Una técnica se describe en términos generales para la apertura de la barrera sangre-cerebro en el ratón utilizando microburbujas y ultrasonido. Usando esta técnica, el manganeso se puede administrar al cerebro del ratón. Debido a que el manganeso es un agente de contraste de MRI que se acumula en las neuronas despolarizadas, este enfoque permite imágenes de la actividad neuronal.

Aunque los ratones son el sistema de modelo dominante para el estudio de las bases genéticas y moleculares de la neurociencia, la neuroimagen funcional en ratones sigue siendo un reto técnico. Uno de los enfoques, la activación inducida por el manganeso potenciado por resonancia magnética (MRI AIM), ha sido utilizado con éxito para mapear la actividad neuronal en roedores ^1-5. En AIM resonancia magnética, Mn ^{2 +} actúa como un análogo de calcio y se acumula en las neuronas despolarizadas ^6,7. Debido a Mn ^{2 +} se acorta la T ₁ propiedad del tejido, las regiones de la actividad neuronal elevada mejorará en la RM. Además, Mn ^{2 +} borra lentamente desde las regiones activadas, por lo tanto, la estimulación puede realizarse fuera del imán antes de la imagen, permitiendo una mayor flexibilidad experimental. Sin embargo, debido a Mn ^{2 +} no atraviesa fácilmente la barrera hematoencefálica (BBB), la necesidad de abrir el BBB ha limitado el uso de resonancia magnética de AIM, sobre todo en los ratones.

Una herramienta para la apertura de la BBB es ULTrasound. Aunque potencialmente perjudicial, si el ultrasonido se administra en combinación con microburbujas llenas de gas (es decir, los agentes de contraste por ultrasonidos), la presión acústica requerida para la apertura BBB es considerablemente menor. Esta combinación de ultrasonidos y microburbujas puede ser utilizada para abrir de forma fiable la BBB sin causar daño a los tejidos ^8-11.

Aquí, se presenta un método para la realización de AIM resonancia magnética mediante el uso de microburbujas y ultrasonido para abrir la barrera hematoencefálica. Después de una inyección intravenosa de microburbujas perflutren, un haz desenfocado ultrasonido pulsado se aplica a la cabeza del ratón afeitado durante 3 minutos. Para simplificar, nos referimos a esta técnica de Apertura BBB con microburbujas y ultrasonido como BOMUS ^12. Usando BOMUS para abrir la BBB lo largo de ambos hemisferios cerebrales, manganeso se administra al cerebro de ratón conjunto. Después de la estimulación experimental de los ratones ligeramente sedado, AIM resonancia magnética se utiliza para asignar la respuesta neuronal.

ADemostramos este enfoque, en este documento y la RM BOMUS AIM se utilizan para asignar estimulación unilateral mecánica de las vibrisas en ratones ligeramente sedado ^13. Debido BOMUS puede abrir la BBB lo largo de ambos hemisferios, el lado no estimulada del cerebro se utiliza para controlar para la estimulación de fondo no específica. El mapa resultante de la activación 3D está de acuerdo también con las representaciones de las regiones publicados vibrisas del campo de la corteza barril de ^14. La apertura de ultrasonidos de la BBB es rápido, no invasivo y reversible, y por lo tanto este enfoque es adecuado para los estudios de alto rendimiento y / o longitudinales en ratones despiertos.

1. Montar y calibrar el sistema ultrasonido

1. El sistema de ultrasonidos se inicia con un transductor de ultrasonidos de un solo elemento con un diámetro lo suficientemente amplia como para cubrir el cerebro de ratón y una frecuencia central en el intervalo de 2 Mhz. El transductor es impulsado por un amplificador 50-dB de potencia, que está conectada a un generador de señal que produce la secuencia de pulsos de ultrasonido.
2. Para calibrar la presión acústica del sistema de ultrasonidos, utiliza un hidrófono para relacionar el voltaje aplicado a la presión acústica resultante. Coloque el transductor en un tanque de agua sobre el hidrófono. Aplicar un pulso simple (por ejemplo, una sinusoide 10-ciclo a la frecuencia del transductor con una frecuencia de repetición de impulsos de 10 Hz) para el transductor. Utilice una etapa de traducción de 3 ejes para encontrar la respuesta del pico, el cual debe estar en el centro del haz de ultrasonidos en el foco natural del transductor (aproximadamente 60 mm para nuestra transductor 13 mm de diámetro MHz 2,15).
3. Tome varias medidas más de un sonare de tensiones de entrada (por ejemplo, 50-400 mV _pp) para verificar la linealidad del sistema. Utilizar una regresión lineal simple para estimar la relación entre la tensión de entrada y la presión acústica. En nuestro sistema, los voltajes de entrada de 258 y 167 mV _pp correspondía a pico negativas presiones acústicas de 0,52 y 0,36 MPa.
4. Programa el generador de señales para producir una secuencia de pulsos de ultrasonido que consta de ráfagas de impulsos sinusoidales en la frecuencia del transductor con 50000 ciclos por explosión y un período de ráfaga de 64 ms. En base a las mediciones de calibración, ajustar la amplitud del pulso para generar pico negativas presiones acústicas de 0,36 MPa en el centro del foco natural del transductor.

