The authors acknowledge Meike Schaffrinski for excellent technical assistance. We would like to thank the following people for their help in the collection of peripheral blood samples (all from University Medical Center G&#246;ttingen): Henrietta Vida (Dept. of Transfusion Medicine), Kia Homayounfar, Lena-Christin Conradi (Dept. of General, Visceral and Pediatric Surgery), Leila Siam, Bawarjan Schatlo (Dept. of Neurosurgery), Hendrik A. Wolff, Martin Canis (Dept. of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery) as well as all employees of the interdisciplinary short-term oncology. We acknowledge Dirk Wenzel (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, G&#246;ttingen) for his help with the electron microscopy of MVs. 
The study was funded by the German Ministry of Education and Research (BMBF) project MetastaSys (grant no. 0316173) as well as the German Cancer Aid (grant no. 109615).

Alle Experimente mit menschlichen Probanden wurden von der Ethikkommission genehmigt (Genehmigung Nr. 3/2/14). Für die Wahl des Patienten sollte beachtet werden , dass mehrere Faktoren wie Alter, Geschlecht, Stromtherapieschemata und viele mehr beeinflussen können MV Zusammensetzung in Blut und daher in Betracht gezogen werden sollten vor Sammlung 22,23 abzutasten. 1. Herstellung von Plasmaproben <ol><li> Draw 1-2 Röhrchen Blut pro Spender durch eine 21-Gauge-Butterfly-Nadel in einen Vacutainer Blutentnahmeröhrchen mit EDTA (1,6 mg / ml Blut). Achten Sie darauf, die Röhre (n) mehrmals zu invertieren effizient Blut Antikoagulation zu gewährleisten. HINWEIS: Die empfohlene Menge an Blut für die anschließende Durchflusszytometrie und Western Blot-Analyse ist von 5 bis 15 ml. Um MV Abbau und Verlust, Blutproben zu verhindern, sollte &lt;30 Minuten nach der Blutentnahme behandelt werden. </li><li> Bereiten Plasmaproben, indem die Proben bei 1200 × g für 15 min Zentrifugieren beiRaumtemperatur (RT). </li><li> Tragen Sie eine Ventilfilter, um die Trennung von Plasma (= obere Schicht), um aus den verbleibenden Blutzellen (= untere Schicht). </li><li> Übertragen Sie das Plasma in einem 15 ml-Röhrchen. </li><li> Zentrifuge für 15 min bei 1500 xg, RT zu pelletieren größere Zelltrümmer und entfernen restliche Plättchen. </li><li> Übertragen Sie den Überstand in ein 15 ml-Röhrchen und direkt weiter mit MV Isolation oder Lagerung von Proben für bis zu 6 Monate bei -20 ° C. HINWEIS: Die vorliegende Protokoll kann auch verwendet werden MVs zu isolieren (und Exos) aus Zellkulturüberständen. Um dies zu tun, kultivieren Zellen bei 60-80% Konfluenz für 24 bis 48 h in Kulturmedium mit Vesikel verarmten FCS ergänzt, und dann den Überstand zu sammeln. Zentrifuge für 5 min bei 750 · g, 4 ° C Rest schwebenden Zellen abzureichern, füllen Sie den Überstand in ein neues 15 ml Zentrifugenrohr und erneut 5 min bei 1500 xg, 4ºC größere Zelltrümmer zu pelletieren. Dieser Überstand kann dann für die Isolierung von MVs verwendet werdenwie in Schritt 2.1 beschrieben - 2.16. </li></ol> 2. Isolierung von MVs <ol><li> Übertragen die Plasmaprobe in einem geeigneten Zentrifugenröhrchen. Falls erforderlich, füllen Rohr mit PBS, um die Probe und verhindern Zusammenbruch von dünnwandigen Rohren während des Zentrifugationsverfahren zu verdünnen. </li><li> Zentrifuge für 35 min bei 14000 · g, 4 ° C. </li><li> Überstand dekantieren, halten Rohre auf den Kopf gestellt und auf ein Papiertuch legen. Warten 3 bis 5 min, bis das gesamte verbleibende Überstand wurde von der Probe in das Handtuch und dadurch entfernt getränkt wurde. </li><li> Resuspendieren MV Pellet in 1000 ul PBS, Transfer in ein 1,5-ml-Röhrchen und Zentrifuge für 35 min bei 14.000 × g, 4 ° C in einer Tischzentrifuge. </li><li> Überstand entfernen. </li><li> Resuspendieren MV Pellet in 50 bis 500 &amp; mgr; l PBS, abhängig von der Größe des Pellets. Alternativ lysieren MVs direkt, beispielsweise in RIPA - Puffer (150 mM NaCl / 0,1% SDS / 0,5% Na-Desoxycholat / 1% Triton X-100/50 mM Tris, pH 7,2)für die anschließende Western Blot-Analyse. Store MVs bei -20 ° C. Sie werden für mehrere Monate stabil bleiben, aber wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen vermeiden. </li><li> Optional: Bestimmen Sie die MV Proteinkonzentration mit einem Protein - Test (zB Bradford oder Lowry - Methode) , um MV Erträge zu beurteilen oder MVs für nachfolgende Experimente dosieren. </li><li> Wenn zusätzliche Exos aus den Plasmaproben isoliert werden sind, dekantiert den Überstand aus Schritt 2.3 in eine Ultrazentrifugation Rohr und Zentrifuge für 2 h bei 110.000 · g, 4 ° C. Den Überstand