Unser Protokoll untersucht die Hefe- und Schimmelpilzvielfalt im Boden anhand von Bodenproben aus verschiedenen Klimaregionen. Dies gibt Einblicke in die Vielfalt der Umwelthefen und hilft, pathogene Arten zu verfolgen. Das Protokoll bietet eine kostengünstige und schnelle Methode zur Ernte von Hefen und Schimmel aus dem Boden.
Bodenproben können in nur sieben Tagen vollständig verarbeitet werden, um Isolate zu erhalten. Ein gut organisierter Versuchsaufbau, wie das Beschriften von Kulturröhrchen und das Vorbereiten von Medien einen Tag im Voraus, ist der Schlüssel, um sich während des Experiments nicht überfordert zu fühlen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung eines Satzes steriler 13-Milliliter-Kulturröhrchen.
Indem Sie sie mit Bodenproben-ID kennzeichnen, verwenden Sie dann eine serologische Pipette, um fünf Milliliter Hefeextrakt-Pepton-Dextrose-Brühe hinzuzufügen, die mit Chloramphenicol und Benomyl in jedes Röhrchen ergänzt werden. Übertragen Sie in einer Biosicherheitskabine für Organismen der Stufe zwei etwa 0,1 Gramm Erde mit einem sterilen hölzernen Planspitzenapplikator in das entsprechende Kulturröhrchen. Verschließen Sie das Rohr sicher bis zum ersten Anschlag, um ein Verschütten zu verhindern, während der Luftaustausch während der Inkubation ermöglicht wird.
Als nächstes inkubieren Sie die Kulturröhrchen in einer Walzentrommel für 24 Stunden bei einer Temperatur, die als optimal für die Maximierung des Hefewachstums angesehen wird. Beschriften Sie dann die mit Chloramphenicol und Benomyl versetzten Hefeextrakt-Pepton-Dextrose-Agarplatten mit der Bodenproben-ID, bevor der Überstand auf das feste Medium übertragen wird. Entfernen Sie die Kulturrohre von der Walzentrommel.
Dann in einer Biosicherheitskabine für Organismen der zweiten Stufe das Rohr kurz umdrehen, um Bodenpartikel und Zellen, die sich möglicherweise unten abgesetzt haben, wieder in die Suspension zu ziehen. Als nächstes übertragen Sie 100 Mikroliter des Überstands mit einer Mikropipette auf eine Platte. Verwenden Sie einen sterilen wiederverwendbaren Zellstreuer, um die Flüssigkeit gründlich und gleichmäßig über die Agaroberfläche zu verteilen.
Nachdem Sie eine ausreichende Inkubationszeit von zwei bis drei Tagen eingeplant haben, untersuchen Sie die Platten auf Hefewachstum in einer Biosicherheitskabine für Organismen der Stufe zwei. Suchen Sie nach cremigen, runden, matten Hefen, die leicht von Bakterien- und Schimmelpilzkolonien unterschieden werden können. Wählen Sie eine hefeartige Kolonie aus jeder Platte mit sterilen einfachen Applikatorstäben aus Holz.
Übertragen Sie jede ausgewählte Kolonie auf einen frischen Hefeextrakt Pepton-Dextro-Agar-Platten, ergänzt mit Chloramphenicol und Benomyl und Streifen für einzelne Kolonien. Führen Sie drei separate Streifen durch und verwenden Sie für jeden Streifen einen neuen Applikatorstick. Als nächstes verwenden Sie frische Zellen, die auf einer Platte entwickelt wurden, um eine Koloniepolymerase-Kettenreaktion durchzuführen.
Verwenden Sie interne transkribierte Abstandshalter ITS1 und ITS4 Primer, um das Pilz-Bar-Coding-Gen zu verstärken. Vergleichen Sie die erhaltene interne transkribierte Abstandshaltersequenz der Hefestämme, zwei Sequenzen, die in öffentlichen Datenbanken wie dem National Center for Biotechnology Information GenBank und UNITE hinterlegt sind, um die Artenidentität festzustellen. Fügen Sie Erde zu 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen hinzu, die einen Milliliter Sabouraud-Dextrosebrühe enthalten, und inkubieren Sie bei 50 Grad Celsius für zwei bis vier Tage.
Um die Myzelien aus der im Boden geimpften Brühe auf Malzextrakt-Agarplatten zu übertragen, identifizieren Sie zunächst die Bodeninokula, die sichtbares Myzelwachstum aufweisen, und fügen Sie die Sabouraud-Dextrosebrühe zur Luftgrenze hinzu. Verwenden Sie dann sterilisierte hölzerne einfache Spitzenapplikatorstäbe, um die Myzelie in die Mitte einer Malzextrakt-Agarplatte zu übertragen und diese Malzextrakt-Agarplatte drei Tage lang auf 37 Grad Celsius zu inkubieren. Identifizieren Sie für die Auswahl von Myzelien mit morphologischen Eigenschaften von Aspergillus fumigatus die Schimmelpilzkolonien, die ein charakteristisches grünes, schwankendes Wachstum aufweisen.