2. Preparar los reactivos

1. Disolver cloruro de manganeso tetrahidratado (MnCl ₂ .4 H ₂ O) en agua estéril a una concentración de 100 mM (300 mOsm) y el filtro de esterilizar.
2. Producir el lípido perflutren microesferas "activating "el vial en el agitador suministrado por el fabricante durante 45 s. Para un día de experimentos, un solo vial puede ser activado una vez al comienzo del día y utilizado sin reactivación para el resto del día.
3. Inmediatamente antes de la administración de microesferas, agitar el vial con la mano durante 1 minuto para volver a suspender las microesferas. Al retirar microburbujas del vial, no se inyecte aire ambiente en el vial, ya que esto degrada las microburbujas restantes. Deje el vial hasta que el último uso de la jornada, a continuación, guárdelo en el refrigerador. Mantenida de esta manera, un solo vial puede durar varios días. Re-activar el vial almacenado en el agitador, antes de la primera utilización en los días siguientes.

3. Preparación de Animales

1. Se anestesia a los animales con isoflurano, entregado por cono de la nariz. El aparato de cono de la nariz debe estar diseñado para fijar la cabeza del animal precisa y fiable en la misma posición cada vez. Nuestro equipo mantiene ¹⁵ º en la cabezae "cráneo-plano" la posición (es decir, la superficie del cráneo dorsal es horizontal) utilizado en el atlas de Paxinos cerebral ^16. Valorar la anestesia para mantener una frecuencia respiratoria entre 85 y 125 respiraciones por minuto. Mantenga la temperatura del cuerpo, utilizando una lámpara de calor o de aire soplado. Proteger los ojos con el lubricante.
2. Retire el cabello del cuero cabelludo del ratón utilizando una cortadora eléctrica.
3. Colocar un catéter vena de la cola y un catéter intraperitoneal (IP). Para los estudios de supervivencia, asegúrese de usar una técnica estéril apropiada; la colocación del catéter IP se muestra en el video de este artículo es apropiada sólo para experimentaciones sin supervivencia.
4. Haga los preparativos adicionales necesarios para el experimento de estimulación neuronal. Por mapeo de la estimulación de la corteza vibrisas campo barril, utiliza un microscopio de disección y tijeras de microcirugía para cortar el vibrisas lo más cerca posible a la superficie de la piel sin irritar el folículo o piel circundante.
5. Coloque el gel de ultrasonido en elcuero cabelludo y, a continuación inferior una columna de agua contenida por una lámina delgada de plástico (por ejemplo, un 7,6 micras basura bolsa de basura) en el cabezal. Acceda a través de la columna de agua con un hisopo con punta de algodón para expulsar las burbujas de aire que quedan atrapadas en el gel de ultrasonido. Coloque el transductor de ultrasonido a su distancia focal natural (58 mm) directamente sobre el cerebro del ratón en la columna de agua y limpie el transductor con la punta del dedo para eliminar las burbujas de aire atrapadas.

4. Barrera hematoencefálica con microburbujas de apertura y de sonido Ultra (BOMUS)

1. Dale una inyección intraperitoneal de la solución de manganeso a una dosis de 0,5 mmol / kg IP. Se tapa el catéter intraperitoneal de modo que el manganeso no fluye hacia fuera, y esperar 10 minutos para permitir que se distribuya (Figura 1).
2. Para abrir la BBB, administrar 30 l de lípidos perflutrén microesferas (DEFINITY activado) a través del catéter vena de la cola, y simultáneamente, iniciar la secuencia de pulsos de ultrasonido. Cigan insonification durante 3 minutos.

