يبحث بروتوكولنا في تنوع الخميرة والعفن في التربة باستخدام عينات التربة التي تم الحصول عليها من مناطق مناخية مختلفة. وهذا يوفر نظرة ثاقبة على تنوع الخميرة البيئية ويساعد على تتبع الأنواع المسببة للأمراض. يقدم البروتوكول طريقة فعالة من حيث التكلفة وسريعة لحصاد الخمائر والعفن من التربة.
يمكن معالجة عينات التربة بالكامل للحصول على عزلات في أقل من سبعة أيام. الإعداد التجريبي المنظم جيدا ، مثل وضع العلامات على أنابيب الثقافة وإعداد الوسائط قبل يوم واحد هو المفتاح لتجنب الشعور بالإرهاق أثناء التجربة. ابدأ بإعداد مجموعة من أنابيب الثقافة المعقمة 13 ملليلتر.
عن طريق وضع علامة عليها مع معرف عينة التربة ، ثم استخدم ماصة مصلية لإضافة خمسة ملليلتر من مرق مستخلص الخميرة - الببتون - سكر العنب المكمل بالكلورامفينيكول والبينوميل في كل أنبوب. داخل خزانة السلامة الأحيائية للكائنات الحية من المستوى الثاني ، قم بنقل ما يقرب من 0.1 جرام من التربة إلى أنبوب الاستزراع المناسب باستخدام قضيب طرف طائرة خشبي معقم. قم بتغطية الأنبوب بإحكام إلى المحطة الأولى ، مما يمنع الانسكاب مع السماح بتبادل الهواء أثناء الحضانة.
بعد ذلك ، احتضن أنابيب الاستزراع في أسطوانة دوارة لمدة 24 ساعة عند درجة حرارة تعتبر مثالية لتحقيق أقصى قدر من نمو الخميرة. ثم قم بتسمية الكلورامفينيكول ومستخلص الخميرة المكملة للبينوميل بألواح أجار الببتون وسكر العنب مع معرف عينة التربة قبل نقل السوبرناتان إلى الوسط الصلب. قم بإزالة أنابيب الاستزراع من أسطوانة الأسطوانة.
ثم داخل خزانة السلامة الأحيائية للكائنات الحية من المستوى الثاني ، دوامة الأنبوب لفترة وجيزة لسحب جزيئات التربة والخلايا التي ربما استقرت في القاع مرة أخرى إلى التعليق. بعد ذلك ، انقل 100 ميكرولتر من supernatant إلى لوحة باستخدام ماصة دقيقة. استخدم موزع خلايا معقم قابل لإعادة الاستخدام لنشر السائل جيدا وبشكل متساو على سطح الأجار.
بعد السماح بوقت حضانة كاف من يومين إلى ثلاثة أيام ، افحص الألواح بحثا عن أي نمو للخميرة داخل خزانة السلامة الأحيائية للكائنات الحية من المستوى الثاني. ابحث عن الخمائر الكريمية والمستديرة وغير اللامعة التي يمكن تمييزها بسهولة عن المستعمرات البكتيرية والعفن. اختر مستعمرة واحدة تشبه الخميرة من كل طبق باستخدام عصي قضيب خشبية عادية معقمة.
انقل كل مستعمرة مختارة إلى مستخلص خميرة طازجة من ألواح أجار الببتون-ديكسترو المكملة بالكلورامفينيكول والبينوميل والخط للمستعمرات المفردة. قم بتنفيذ ثلاثة خطوط منفصلة واستخدم عصا قضيب جديدة لكل خط. بعد ذلك ، استخدم الخلايا الطازجة المطورة على صفيحة لإجراء تفاعل سلسلة بوليميراز مستعمرة.
استخدم الفواصل الداخلية المنسوخة ITS1 و ITS4 الاشعال لتضخيم جين الترميز الشريطي الفطري. قارن تسلسل الفاصل الداخلي المنسوخ الذي تم الحصول عليه لسلالات الخميرة ، وهما تسلسلان مودعان في قواعد البيانات العامة ، مثل المركز الوطني لبنك جينات معلومات التكنولوجيا الحيوية و UNITE لتحديد هوية الأنواع. أضف التربة إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 ملليلتر التي تحتوي على ملليلتر واحد من مرق سكر العنب Sabouraud واحتضنها عند 50 درجة مئوية لمدة يومين إلى أربعة أيام.
لنقل الفطريات من مرق التربة الملقح إلى ألواح أجار مستخلص الشعير ، أولا ، حدد لقاحات التربة التي لها نمو فطري مرئي أضف مرق سكر العنب Sabouraud إلى حدود الهواء. ثم استخدم عصي قضيب خشبية عادية معقمة لنقل الفطريات إلى وسط صفيحة أجار مستخلص الشعير واحتضان هذه الصفائح أجار مستخلص الشعير 37 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام. لاختيار الفطريات ، مع الخصائص المورفولوجية Aspergillus fumigatus ، حدد مستعمرات العفن التي لها نمو أخضر مميز يشبه التمايل .