umfüllen, wie in Schritt 2.3 beschrieben, resuspendieren Exo Pellet in 1000 ul PBS und Transfer in kleine (1,5 ml) Ultrazentrifugation Röhren. <ol><li> Ultrazentrifuge für 2 h bei 110.000 · g, 4 ° C, Überstand absaugen und Pellet resuspendieren Exo in 50-75 ul PBS oder RIPA-Puffer. </li></ol></li></ol> 3. Charakterisierung der MVs durch Durchflusszytometrie <ol><li> Transfer 15 &amp; mgr; l PBS + 1% Vesikel abgereicherte fötalem Kälberserum (FCS) in einer Durchflusszytometrie Röhre. HINWEIS: Vesicle abgereicherte FCS durch Zentrifugieren hitzeinaktiviertem (30 min bei 56 ° C) FCS für 18 Stunden bei 110.000 xg und Filtrieren des Überstand durch ein 0,2 - um - Filter hergestellt wird , wie zuvor beschrieben 24. </li><li> In 5 ug (bei geringen Ausbeuten 3 ug sind auch anwendbar) von MVs in PBS. </li><li> Inkubieren Proben für 30 min bei RT, um unspezifische Bindungsstellen auf der Oberfläche MV zu blockieren und dadurch die Hintergrundfärbung zu reduzieren. </li><li> Fügen Sie einen fluoreszenzmarkierten Antikörper gegen das Protein von Interesse. Daraufhin wird die Menge an Antikörper für die Färbung verwendet vor zu verwenden, um die optimale Konzentration und garantieren ein niedriges Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu bestimmen. Stellen Sie sicher , auch ein Rohr mit ungefärbten MVs als negative Kontrolle und ein Rohr von MVs gefärbt mit dem passenden Isotyp - Kontrollantikörper bei der gleichen Konzentration (beispielsweise umfassen, wenn 1 ug Antikörper verwendet wird, auch verwendet werden 1 ug der Isotyp - Kontrolle eintibody) zu quantifizieren Hintergrundfärbung. HINWEIS: Es ist auch möglich, mehrfarbige Durchflusszytometrie an unterschiedliche Fluorochrome gekoppelt durch Zugabe von mehreren Antikörpern durchzuführen. </li><li> Inkubieren für 20 min bei RT im Dunkeln. </li><li> In 250 ul PBS und gehen Sie mit der Messung der Probe eines Durchflusszytometers verwenden. <ol><li> Im Falle, dass die Proben nicht sofort gemessen werden, mit 150 &amp; mgr; l PBS und 50 ul 4% Paraformaldehyd (PFA) zu fixieren Proben und lagern bei 4 ° C. ACHTUNG: PFA ist giftig. Verwenden Sie Handschuhe und geeignete persönliche Schutzausrüstung. </li></ol></li><li> Reduzieren Sie die Schwelle des Durchflusszytometer auf den niedrigsten Wert möglich und für die MV Bevölkerung suchen eine Vorwärtsstreuung (FSC) gegen die Seitenstreuung (SSC) Grundstück in logarithmischer Skala. Tor auf der MV Bevölkerung und zu bewerten das Fluoreszenzsignal in ein entsprechendes Histogramm. </li></ol> 4. Charakterisierung von MVs durch Western Blotting <ol><li> Resuspendieren MV Pellets direkt ineinem geeigneten Lyse - Puffer ( zum Beispiel RIPA - Puffer). <ol><li> Falls der MV - Pellet bereits in PBS resuspendiert worden, verdünnte es mindestens 1: 1 in einem geeigneten Lyse - Puffer ( zum Beispiel RIPA - Puffer). </li></ol></li><li> Bestimmung der Proteinkonzentration des MV Probe, beispielsweise durch Lowry - Assay. </li><li> Vorbereitung 10 - 20 &amp; mgr; g MVs in 22,5 &amp; mgr; l RIPA-Puffer. Dann fügen Sie 7,5 ul 4x Laemmli-Ladepuffer und Wärme für 5 min bei 95 ° C. </li><li> Belastungsproben auf einem Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese und durchzuführen, und Immunoblotting nach Standardprotokollen. </li><li> Nachdem die Proteine ​​auf die Membran übertragen, führen Sie den Standardprotokollen eine Ponceau-Färbung als Ladekontrolle nach. </li><li> Entfärben Membran in TBST für 5 min bei RT. </li><li> Block Membran für 30 min bis zu 1 h bei RT in 5% BSA in TBST. </li><li> Inkubieren Membran mit dem primären Antikörper bei 4 ° C über Nacht oder für 2 h bei RT. </li><li> Waschen Sie die Membran mit TBST 3 x 5 min.</li><li> Inkubieren der Membran mit HRP-gekoppelten sekundären Antikörper bei einer Verdünnung von 1: 10.000 in 5% BSA. Hinweis: Bei hohen Hintergrundsignalen, verwenden Milchpulver anstelle von BSA. </li><li> Waschen Sie die Membran mit TBST 3x 5 min. </li><li> Entwickeln Membran mit einem ECL-Nachweisreagens und Erfassungssignale auf Chemilumineszenz Filme oder einer Chemilumineszenz-Bildgebungssystem. HINWEIS: Um MVs von Exos zu unterscheiden, Proteine wie Tubulin, actinin-4 oder mitofilin verwendet werden können , die in erster Linie sollte auf MVs 16,25 vorhanden sein. Darauf achten , dass die meisten tetraspanin Antikörper (zB CD9, CD81), das als Marker für Exos, nicht unter reduzierenden Bedingungen arbeiten und daher in nicht-reduzierenden Ladepuffer durch Erhitzen für 10 min bei 70 ° C hergestellt , gefolgt werden sollte. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