5. La estimulación neuronal

1. Deje aproximadamente 40 minutos para los niveles cerebrales de Mn ^{2 +} para estabilizar antes de comenzar la estimulación neuronal. De esta manera, la mejora dramática de referencia debido a Mn ^{2 +} difusión a través de la BBB se puede distinguir de la mejora diferencial sutil debido a la estimulación. A continuación, comenzar la estimulación con su paradigma de elección (Figura 1).
2. Para la estimulación de vibrisas, apague el isoflurano y quitar el cono de la nariz. Mover un pincel suave artista manualmente en un movimiento circular (1-5 Hz) a través de la matriz vibrisas a una distancia de aproximadamente 2-5 mm de la piel. Continúe la estimulación durante 90 minutos. El manganeso tiene un efecto sedante que permite la estimulación incontrolada del animal. Si el animal se pone inquieto, administrar 5% de isoflurano a través de cono de la nariz durante 15 segundos aproximadamente.

6. Magnetic Resonancia

1. Después de la estimulación, reanudar la anestesia a través de cono de la nariz. Continuar manteniendo la temperatura corporal y el nivel de titulación de isoflurano a una frecuencia respiratoria de 85 a 125 respiraciones por minuto.
2. Coloque el ratón en una bobina de la RM y la transferencia al sistema de resonancia magnética. Adquirir 3D de alta resolución _en T1 imágenes de RM. Por ejemplo, use un gradiente 3D malcriado recordó eco (SPGR) de secuencia con los siguientes parámetros: tiempo de repetición de 25 ms, el tiempo de eco de 2 ms, ángulo de inclinación de 30 grados, ancho de banda de 15,63 kHz; campo de visión de 20 × 20 × 12 mm; matriz de 128 x 128 x 60.

7. Análisis de Imagen

1. Análisis de la imagen es específica para el paradigma estimulación utilizado. Para el experimento de estimulación vibrisas (Figura 2), importar las imágenes de varios animales en un entorno de análisis adecuado. Si algunos animales se estimularon a la derecha, mientras que otros se estimularon a la izquierda, FLip alguna manera que todas las imágenes son efectivamente "a la izquierda-estimulado." Entonces, para comparar el lado estimulado de cada cerebro a su lado contralateral no estimulada, crear un duplicado y reflejado a la izquierda-no estimulada conjunto de imágenes se crea. Registro de todas las imágenes a un espacio común y luego suavizar con un 3 × 3 × 3 píxeles kernel gaussiano.
2. Exportar los datos a un entorno de análisis matemático, como MATLAB. Opcionalmente, enmascarar la anatomía pertinente en las bases de datos. De intensidad normalizar las imágenes por el método iterativo de Venot et al. ^17,18.
3. Use un dos a dos, de una sola cola de pruebas t para comparar cada voxel de los lados de cada cerebro estimulado a la contralateral voxel correspondiente a los lados no estimulados de cada cerebro.
4. Muestra el valor de p resultante mapa para identificar las regiones de actividad diferencial (Figura 3).

8. Los resultados representativos

El método que aquí se presenta tiene dos fondos amental medidas: (1) apertura BBB con microburbujas y ultrasonido (BOMUS) y (2) la activación inducida por el manganeso potenciado por resonancia magnética (MRI AIM). Debido a que el último paso depende del primero, es importante verificar BOMUS exitosos de implementación.

La interrupción de la barrera sangre-cerebro después de la administración de una T _{1-acortamiento} agente de contraste (tales como manganeso o un agente de gadolinio) se traduce en un aumento de la señal en el parénquima cerebral en T _1-imagen ponderada en comparación con los cerebros en la que BOMUS no se realizó (Figura 4). La distribución de esta mejora de manganeso no es completamente uniforme, aunque es bastante constante entre los animales. La distribución refleja no sólo falta de homogeneidad en la abertura de BBB, pero también es la intrínseca distribución no uniforme de Mn en el cerebro ^19. La dinámica espacial y temporal de la apertura de BBB se han descrito anteriormente más ^12.

Figura 1. Protocolo para la línea de tiempo con la neuroimagen funcional BOMUS y AIM resonancia magnética (Adaptado de Howles et al. ^13).

