Hier wird ein Protokoll für das effiziente und genaue Screening von Tabakgenotypen auf Phytophthora nicotianae-Resistenz in Sämlingen vorgestellt. Es ist praktisch für die Präzisionszüchtung sowie für die Erforschung molekularer Mechanismen. Materialien. Erhalten Sie die Tabaksorten Beinhart1000-1, eine Auswahl von Beinhart1000 BH und Xiaohuangjin1025 XHJ aus dem National Medium-term Geneback of the Tobacco Germplasm Resource of China.
BH ist resistent, während XHJ anfällig für eine Infektion mit Phytophthora nicotianae ist. Pflanztabak-Genotypen zur Bewertung der Phytophthora nicotianae-Resistenz. Mischen Sie Tabaksamen mit Vermiculit und verteilen Sie die Samen sanft auf die sterilisierte Blumenerde.
Stellen Sie die Töpfe in die Wachstumskammer. Halten Sie eine konstante Temperatur von 25 Grad Celsius unter einer 16-stündigen hellen / achtstündigen dunklen Fotoperiode aufrecht. Bereiten Sie hydroponische Geräte mit Tabletts und Schaumstoffplatten vor.
Nachdem die Samen gekeimt sind, stechen Sie die Sämlinge aus der Blumenerde heraus. Waschen Sie die Wurzeln vorsichtig mit sterilem entionisiertem Wasser und verpflanzen Sie sie in die hydroponischen Geräte. Stellen Sie die Geräte bei 25 Grad Celsius unter einer sechsstündigen hellen / achtstündigen dunklen Fotoperiode für 24 Stunden in Klimakammern.
Bereiten Sie die Hoagland-Nährlösung vorher vor. Transplantation der Sämlinge auf hydroponische Geräte mit Hoagland-Nährlösung. Stellen Sie die Geräte zwei Wochen lang bei 25 Grad Celsius unter 16 Stunden Licht- / achtstündiger dunkler Fotoperiode in die Klimakammer.
Herstellung von Phytophthora nicotianae Zoosporensuspension. Herstellung von Haferflocken-Agar-Medium. Wiegen Sie 33 Gramm Haferflocken in eine Hohlware und fügen Sie 1.000 Milliliter steriles Wasser hinzu.
Kochen Sie auf einem elektromagnetischen Ofen. Nachdem die Haferflocken klebrig geworden sind, belasten Sie die Flüssigkeit durch ein Stück sterile Gaze. Gießen Sie die Flüssigkeit in einen 1.000 Milliliter Messzylinder und stellen Sie das Volumen mit sterilem Wasser auf 1.000 Milliliter ein.
Gießen Sie die Flüssigkeit in eine Glasreagenzflasche und fügen Sie 18 Gramm Agar hinzu. Gut schütteln und die Mischung Haferflocken-Agar-Medium bei 121 Grad Celsius für 15 Minuten autoklavieren. Lassen Sie es bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
Gießen Sie etwa 20 Milliliter sterilisiertes Haferflocken-Agar-Medium in jede Petrischale. Lassen Sie die Petrischalen vor der Myzelzucht bei Raumtemperatur gründlich abkühlen. Myzelkultivierung.
Bereiten Sie vorher Stempel und Zahnstocher mit einem Zentimeterdurchmesser vor, indem Sie sie 15 Minuten lang in einem Autoklaven bei 121 Grad Celsius autoklavieren. Stanzen Sie Löcher in Phytophthora nicotianae Myzel-Agar-Kulturen, um runde Myzelmatten herzustellen. Wählen Sie Myzelmatten aus, legen Sie die Myzelseite nach unten auf Haferflocken-Agar-Medium und inkubieren Sie das Myzel bei 25 Grad Celsius im Dunkeln für 14 Tage.
Herstellung von Phytophthora nicotianae Zoosporensuspension. Fügen Sie 0,1% Kaliumnitratlösung zu jeder Myzelkultivierung 15 Milliliter pro Gericht hinzu, gefolgt von einer Kultivierung bei vier Grad Celsius für 20 Minuten, um Sporangium zu induzieren. Halten Sie das Geschirr bei 25 Grad Celsius für 25 Minuten, um Zoosporen freizusetzen.
Sammeln Sie die Zoosporensuspension zu einem Becherglas und messen Sie die Zoosporenkonzentration mit dem Mikroskop und dem Hämozytometer. Stellen Sie die Zoosporenkonzentration mit sterilem Wasser auf eins mal 10 bis die vierte Zoospore pro Milliliter ein. Identifizierung von krankheitsresistenten Tabaksorten.
Nehmen Sie Sämlinge aus Hoagland-Nährlösung und impfen Sie sie, indem Sie die Wurzeln in 20 Milliliter Phytophthora nicotianae Zoosporensuspension in einer Petrischale von 90 Millimetern bei 25 Grad Celsius für drei Stunden im Dunkeln tauchen. Nach der Impfung die Tabaksämlinge mit 10 Milliliter sterilem Wasser in neue Petrischalen geben und die Wurzeln eintauchen. Halten Sie die Wurzeln feucht, indem Sie sie mit zwei Blättern Filterpapier abdecken.