<html> Jüngste Studien auf EVs im Blut haben gezeigt, dass EV Zusammensetzung und zählt während der Ursache verschiedener Krankheiten verändern. Daher sind die Analyse und die weitere Charakterisierung dieser EVs von großem Interesse, um ihre mögliche Verwendung als Krankheits Biomarker für die Diagnose und Prognose beurteilen oder Therapie Antworten zu bewerten. Das Protokoll wir hier präsentieren, erlaubt die Isolierung der Vesikel mit einem Durchmesser von bis zu 600 nm, die keine Zellorganellen enthalten. Diese Beobachtungen stehen im Einklang mit der aktuellen Definition von MVs und schließen die Anwesenheit von apoptotischen Körpern 2. Mit Western Blotting, konnten wir zeigen, dass die isolierten MVs zeigen eine hohe Expression von Tubulin, während die Tetraspaninen CD9 und CD81, die oft als Exo-Marker verwendet werden, wurden nur leicht ausgedrückt. Dies bestätigt , dass MVs von Exos unterscheiden und passt zu den letzten in eingehende Charakterisierung und Vergleich der beiden EV Populationen von Proteomik 25. Inhalt &quot;&gt; Bei der Erfassung von Blutproben, ist es wichtig, die Zeit zwischen der Blutabnahme und Plasmapräparat so kurz wie möglich zu halten, um MV Abbau zu verhindern. Darüber hinaus längerer Lagerung von Blutproben zur Aktivierung von Blutzellen führen könnte verbessert MV verursachen Ein weiterer wichtiger Aspekt für MV Isolations Shedding und schließlich Apoptose, die in der Veröffentlichung von apoptotischen Körpern führt. ist Kontaminationen von MV Präparationen mit Plasmaproteinen oder kleiner Exos zu verhindern. Daher ist es wichtig, so viel von der Überstand wie möglich zu entfernen, nachdem Abzentrifugieren die MVs bei 14000 x g. Da das Pellet normalerweise sichtbar ist und dicht an der Wand des Rohres befestigt ist, kann der Überstand leicht mit einer Pipettenspitze entfernt werden. im Gegensatz zu Exos die Aggregate durch Ultrazentrifugation hoher Geschwindigkeit während der Herstellung zu bilden tendieren, und oft schwer zu suspendieren, tritt dieses Problem nicht mit MVs. Unsere Studie zeigt, dass es mög istble MV Subpopulationen im Blut mittels Durchflusszytometrie zu charakterisieren. Obwohl die Nachweisgrenze der meisten Durchflusszytometer um 200 - 300 nm, wurden MVs reproduzierbar in Spender gemessen sowie Zellkulturproben mit den gleichen Parametern der Analyse und Tore, die klar ihre Unterscheidung von Hintergrundsignalen erlaubt. Es ist wichtig , vor den Messungen überprüfen, ob der PBS für die Analysen verwendet keine verunreinigenden Partikel enthalten , die einen hohen Hintergrund während Durchflusszytometrie (Abbildung 3) verursachen könnte. Obwohl einige kleinere MVs möglicherweise nicht in einer durchflusszytometrischen Ansatz eingefangen werden, entdeckten wir MVs aller großen Blutzellpopulationen (beispielsweise Blutplättchen, rote Blutkörperchen, Leukozyten, Endothelzellen). In unseren Analysen haben wir Standard - Marker für die verschiedenen Blutzellen , die zuvor auf MVs gefunden wurden , 26-29. Es sollte beachtet werden, dass Cytometrie, um die bestmöglichen Ergebnisse zu erzielen durch Strömungs, ter Menge und Konzentration aller Antikörper sollte auf einem MV Probe, die das Antigen von Interesse exprimieren, titriert werden. Wenn bestimmte MV Subpopulationen im Blut wird mit einer höheren Spezifität identifiziert werden, ist es möglich , Doppelfärbung gegen zwei verschiedene Antigene auf den jeweiligen MVs auszuführen und nur alle doppelt positiven MVs betrachten für nachfolgende 23 analysiert. Derzeit gibt es Bemühungen um eine Standardstrecke der MV - Subpopulationen im Blut von gesunden Personen 23.30 zu definieren. Diese Studien haben bereits gezeigt, dass platelet-derived MVs die größte Bevölkerung der MVs im Blut bilden, die in Übereinstimmung mit unseren Beobachtungen ist. Ein Vorteil der Durchflußzytometrie MV Proben zu charakterisieren, ist, daß dieses Verfahren bereits gut für diagnostische Zwecke etablierten in den meisten klinischen Zentren, die die mögliche Verwendung von MVs als Biomarker in klinischen Alltag Diagnose erlauben würden. Frühere Studien über EVs in Blut, das hauptsächlich Fokus habened auf kleineren Exos, verlassen sich auf entweder spezifischen Sortierverfahren selektiv eine zeitaufwendige (2 Tage) Isolationsverfahren mit Kopplung von Exos die gewünschte Exo Zielpopulation 31,32 oder benötigen zu analysieren 18 Perlen vor der Analyse zu Latex. Unsere eigene nicht veröffentlichte Beobachtungen legen nahe, dass die Durchflusszytometrie-Analyse von MVs aus Vollblutpräparaten ermöglicht auch die Erkennung von MVs wie tumorabgeleiteten MVs ohne solche Auswahlprozesse. Zusammengenommen stellte das Protokoll hier ermöglicht die schnelle Isolierung von MVs aus peripheren Blutproben mit Standard-Laborgeräte und deren anschließende Charakterisierung mit Durchflusszytometrie und Western Blot. Der gesamte Prozess kann in etwa 2 h durchgeführt werden, die künftige Studien über MV Profile in dem Blut des Patienten erleichtern, die erforderlich sind, das Potenzial von MVs als Krankheit Biomarker zu beurteilen.