Figura 2. Análisis de esquema para la identificación de regiones of diferente intensidad entre los lados estimuladas y no estimuladas de cada cerebro. Para comparar el lado estimulado el cerebro de cada uno a su lado contralateral no estimulada, un duplicado y reflejado a la izquierda-no estimulada conjunto de imágenes se crea. Estas imágenes están registradas, se filtró, y normalizado. Por último, en la prueba se comparan las imágenes izquierda y se fue estimulada estimuladas. El test de la t es "emparejado", de modo que el lado estimulada de cada cerebro está sólo en comparación con el lado no estimulada del mismo cerebro. La prueba t es "una sola cola" de modo que un lado del mapa de p-valor indica la señal significativamente mayor en el lado estimulado del cerebro, mientras que el otro lado del mapa de p-valor indica la señal significativamente mayor en el lado de la unstimulated cerebro (Adaptado de Howles et al. ^13).

Figura 3. Resultados de análisis conjunto de 7 animales en dos posiciones axiales diferentes. T que la primera columna muestra la media de todas las imágenes registradas alineados, por lo que efectivamente todos los ratones tenían su vibrisas izquierda estimulado. Estas imágenes se superpone con un mapa de color que indica el porcentaje de incremento en promedio de la señal en cada voxel relativa al hemisferio contralateral, como se indica por la barra de color. Regiones coloreadas en la parte derecha de la imagen muestran que el hemisferio contralateral a la estimulación tenía mayor relación señal. Regiones coloreadas en la parte izquierda de la imagen muestran que el hemisferio ipsilateral a la estimulación tenía mayor relación señal. La segunda columna muestra las mismas imágenes superpuestas con el mapa de p-valor que indica la significación estadística del aumento de la señal. La tercera columna muestra el mismo valor de p mapa superpuesto a las cifras correspondientes del atlas estereotáxica Paxinos ¹⁶ con los campos de cañón de la corteza sensorial sombra (Adaptado de Howles et al. ^13).

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Figura 4. Distribución espacial de Mn ^{2 +} en el cerebro. Las imágenes fueron adquiridas 170 minutos después de 0,5 IP MnCl mmol / kg de _2-BOMUS tratados (n = 5) y control (n = 4) ratones. Después de la normalización, la media y desviación estándar de los mapas se calcularon (panel izquierdo). Mejora fue mayor en los ratones tratados con BOMUS. A pesar de esta mejora no fue uniforme a través del cerebro, que era bastante coherente, excepto cerca de los bordes del cerebro y los ventrículos. Uso de las regiones de interés (ROI) dibujados alrededor de diversas estructuras, la media de SNR (+ 1 SD) se calculó a través de cada grupo (panel derecho). BOMUS los animales tratados mostraron una mayor SNR, sino también una mayor variación entre las estructuras y entre los animales (Adaptado de Howles et al. ^13).

Figura 5. Para examinar los efectos de tejido de BOMUS, los cerebros de los ratones tratados con BOMUS se fijaron, en síctioned a 500 - intervalos de micras, y se tiñeron con hematoxilina y eosina. El número medio de células sanguíneas rojas extravasaciones vistos en cada sección del cerebro se muestra para presiones acústicas de 0,36 MPa (n = 3), 0,52 MPa (n = 4), y 5,0 MPa (n = 1). Las barras de error muestran el error estándar. El segundo panel muestra un ejemplo de grave extravasación de células rojas de la sangre del cerebro expuesto a 5,0 MPa (Adaptado de Howles et al. ^12).

Figura 6. Las pruebas de comportamiento cuantitativo se utilizó para evaluar la actividad, la excitación y la capacidad de respuesta antes de la anestesia, y 3 y 24 horas después de la recuperación de la anestesia. El sistema de puntuación, descrito previamente ^12, se basó en la evaluación bien establecido de comportamiento del ratón cuantitativa desarrolloed por Irwin en 1968 ^22. El comportamiento de la media (± SEM) La puntuación para el control (n = 3) y BOMUS (0,36 MPa), tratamiento (n = 8) los animales se muestra. En relación con la línea de base pre-anestesia, todos los animales muestran una disminución en la puntuación de la conducta 3 horas después de la anestesia, pero en gran medida por la recuperación al día siguiente. En cada momento, no se observaron diferencias entre los dos grupos, lo que indica que BOMUS no afectará sensiblemente el comportamiento animal (Adaptado de Howles et al. ^12).