In einer Biosicherheitskabine für Organismen der Stufe zwei können Sie Konidien oder Myzelien ernten, indem Sie die Oberfläche einmal mit sterilisierten Holzplattierspitzen-Applikatorstäben oder einer Impfschleife abkratzen und in die Mitte einer Malzextrakt-Agarplatte überführen, indem Sie sie für einzelne Kolonien auf das Agar streichen. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für zwei Tage. Subkulturieren Sie mit einem sterilen Applikationsstab oder einer Impfschleife eine einzelne Kolonie, die auf Malzextrakt-Agar erzeugt wird, indem Sie die Kolonie einmal streifen.
Verteilen Sie die geernteten Sporen in der Mitte des Tellers. Bereiten Sie eine sterile 30%ige Glycerinlösung vor, um die Aspergillus fumigatus-Sporen oder Myzelien zur Kulturlagerung zu ernten. Nach den zwei Tagen der Inkubation der Agarplatten bei 37 Grad Celsius einen Milliliter der 30%igen Glycerinlösung mit einer Pipette abraten und auf die Aspergillus fumigatus-Kolonie verteilen.
Zur phänotypischen Identifizierung von Aspergillus fumigatus-Stämmen aspirieren Sie 10 Mikroliter der Myzel- und Sporenvorräte, um 990 Mikroliter Wasser hinzuzufügen. Wirbeln Sie diese verdünnte Sporensuspension ein und geben Sie 10 Mikroliter der Suspension auf einen Standard-Objektträger ab. Sehen Sie sich dann mit einem zusammengesetzten Mikroskop bei 400-facher Vergrößerung die Suspension an und lokalisieren Sie Konidiophoren.
Vergleichen Sie die beobachtete Konidiophoremorphologie mit der Aspergillus fumigatus conidiophore Morphologie. Um die richtige Fragmentgröße für jeden der neun Mikrosatelliten-Loci zu bestimmen, verwenden Sie eine Software, die zur Fragmentanalyse fähig ist. Rufen Sie die Rohdaten der Kapillarelektrophorese ab und bewerten Sie die Fragmentgrößen basierend auf dem größten Peak mit der fragmentierten Analysesoftware.
Als nächstes konvertieren Sie die Fragmentgrößen in Wiederholungszahlen für jede der neun niedrigen und verwenden Sie die Fragmentgrößen der Wiederholungsnummern der Referenzdehnung Af293. Von 3.826 Bodenproben, die an 53 Standorten in neun Ländern entnommen wurden, wurden 1.473 Hefestämme isoliert. Die beste Inkubationstemperatur für jedes Land wurde auf der Grundlage seiner mittleren Jahrestemperatur bestimmt.
In der Verdünnungsanalyse für jedes Land wurde der Shannon-Diversitätsindex als Maß für die Bodenhefediversität verwendet. Die resultierenden Verdünnungskurven näherten sich der Sättigungsasymptote, was darauf hindeutet, dass zusätzliche Probenahmen wahrscheinlich nicht zu mehr Hefediversität geführt hätten. Myzelwachstum auf Platten bildete die für Aspergillus fumigatus typische grün schwankende Morphologie.
Andere thermotolerante Pilzarten könnten in derselben Bodenprobe vorhanden sein und den Aspergillus fumigatus auf derselben Platte oder selbst züchten. Aspergillus fumigatus conidiophore Struktur, die mittels Lichtmikroskopie betrachtet und identifiziert wurde, zeigte, dass Konidiophoren eine Kugel auf dem Stick Morphologie haben und Conidiophoren uniseriat sind, wobei die an den Konidienketten befestigten Phialiden direkt an das sphärische Vesikel gebunden sind. Ein Chromatogramm erzeugtes Biseriat enthüllte die drei Kanäle, die die Fragmentlängen von Aspergillus fumigatus dinucleotide, Trinukleotid und Tetranukleotid kurzen Tandemwiederholungsloci visualisierten.
Ein qualitativ hochwertiges Minimum-Spanning-Netzwerk kann mit dem R-Skript plot_poppr_msn oder imsn generiert werden. Eine diskriminierende Analyse von Prinzipkomponenten ist eine weitere Methode, um die genetischen Beziehungen zwischen Stämmen sichtbar zu machen. Die Zugabe von Benomyl und Chloramphenicol zu Wachstumsmedien verhindert Schimmel- bzw. Bakterienwachstum und begünstigt die Hefeselektion.
Chloramphenicol reduziert auch die Fermentation in Medien und senkt die Gasansammlung in Inkubationsröhrchen. Die Durchführung von Metagenomik an Bodenproben wird zusätzliche Informationen über die kulturelle Vielfalt liefern. Anfällige Tests von A.fumigatus-Stämmen werden das Vorhandensein von Resistenzgenotypen identifizieren.
Dieses Protokoll kann mit geringen Modifikationen auf andere Hefe- und Formsysteme angewendet werden. Es erleichterte die Untersuchung der kulturellen Bodenhefediversität und ihrer Prädiktoren auf globaler Ebene.