In den letzten Jahren viele In - vitro - Studien haben gezeigt , dass extrazelluläre Vesikel (EVs) eine wichtige Rolle bei der interzellulären Kommunikation spielen. Lebende Zellen ständig Schuppen Bläschen, die in Größe, Inhalt und Biogenese unterscheiden. Die am besten untersuchten EVs sind Exosomen, die aus dem endosomalen System stammen, wo sie als intraluminale Vesikel in multivesicular Körper gespeichert werden. Wenn dieser Sicherung mit der Plasmamembran werden die enthaltenen Vesikel als Exosomen freigegeben (Exos, Durchmesser 30 bis 100 nm 1). Eine zweite Population von EV , die in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen hat zunehmende Aufmerksamkeit sind große microvesicles (MVs, Durchmesser 100 - 1000 nm) , die direkt aus der Plasmamembran 2 abgeschnürt. Beide Arten von Vesikeln sind durch eine Lipiddoppelschicht umgeben und enthalten Nukleinsäuren, beispielsweise DNA, mRNA oder miRNA 3 bis 5, und eine Vielzahl von Proteinen , die sie an benachbarte c übertragenells. Während die Proteinzusammensetzung der Vesikel im allgemeinen den Stand der Ursprungszelle reflektiert scheinen einige Proteine selektiv gezielte und 1 auf EVs angereichert werden. Ein Hauptforschungsinteresse ist EVs von anormalen und kranken Zellen zu charakterisieren, um spezifische EV Signaturen zu definieren, die die Verwendung von EVs als neue Biomarker erlauben könnten. Insbesondere in der Krebstherapie, in denen häufig der Tumor selbst nicht leicht zugänglich ist , flüssige Biopsien tumorspezifische EVs in Blut Targeting könnte Überwachung der Therapie Antworten zulassen oder helfen , den Primärtumor ohne die Notwendigkeit für invasive Prozeduren 6 charakterisieren. Tatsächlich haben EVs bereits aus verschiedenen Körperflüssigkeiten , einschließlich Urin 7, CSF 8, Muttermilch 9 oder Blut 10 erfolgreich isoliert. Mehrere Studien Veränderungen in der EV zählt und Zusammensetzung in verschiedenen menschlichen Krankheiten identifiziert. Beispielsweise ist die Anzahl der pro-Koagulans MVs in Sepsis-Patientendeutlich erhöht im Vergleich zu gesunden Personen 11. Auch bei Patienten mit schwerer Malaria cerebralis eine Zunahme der Gesamt MVs in Blut beobachtet und zählt von 12 mit Koma Tiefe und Thrombozytopenie korrelieren platelet-derived MVs werden. Andere Studien berichten , erhöhte Anzahlen von Endothel-abgeleitete Vesikel in Patienten mit systemischem Lupus erythematodes oder Herzinsuffizienz und im Fall des letzteren, dies mit einer höheren Wahrscheinlichkeit von kardiovaskulären Ereignissen korreliert 13,14. Vor allem in der Krebstherapie, EVs in Blut werden derzeit als neue Biomarker mit diagnostischen und prognostischen Wert diskutiert. Ebenen der MVs exprimierenden Tumor-assoziierten Proteinen, wie MUC1, EGFR oder FAK scheinen im Blut von Brustkrebspatienten 15,16 angehoben werden. Auch für Exos haben neuere Studien gezeigt, dass Blut gewonnenen Exos trägt tumorspezifische Antigene wie Glypican-1 bei Bauchspeicheldrüsenkrebs oder Del-1 bei Brustkrebs im frühen Krankheits de erlaubenSchutz mit hoher Spezifität und Sensitivität 17,18. Zusätzlich Serum abgeleitetes Tumor Exos kann DNA enthalten , die für den Nachweis von Mutationen , wie beispielsweise K - Ras und p53 verwendet werden können , die für die Therapie Prädiktion 19 ihre Verwendung vorschlägt. Jüngste Fortschritte haben , dass die Analyse von Exos im Blut von Patienten mit Glioblastom gezeigt , die eine spezifische Mikrofluidik - Chip mit 20 Therapiekontrolle ermöglicht. Zusammengenommen bedeuten diese Ergebnisse, dass die Analyse von krankheitsspezifischen Subpopulationen von Vesikeln wertvolle Informationen über die Diagnose, Prognose sowie therapeutische Möglichkeiten und Erfolg gibt. Die Isolierung und Analyse von Exos aus Blut ist zeitraubend, erfordert eine spezielle Laborausrüstung und ist daher noch nicht geeignet für die klinische Routinediagnostik. Im Gegensatz dazu kann MVs isoliert werden viel schneller und aufgrund ihrer größeren Größe, kann leicht mittels Durchflusszytometrie analysiert werden , ohne die Notwendigkeit , um sie an die Latexperlen , wie es für Exos 18 notwendig ist ,, 21. Somit stellen wir hier ein Protokoll, das für die standardisierte Isolierung von MVs aus Blutproben und die anschließende Charakterisierung von MV-Subpopulationen mittels Durchflusszytometrie verwendet werden kann. Dieses Protokoll wird die weitere Untersuchung und in der Tiefe Charakterisierung von MV Profile in großen Patientengruppen ermöglichen, die erforderlich werden MVs für die tägliche klinische Diagnostik zu verwenden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>butterfly needle (21 gauge)</td>