Aquí, un método no invasivo fue presentado por la apertura de la BBB a través del cerebro del ratón entero con ultrasonido y microburbujas (BOMUS). Con la apertura de BBB, Mn ^{2 +} fue administrada y la activación inducida por el manganeso potenciado por resonancia magnética (MRI AIM) se utilizó para la respuesta neuronal a la imagen de corta duración en ratones estimulación ligeramente sedado.

Adecuado apertura BBB se logró con una presión acústica de pico negativo de 0,36 MPa. Nota, esta es la presión a la superficie del cuero cabelludo en el centro del haz de ultrasonidos. Las mediciones de perfil del haz del transductor de un solo elemento de indicar que la presión acústica en el borde del haz es sólo aproximadamente 0,12 MPa. Posteriormente, la atenuación a través del cráneo reduce la presión que llega al cerebro por un estimado del 25% (reducción de potencia basada en Choi et al. ²³ y ajustado por frecuencia). Esto indica que la interrupción se produjo en el pico de BBB-negativas presiones acústicas de 0,09 MPa (en el centro de nuestra viga) A 0,03 MPa (en el borde). Estas presiones son inferiores a los niveles (típicamente 0,4 a 0,5 MPa) reportados en otro lugar ^24. Este umbral presión reducida puede ser debido a la dosis más alta de microburbujas de lípidos utilizados en este trabajo (aproximadamente 1,2 ml / kg) en comparación con otros. Aunque la dosis de microburbujas utilizados fue superior a la recomendada dosis de diagnóstico humano (10 l / kg), los efectos negativos no se observaron.

Tal como se especifica aquí, la técnica no es invasiva BOMUS y reversible, sin embargo, tiene el potencial de causar daño. En el trabajo anterior ^12, los ratones tratados con BOMUS se evaluaron los daños histológico (Figura 5) y cambios de comportamiento (Figura 6). Pico-negativas presiones acústicas de 0,36 MPa se asocia con ninguna efectos negativos observados (Figura 6). Sin embargo, 0,52 MPa BOMUS se asociaron con un pequeño número de intracerebrales extravasación de glóbulos rojos en un subconjunto de los animales ( Figura 5), y algunos animales no se recuperan por completo después del procedimiento. Le recomendamos que una presión acústica que no causa la extravasación debe ser utilizado para los experimentos de resonancia magnética de AIM.

Así como la técnica BOMUS es potencialmente perjudicial, el manganeso tiene también conocida toxicidad ^25. Mn ^{2 +} se sabe que tiene efectos tóxicos sobre la unión neuromuscular y el sistema nervioso ^{26 27.} Esta toxicidad es probablemente responsable de la somnolencia de los ratones después de la administración, aunque el mecanismo de este efecto es desconocido. Durante aproximadamente los primeros 60 minutos de estimulación, el ratón sigue siendo un tanto somnolienta, pero todavía responde a los estímulos dolorosos, como una pizca dedo del pie. Esto permite que el ratón para tolerar la estimulación sin la necesidad de restricción física. En nuestra experiencia, esta somnolencia es adecuado para unos 60 minutos después de lo cual el animal puede llegar a ser inquieto. Control químico adicional puede ser unLOGRADOS según sea necesario, con unos 15 segundos de un 5% isoflurano a través de ojiva. En esta demostración, la somnolencia facilitó la estimulación de la vibrisas, sin embargo, también puede haber reducido la respuesta neuronal en la corteza barril.

Además de simplemente administrar Mn ^{2 +,} la técnica BOMUS puede ser utilizada para administrar globalmente otros agentes de diagnóstico o terapéutico. En el trabajo anterior, BOMUS se ha utilizado para administrar el Gd-DTPA, un agente de contraste de MRI, al cerebro. ¹² Sin embargo, quedan muchas preguntas acerca de la naturaleza de la permeabilidad BBB consigue con BOMUS. En primer lugar, no está claro lo que los agentes de tamaño son capaces de atravesar la barrera hematoencefálica después de BOMUS. Tanto Mn ^{2 +} y Gd-DTPA (500 Da) son moléculas relativamente pequeñas. En segundo lugar, no está claro cómo mucho la permeabilidad de la BBB varía en el cerebro. En tercer lugar, no está claro si la apertura BBB es un efecto relativamente binario, o si ciertos parámetros de apertura puede afectar al tamaño o tipo de materialpermeación. A pesar de Gd-DTPA una distribución bastante uniforme a través del cerebro en el estudio anterior, puede haber sido demasiado pequeño y demasiado difusible para revelar las diferencias en la permeabilidad.