Halten Sie das Geschirr in 25 Grad Celsius 16 Stunden hell / acht Stunden dunkle Fotoperiode. Beobachten Sie nach zwei bis drei Tagen die Schwere der Erkrankung. Für die Kontrollbehandlung legen Sie die Tabaksämlinge direkt in die Petrischalen mit 10 Milliliter sterilem Wasser, tauchen die Wurzeln ein und bedecken die Wurzeln mit zwei Blättern Filterpapier.
Bewertung der Infektion mit Phytophthora nicotianae. Bewerten Sie die Schwere der Erkrankung vier bis fünf Tage nach der Impfung. Basierend auf dem chinesischen nationalen Standard können Sie die Schwere der einzelnen Pflanzenkrankheiten auf einer Skala von null bis neun bewerten.
Grad 0 bedeutet keine Symptome an der gesamten Pflanze. Grad 1 bedeutet Stängelläsionen, die weniger als 1/3 des Stängelumfangs oder 1/3 der welken Blätter betragen. Grad 3 bedeutet Stängelläsionen zwischen 1/3 und 1/2 des Stammumfangs oder zwischen 1/3 und 1/2 der leicht welkenden Blätter.
Grad 5 bedeutet Stängelläsionen, die größer als 1/2 des Stammumfangs sind, aber nicht vollständig um den Umfang oder zwischen 1/2 und 2/3 welkender Blätter. Grad 7 bedeutet Stängelläsionen um den ganzen Stammumfang oder größer als 2/3 der welken Blätter. Grad 9 bedeutet, dass Pflanzen tot aussehen.
Berechnen Sie den Krankheitsindex mit der folgenden Formel. Die Schwere der Erkrankung wurde in sechs Grade unterteilt. Repräsentative Ergebnisse.
Vier Wochen alte Pflanzen der resistenten Sorte BH und der anfälligen Sorte XHJ wurden mit der in diesem Artikel vorgestellten Methode mit Phytophthora nicotianae herausgefordert. Drei Tage nach der Impfung bedeckten bei XHJ Stängelläsionen etwa 1/2 des Stängelumfangs und 1/2 der Blätter waren leicht verwelkt. Bei der resistenten Variante BH wurden keine Symptome beobachtet.
Vier Tage nach der Impfung traten bei XHJ Blattwelken und schwere Stängelläsionen auf, während diese Symptome in BH.At fünf Tagen nach der Impfung nicht auftraten, wurde die Schwere der einzelnen Pflanzenkrankheiten auf der Grundlage des chinesischen nationalen Standards für den Grad und die Untersuchungsmethode von Tabakkrankheiten und Insektenschädlingen erfasst und berechnet. Der mittlere Krankheitsindex von BH betrug 6,48, was die Resistenz R gemäß dem Standard zeigt, und der mittlere Krankheitsindex von XHJ betrug 76,85, was die Anfälligkeit S gemäß dem Standard zeigt. Um die Impfeffizienz zu bestätigen, wurde die relative pathogene Biomasse mittels realtime PCR quantifiziert.
Das Ergebnis der realtime PCR bestätigt die phänotypischen Beobachtungen. Fünf Nachkommen aus der BC4 F2-Population einer Kreuzung zwischen BH und XHJ, zwei Sorten mit mittlerer Resistenz, K326 und Yunyan87, wurden mittels Zoosporen-Suspensions-Impfmethode und Haferkorn-Impfmethode bewertet. Die Zoosporen-Suspensionsmethode wurde an kleinen Sämlingen und die Haferkorn-Impfmethode an erwachsenen Pflanzen durchgeführt.
Für die fünf Nachkommen aus der BC4 F2-Population reichte der Krankheitsindex von 16,49 bis 77,60 nach der Zoosporen-Suspensionsmethode und von 10,33 bis 83,08 nach der Haferkornmethode. Die Resistenzklassifikationen zwischen zwei Infektionsmethoden sind meist konsistent miteinander. Bei den beiden Zwischenresistenzsorten K326 und Yunyan87 zeigte die Bewertung in beiden Verfahren eine Resistenz.
Diese Daten veranschaulichen die Korrelation zwischen zwei Impfmethoden, obwohl sie in unterschiedlichen Wachstumsperioden an Tabak durchgeführt wurden. Das hier beschriebene Protokoll ist eine effiziente und zuverlässige Methode zur Bewertung der Resistenz von Tabak gegen Infektionen durch P.nicotianae-Keimlingsstadium. Dieses Protokoll ist sowohl für die Züchtung als auch für die molekulare Mechanismusforschung praktikabel, da die Haferkornmethode für das großflächige Resistenzscreening von erwachsenen Pflanzen anwendbar ist.
Diese beiden Methoden können komplementär verwendet werden. Danke fürs Zuschauen.