			<td>Hospira Deutschland GmbH</td>
			<td>490P29201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin Fraction V</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8076.3</td>
			<td>For 10x TBS weigh 24.2 g Tris base and 80 g NaCl, ad 1 L H2O and adjust pH to 7.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 1x TBS-T mix 100 mL 10x TBS with 900 mL H2O and add 1 mL Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD235a-PE</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A07792</td>
			<td>use 5&#181;l for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-FITC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>7782</td>
			<td>use 5&#181;l for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD62E-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>336008</td>
			<td>use 0.8&#181;g for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD62P-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304905</td>
			<td>use 0.1&#181;g for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>349501</td>
			<td>1:2000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 antibody</td>
			<td>Immunotools</td>
			<td>21270091</td>
			<td>1:1000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence imager ImageQuant LAS-4000</td>
			<td>Fujitsu Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL detection reagent</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA vacutainers for blood collection</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>01.1605.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10091148</td>
			<td>heat-inactivated (30 min, 56&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter 0.22&#181;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-coupled anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>santa cruz</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td>use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-coupled anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>santa cruz</td>
			<td>sc-2004</td>
			<td>use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli loading buffer, Roti-Load 1</td>
			<td>Roth</td>
			<td>K929.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microfuge SIGMA 1-15K</td>
			<td>Sigma Laborzentrifugen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>milk powder (Blotting-Grade Blocker, nonfat dry milk)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multifuge 3 L-R</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM10</td>
			<td>NanoSight Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, w/o Ca and Mg</td>
			<td>Pan biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusor syringe 50 mL</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8728844F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau-S staining solution</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A2935,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor Sw32.1 Ti for ultracentrifugation (6x 17 mL)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor TLA-120.2 for ultracentrifugation (10x 1.5 mL)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubes for flow cytometry (5 mL, round-bottom)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubes for ultracentrifugation (15 mL)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubes for ultracentrifugation (11* 34 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-829</td>
			<td>1:5000 in 5%BSA in TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultracentrifuge Optima L-80 XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultracentrifuge TL-100</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>valve filter Seraplas V15</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>53,428</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood

