, la vida corta de circulación, y pretención de suelo durante la fijación obstaculizar sus aplicaciones en imágenes de células vivas a largo plazo y el microscopio correlativa estudia 16,19. Aquí, NPs de oro-BSA-rodamina fueron utilizados como trazadores de fluidos para etiquetar el sistema de endo-lisosomal celular del huésped. Se observaron alta eficiencia de absorción y fuertes señales de fluorescencia intracelular. La colocalización casi completa de la PN con lisosomal LAMP1 glicoproteína, que está altamente enriquecido en la membrana de endosomas tardíos / lisosomas, verificó el etiquetado adecuado del sistema endo-lisosomal por los parlamentos nacionales. Combinando el uso de los PN fluorescentes con los otros marcadores como Lysotracker puede proporcionar información complementaria sobre la célula huésped tráfico vesicular y la maduración.
Vale la pena mencionar que la internalización celular de NPs es altamente dependiente de sus dimensiones físicas y componentes químicos. Hemos probado NPs de oro-BSA-rodamina con un tamaño de 5 nm, 10 nm, 15 nm y 30 nm, y la distribución intracelular similar ense observaron células HeLa laterales (resultados no mostrados). Utilizamos las células HeLa como conveniente línea de células para estudios de infección por Salmonella. Sin embargo, NPS-oro BSA-rodamina también pueden ser internalizados fácilmente por varias otras líneas celulares y células primarias son susceptibles. Por ejemplo, se observó Salmonella inducida por estructuras tubulares y etiquetado por NP en CHO, COS-7, CaCo2, o células 3T3, así como en las células RAW264.7 de interferón-γ-estimulado similares a macrófagos línea celular o macrófagos murinos primarios y células dendríticas. Sin embargo, cada línea celular se requiere ajuste de la infección y los protocolos de pulso / de persecución.
Se ha informado de que NPs de sílice colorante atrapado se pueden utilizar como un biocompatible, de larga vida, y muy fotoestable marcador lisosoma 19, y también comparado el comportamiento de los NPs de sílice dopado con rodamina tamaño variable (30 - 1000 nm). Etiquetado adecuado de los endosomas tardíos / lisosomas por PN de sílice en las células no infectadas y la acumulación de los PN en SSe observó CV y SIF en células de Salmonella infectado con. Sin embargo, debido a la formación de agregados de NPs o el gran tamaño de NPs de sílice individuales, la distribución de NPs junto con estructuras tubulares inducidos por Salmonella no fue uniforme (datos no mostrados).
Un rasgo característico de SCV, así como SIF es la presencia de glicoproteínas altamente abundantes lisosomales tales como LAMP1 12. Aquí, una línea celular HeLa que expresan establemente LAMP1-GFP se utilizó para la conveniencia de imágenes de células vivas del sistema de endo-lisosomal y las estructuras SCV y SIF. Cepas de Salmonella que expresan constitutivamente mejorado GFP se usaron en los experimentos de infección para indicar la ubicación de las bacterias . Debido al tamaño uniforme y forma de las bacterias intracelulares, la fluorescencia GFP bacteriana, en general, es fácilmente distinguible de la etiqueta GFP en las membranas de endo-lisosomal. Sin embargo, para futuros experimentos en los que la señal fluorescente de las bacterias y pr membranaoteins necesitan estar, otras proteínas de fusión fluorescentes precisamente diferenciar por ejemplo, mTurquoise, se recomiendan para ser integrado. Esto, sin embargo, resulta en rondas adicionales de iluminación y de adquisición de imagen, teniendo el riesgo de mayor foto-daño en los experimentos de células vivas.
Para descubrir genes y mecanismos esenciales para los patógenos bacterianos para manipular las vías de la célula huésped, numerosos mutantes necesitan ser creados y sus actuaciones deben compararse con cuidado. Por ejemplo, las cepas mutantes de Salmonella Δ ssaV y Δ SIFA están muy atenuados en la virulencia sistémica y la replicación intracelular 20,21. Ambas cepas Δ Δ ssaV y SIFA fallan para inducir SIF, y adicionalmente Δ SIFA Salmonella pierden la membrana SCV durante el curso de la infección 12. Comparando los fenotipos de WT y cepas mutantes es instrumental en la comprensión de la capacidad de Salmonella a remodel célula huésped tráfico vesicular. Basado en el examen microscópico, es obvio que WT Salmonella subvertir anfitrionas vías endocítica celulares en un grado mucho mayor en comparación con cepas mutantes Δ Δ ssaV y SIFA. Esta función podría permitir Salmonella intracelular para obtener más nutrientes para su supervivencia intracelular y la replicación.
Imágenes de microscopía confocal demuestran claramente la remodelación de host del sistema endo-lisosomal celular por bacterias intracelulares. Sin embargo, se requiere un análisis cuantitativo de las imágenes para la comparación precisa. En el método descrito aquí, software Imaris se utiliza para la extracción de objetos en 3D que tienen la intensidad de fluorescencia en el canal 3> 15 y el número de voxels> 10. Estos objetos se supone que las estructuras de membrana intracelulares que contienen oro-BSA-Rodamina NPs. El umbral de intensidad de fluorescencia y los filtros pueden ser definidos de acuerdo con la calidad de las imágenes, pero should debe mantenerse constante para comparar diferentes condiciones o cepas. Aquí se presentan ejemplos de una célula no infectada y una célula infectado con WT Salmonella a las 8 h pi, con 431 y 67 objetos extraídos, respectivamente. A pesar de la aparente diferencia, no es racional para comparar sólo el número de los objetos, ya que el tamaño de las células no son lo mismo. Una solución es para normalizar el número de los objetos a la zona sumada (en este ejemplo, 2252 m 2 y 1.975 m 2, respectivamente) o la suma de las intensidades de fluorescencia de los objetos dentro de las células. Alternativamente, también es posible realizar un seguimiento de una célula antes de la infección y en diferentes puntos de tiempo pi con el fin de comparar la distribución de NPs en diferentes etapas de la infección.
En conclusión, en este método se aplicaron NPs de oro-BSA-rodamina para etiquetar el sistema de endo-lisosomal de las células eucariotas. La manipulación del sistema de endo-lisosomal celular del huésped por un intracellular patógeno fue observada por CLSM de células en vivo y los resultados de análisis cuantitativo indicó reordenamientos extremas de endosomas tardíos / lisosomas por WT Salmonella. Salmonella se utilizó como un modelo patógeno en este estudio, pero el comportamiento intracelular de otros patógenos bacterianos, tales como Shigella flexneri y Listeria monocytogenes también podría ser investigados utilizando este enfoque. En principio, el oro-BSA-rodamina NPS podría ser internalizados por una gran variedad de líneas celulares, por lo tanto son prometedores que se aplica ampliamente en estudios de investigación de la interacción de la vía endocítica con sustancias endógenas o exógenas divergentes.
No conflicts of interest declared.
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft by grant Z within Sonderforschungsbereich 944 ‘Physiology and Dynamics of Cellular Microcompartments’ and HE1964/18 within priority program 1580.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Gold chloride | Sigma-Aldrich | 520918 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
Tri-sodium citrate | Sigma | C8532 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
NHS-Rhodamine | Pierce | 46406 | |
DMSO | Sigma | D8418 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
Gentamicin | Applichem | A1492 | |
Kanamcyin | Roth | T832 | |
Carbenicillin | Roth | 6344 | |
8-well chamber slides | Ibidi | 80826 | tissue culture treated, sterile |
Imaris Software | Bitplane | version 7.6 | various configurations available |
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