داخل خزانة السلامة الأحيائية للكائنات الحية من المستوى الثاني ، قم بحصاد الكونيديا أو الفطريات عن طريق كشط السطح مرة واحدة باستخدام عصي قضيب طرف الطائرة الخشبية المعقمة أو حلقة التلقيح ونقلها إلى وسط صفيحة أجار مستخلص الشعير عن طريق التدرج على الأجار للمستعمرات الفردية. احتضن الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة يومين. باستخدام عصا تطبيق معقمة أو حلقة تلقيح ، قم بزراعة مستعمرة واحدة تم إنشاؤها على أجار مستخلص الشعير عن طريق ربط المستعمرة مرة واحدة.
انشر الجراثيم المحصودة في وسط اللوحة. قم بإعداد محلول جليسرين معقم بنسبة 30٪ لحصاد جراثيم Aspergillus fumigatus أو mycelia لتخزين الثقافة. بعد يومين من حضانة صفائح الأجار عند 37 درجة مئوية ، استنشق ملليلتر واحد من محلول الجلسرين 30٪ باستخدام ماصة وقم بتفريقه على مستعمرة Aspergillus fumigatus.
لتحديد النمط الظاهري لسلالات Aspergillus fumigatus ، قم بشفط 10 ميكرولترات من مخزون mycelial و spore لإضافة 990 ميكرولتر من الماء. دوامة هذا التعليق بوغ المخفف وتوزيع 10 ميكرولتر من التعليق على شريحة المجهر القياسية. ثم باستخدام المجهر المركب عند التكبير 400X عرض التعليق وتحديد موقع conidiophores.
قارن مورفولوجيا conidiophore الملاحظة مع مورفولوجيا Aspergillus fumigatus conidiophore. لتحديد حجم الشظايا الصحيح لكل موقع من مواقع الأقمار الصناعية الصغيرة التسعة، استخدم برنامجا قادرا على تحليل الشظايا. استرجع البيانات الخام التي تم الحصول عليها من الرحلان الكهربائي الشعري وسجل أحجام الأجزاء بناء على أكبر قمة باستخدام برنامج التحليل المجزأ.
بعد ذلك ، قم بتحويل أحجام الأجزاء إلى أرقام متكررة لكل من التسعة المنخفضة استخدم أحجام الأجزاء للأرقام المتكررة للسلالة المرجعية Af293. من 3،826 عينة تربة تم جمعها من 53 موقعا في تسعة بلدان ، تم عزل 1،473 سلالة خميرة. تم تحديد أفضل درجة حرارة حضانة لكل بلد بناء على متوسط درجة الحرارة السنوية.
وفي تحليل الفصائل النادرة لكل بلد، استخدم مؤشر شانون للتنوع كمقياس لتنوع خميرة التربة. اقتربت منحنيات الفصيل النادرة الناتجة من عدم تماثل التشبع مما يشير إلى أنه من غير المحتمل أن يؤدي أخذ عينات إضافية إلى مزيد من تنوع الخميرة. شكل النمو الفطري على الألواح مورفولوجيا خضراء متمايلة نموذجية من Aspergillus fumigatus.
يمكن أن تكون الأنواع الفطرية الأخرى المتحملة للحرارة موجودة داخل نفس عينة التربة وتنمو Aspergillus fumigatus على نفس اللوحة أو من تلقاء نفسها. كشفت بنية Aspergillus fumigatus conidiophore التي تم عرضها وتحديدها باستخدام الفحص المجهري الضوئي أن conidiophores لها كرة على مورفولوجيا العصا وأن conidiophores غير متجانسة ، حيث يتم ربط الفيليدات المرتبطة بسلاسل conidia مباشرة بالحويصلة الكروية. كشف كروماتوجرام تم إنشاؤه عن القنوات الثلاث التي تصور أطوال أجزاء Aspergillus fumigatus dinucleotide و trinucleotide و tetranucleotide short tandem repeats loci.
يمكن إنشاء شبكة امتداد دنيا عالية الجودة باستخدام البرنامج النصي R plot_poppr_msn أو imsn. التحليل التمييزي للمكونات الأساسية هو طريقة أخرى لتصور العلاقات الجينية بين السلالات. إضافة بينوميل وكلورامفينيكول إلى وسائط النمو يمنع العفن ونمو البكتيريا ، على التوالي ، ويفضل اختيار الخميرة.
يقلل الكلورامفينيكول أيضا من التخمير في الوسائط ، مما يقلل من تراكم الغاز في أنابيب الحضانة. وسيوفر إجراء الميتاجينوميات على عينات التربة معلومات إضافية عن التنوع الثقافي. سيحدد الاختبار الحساس لسلالات A.fumigatus وجود الأنماط الجينية المقاومة.
يمكن تطبيق هذا البروتوكول على أنظمة الخميرة والعفن الأخرى مع القليل من التعديل. وقد سهلت التحقيق في التنوع الثقافي لخميرة التربة وتنبؤاتها على نطاق عالمي.