Die Freisetzung von extrazellulären Vesikeln (EVs) einschließlich kleiner Endosomen-derived Exosomen (Exos, Durchmesser &lt;100 nm) und großen Plasma-Membran-derived microvesicles (MVs, Durchmesser&gt; 100 nm) ist ein grundlegender zellulärer Prozess, der in allen lebenden Zellen vorkommt. Diese Vesikel Transportproteine, Lipide und Nukleinsäuren , die spezifisch für die Ursprungszelle und in vitro - Studien haben ihre Bedeutung als Mediatoren der interzellulären Kommunikation hervorgehoben. EVs wurden aus verschiedenen Körperflüssigkeiten erfolgreich isoliert und vor allem EVs im Blut haben als vielversprechende Biomarker für Krebs oder Infektionskrankheiten identifiziert worden. Um die Untersuchung der MV-Subpopulationen in Blut zu ermöglichen, stellen wir ein Protokoll für die standardisierte Isolierung und Charakterisierung von MVs aus peripheren Blutproben. MVs werden aus EDTA-antikoaguliertem Plasma-Proben durch Differential-Zentrifugation pelletiert und besitzen typischerweise einen Durchmesser von 100-600 nm. Aufgrund ihrer größeren Größe, können sieleicht mittels Durchflusszytometrie untersucht werden, eine Technik, die in den meisten Labors in der klinischen Diagnostik und zur Verfügung routinemßig verwendet wird. Mehrere Beispiele für die Qualitätskontrolltests der isolierten MVs werden gegeben, und die Marker, die für die Unterscheidung von unterschiedlichen Subpopulationen MV in Blut verwendet werden können, vorgestellt.