A pesar de estas incertidumbres sobre la BOMUS, el método es eficaz para la rápida administración de Mn ^{2 +} con el fin de AIM-RM. AIM-RM se ha utilizado en ratones para mapear la respuesta neuronal a largo plazo (1-2 días) la estimulación en los ratones ^28-30, pero con este nuevo enfoque, a corto plazo los experimentos de estimulación son ahora posibles. Anteriormente, la administración rápida de Mn ^{2 +} sólo fue posible con osmótica disrupción de la BHE con una infusión de manitol hipertónico intracarotídea. Este enfoque sólo es práctico en las ratas y los grandes modelos animales, pero incluso en las ratas, estos estudios se han limitado por la invasión y la unilateralidad de la técnica. Debido a que BOMUS se puede realizar de forma no invasiva de estimulación despierto y estudios longitudinales Ahora debería ser posible. Además, BECAutilizar Mn ^{2 +} puede ser administrada a los dos hemisferios cerebrales, una gama más amplia de los paradigmas de estimulación son posibles. En la demostración anterior, la administración bilateral de Mn ^{2 +} permite el hemisferio no estimulada para actuar como un control interno, de modo que la respuesta neuronal a la estimulación no específica de fondo podría ser separado de la respuesta a la estimulación vibrisas unilateral.

Además de controlar para la estimulación no específica de fondo, el hemisferio no estimulado también se utiliza para controlar la homogeneidad y la coherencia de la administración de manganeso. Como se ve en otros manganeso-mejoradas experimentos de resonancia magnética ^19, los datos de distribución (Figura 4) indican que la técnica BOMUS no proporciona una mejora homogénea del cerebro. Por lo tanto, sin los controles adecuados (control de los animales o un hemisferio no estimulado), las regiones con mayor aumento de referencia son difíciles de distinguir de las regiones menos elementosseñal muy motivados es debido a la actividad neuronal.

Aunque la línea de base Mn ^{2 +} aumento no es homogéneo, el patrón es bastante consistente entre los individuos. Sin embargo, pequeñas variaciones en la línea de base esta mejora podría oscurecer la señal de AIM-RM. En esta demostración, nos dirigimos a este problema potencial al promediar la señal de AIM-RM en varios animales. Por otra parte, las diferencias en la mejora de referencia podría ser explicada por la adquisición de estimulación pre-imágenes.

El método que aquí se presenta requiere de un análisis sustancial de la imagen estadística, que a su vez, requiere de alta fidelidad de registro de imágenes. Por supuesto, este registro sólo tiene sentido si los datos de origen se adquiere con una resolución (en las tres dimensiones), que es lo suficientemente fina que las estructuras de interés. En esta demostración, imágenes en 3D fueron adquiridas con cerca de voxels isotrópicos aproximadamente 160 micras en cada dimensión, lo que permitió una excelenteregistro anatómica. Sin embargo, el registro de la imagen puede limitar la resolución espacial de este método, un registro defectuoso ligera podría promedio-out regiones muy pequeñas de mejora. Los bulbos olfativos cerebelo y pueden ser particularmente difíciles de registrar, ya que tienen una mejora de finas capas y son a menudo fuera de alineación con el cerebro.

En este sentido, hemos presentado un método para el mapeo de la respuesta neuronal a estímulos de corta duración en ratones despiertos. Aunque no es sencilla, el método es relativamente práctico y accesible. Esta discusión detallada de las limitaciones y las sutilezas esperemos que el lector pueda aplicar la técnica a sus preguntas experimentales propios.

No hay conflictos de interés declarado.

Todo el trabajo se realizó en el Centro Duke para la microscopía in vivo, una NIH / NIBIB nacional de Tecnología Biomédica del Centro de Recursos (P41 EB015897) y Instituto Nacional del Cáncer de imágenes de Pequeños Animales del Programa de Recursos (U24 CA092656). El apoyo adicional fue proporcionado por la NSF Graduate Research Fellowship (2003014921).