Um die Ausbeute von MVs zu quantifizieren, die nach dem beschriebenen Protokoll isoliert werden können, wir die Menge der MVs isoliert aus Blutproben von 10 Spendern berechnet. Die MV - Ausbeute, die in einer Lowry - Proteinassay bewertet wurde, lag im Bereich von 10 bis 30 &amp; mgr; g mit einem Mittelwert von 19,2 &amp; mgr; g pro ml Blut MVs (Tabelle 1). Die Partikelkonzentration von Nanoteilchen Verfolgungsanalyse (NTA) bestimmt lag im Bereich von 1,66 x 10 9 bis 2,36 × 10 10 mit einem Mittelwert von 5,9 x 10 9 Partikeln pro ml Plasma - Probe (Tabelle 2). Weitere Charakterisierung der MVs durch Transmissionselektronenmikroskopie zeigten eine Population von Vesikeln mit einem Durchmesser von &gt; 100 nm , das von einer Lipiddoppelschicht umgeben waren und enthielten keine Zellorganellen (1A). NTA bestätigt , dass die Größe der isolierten MVs von 100 bis 600 nm lag (1B) und die mittlere MV Größe betrug 201nm (Abbildung 1C). Das Anfärben für typische MV und Exo Marker durch Western Blotting gezeigt , dass die isolierten MVs für Tubulin - positiv waren und zeigte nur eine geringe Expression von CD9 und CD81, während Exos für Tubulin negativ waren und bereichert in CD9 und CD81 (Abbildung 2). Analyse der isolierten MVs mittels Durchflusszytometrie (3A) zeigte eine Vesikel Population definiert , die normalerweise für die MVs aus Zellkulturüberständen isoliert verwendet unter Verwendung der gleichen Parameter gated werden konnte , und das war deutlich verschieden von dem Hintergrundsignal , das durch die Messung von PBS erhalten + 1% Vesikel abgereicherte FCS ohne Zusatz von MVs (3B). Um die unterschiedlichen MV Populationen im Blut zu analysieren, MVs wurden für die verschiedenen Blutzellpopulationen mit etablierten Marker gefärbt, beispielsweise für CD62P platelet-derived MVs, CD45 für Leucocyten abgeleitetes MVs, CD235a fürroten Blutzellen stamm MVs und CD62E für endothelial cell-derived MVs (Abbildung 4). Diese Charakterisierung zeigte, dass der Anteil der MV Subpopulationen unter den untersuchten Spenderblutproben unterschieden, während die Mehrheit der MVs schien in allen Proben, die durch Blutplättchen vergossen werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig1.jpg" /> Abbildung 1: Größenverteilung von MVs aus dem peripheren Blut isoliert. A, Isoliert MVs wurden durch Transmissionselektronenmikroskopie sichtbar gemacht . B, Representative Nanopartikels Verfolgungsanalyse (NTA) von MVs die Größenverteilung der Vesikel veranschaulicht. C, Die mittlere MV Größe von 10 unabhängigen Präparaten wurde von NTA (Mittelwert) gemessen. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55057/55057fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier al anzuzeigen</a>arger Version dieser Figur. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig2.jpg" /> Abbildung 2: Charakterisierung von isolierten MVs von Western Blotting. Differential-Protein-Expression auf den isolierten MVs und Exos von zwei Spendern wurde durch Western Blotting sichtbar gemacht. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55057/55057fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55057/55057fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig3.jpg" /> Abbildung 3: Analyse von MVs durch Durchflusszytometrie. A, MVs werden zunächst auf vorwärts (FSC) im Vergleich zu sidescatter (SSC) Plots Tor auf der jeweiligen MV Bevölkerung sichtbar gemacht . Anschließend werden diese MVs für das Antigen von Interesse, gekennzeichnet durch<html> unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen das Antigen gerichtet sind. B Typische FSC gegen SSC - Plots für aus dem Plasma von zwei Spendern isoliert MVs. Als Vergleich wurde eine typische Kurve für die Tumorzellen stamm MVs von A549 Lungenkrebszellen, isoliert aus Zellkulturüberstand sowie eine negative Kontrolle unter Verwendung von nur PBS + 1% bläschen abgereichertem FCS ohne MVs sind auf der rechten Seite angezeigt. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55057/55057fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55057/55057fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig4.jpg" /> Abbildung 4: Charakterisierung von isolierten MVs durch Durchflusszytometrie. MVs aus drei Spendern wurden für die Expression von etablierten Blutzellmarker (rot) durch Durchflusszytometrie charakterisiert. Die jeweiligen Isotypkontrollen sind grau dargestellt.https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55057/55057fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Sample </td><td> MVs / ml Blut [ug] </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 29.4 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 10.3 </td></tr><tr><td> #3 </td><td> 15.2 </td></tr><tr><td> # 4 </td><td> 31.1 </td></tr><tr><td> # 5 </td><td> 18.8 </td></tr><tr><td> # 6 </td><td> 22.7 </td></tr><tr><td> # 7 </td><td> 19.1 </td></tr><tr><td> # 8 </td><td> 18,7 </td></tr><tr><td> # 9 </td><td> 15,0 </td></tr><tr><td> # 10 </td><td> 11.9 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: MV Proteinausbeute aus peripheren Blutproben. </strOng&gt; Dargestellt ist die Menge der MVs pro ml peripherem Blut, das von Spendern 10 gezogen wurde. MV Ausbeuten wurden durch Lowry-Assay quantifiziert. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Sample </td><td> MVs / ml Plasma [Partikelanzahl] </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 6.42E + 09 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 2.36E + 10 </td></tr><tr><td> #3 </td><td> 1.88E + 09 </td></tr><tr><td> # 4 </td><td> 6.51E + 09 </td></tr><tr><td> # 5 </td><td> 3.48E + 09 </td></tr><tr><td> # 6 </td><td> 4.57E + 09 </td></tr><tr><td> # 7 </td><td> 2.09E + 09 </td></tr><tr><td> # 8 </td><td> 1.66E + 09 </td></tr><tr><td> # 9 </td><td> 2.54E + 09 </td></tr><tr><td> # 10 </td><td> 6.20E + 09 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: MV Teilchenausbeute von peripheren Blutproben. </strong&gt; MV wurden aus Plasmaproben von 10 Spendern und Partikelzählungen getrennt durch Nanopartikel-Tracking-Analyse bestimmt wurden. Dargestellt ist der Mittelwert von drei unabhängigen Messungen.

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Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

Isolierung und Charakterisierung von Mikrovesikeln aus peripherem Blut

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

isolation-and-characterization-of-microvesicles-from-peripheral-blood

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

22.9K Aufrufe.  University Medical Center Göttingen. Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting. 

Serie: Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolierung und Kultivierung von pulmonaler Endothelzellen aus neugeborenen Mäusen

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Forschung

Biologie

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

Isolierung und Charakterisierung von RNA-haltigen Exosomen

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

Generation of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit dem STEMCCA Lentivirusvektor

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

Isolierung von Blutgefäß abgeleiteten multi Vorläufer von menschlichen Skelettmuskel

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

Generation und Kultur der Blut Outgrowth Endothelzellen aus menschlichen peripheren Blut-

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the lymph node microenvironment in B-cell non-Hodgkin&#39;s lymphoma is analyzed. Subsets of circulating T-follicular helper cells (cTfh), the circulating memory compartment of Tfh cells in the blood, are also perturbed in disease and therefore represent potential novel predictive biomarkers. Peripheral blood-based testing is advantageous because it is relatively non-invasive and allows simple serial monitoring.This article describes a method for isolating CD4+ T-cells from human blood, and further analysis by flow-cytometry to enumerate cTfh cells and the proportions of their various subsets (cTfhPD-1-/+/hi, cTfh1,2,17 and cTfh1/17). The level of these subsets was then compared between normal subjects and patients with lymphoma. We found that the method was robust enough to obtain reliable results from routinely collected patient material. The technique we describe for the analysis can be easily adapted to cell sorting and downstream applications such as RT-PCR.

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Here, a protocol for the isolation and characterization of CD4+ T-cell subsets from human peripheral blood is described. Purified CD4+ T-cells are analyzed by flow cytometry to determine proportions of T-follicular helper cell subsets.

Isolierung von CD4+ T-Zellen und Analyse von zirkulierenden T-follikulären Helfer (cTfh) Zelle Teilmengen von peripheren Blut mittels 6-Farb Flow Cytometry

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

Isolierung, Charakterisierung und Differenzierung von kardialen Stammzellen von Erwachsenen Maus Herzen

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

Isolierung und Charakterisierung von adulten Herz-Fibroblasten und Myofibroblasten

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

Isolierung und Charakterisierung von Exosomen aus Skelettmuskelfibroblasten

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation of Human Neutrophils from Whole Blood and Buffy Coats

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells recruited at the site of inflammation via rapid extravasation through vessels. There, neutrophils perform an array of functions to kill invading pathogens and mediate immune signaling. Freshly purified neutrophils from human blood are the model of choice for study, as no cell line fully replicates PMN functions and biology. However, neutrophils are short-lived, terminally differentiated cells and are highly susceptible to activation in response to physical (temperature, centrifugation speed) and biological (endotoxin, chemo- and cytokines) stimuli. Therefore, it is crucial to follow a standardized, reliable, and fast method to obtain pure and non-activated cells. This protocol presents an updated protocol combining density gradient centrifugation, red blood cell (RBC) sedimentation, and RBC lysis to obtain high PMN purity and minimize cell activation. Furthermore, methods to assess neutrophil isolation quality, viability, and purity are also discussed.

This protocol details a method for the isolation of neutrophils from whole blood, buffy coats, or leukapheresis membranes, achieving good yield, high purity, and minimal cell activation. We utilize gradient purification, red blood cell (RBC) sedimentation, and RBC lysis to obtain a high-quality/purity neutrophil preparation.

Isolierung von menschlichen Neutrophilen aus Vollblut- und Buffycoats

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells ...