烟草基因型对 烟碱性植物 的筛选

在这里，提出了一种方案，用于有效和准确地筛选幼苗中烟叶植物抗性的烟草基因型。它适用于精密育种以及分子机理研究。材料。从中国烟草种质资源国家中期基因库获取烟草品种Beinhart1000-1，精选的Beinhart1000 BH和Xiaohuangjin1025 XHJ。

BH 耐药，而 XHJ 易受烟门疫霉菌感染。种植烟草基因型用于烟叶植物抗性评价。将烟草种子与蛭石混合，并在灭菌的盆栽土壤上轻轻地播种。

将花盆放入生长室中。在16小时的光照/8小时的黑暗照片下保持25摄氏度的恒定温度。准备带有托盘和泡沫板的水培设备。

种子发芽后，从盆栽土壤中刺出幼苗。用无菌去离子水轻轻清洗根部，然后将其移植到水培装置中。将设备置于25摄氏度的气候室中，在6小时的光照/8小时黑暗的照片期内，持续24小时。

事先准备霍格兰营养液。将幼苗移植到带有Hoagland营养液的水培装置中。将设备置于25摄氏度的气候室中，在16小时的光照/8小时的黑暗照片期下，持续两周。

烟生植物游动孢子悬浮液的制备.燕麦片琼脂培养基的制备。将33克燕麦片称入空心器皿中，加入1， 000毫升无菌水。

在电磁炉上煮沸。燕麦片变粘后，通过一块无菌纱布过滤液体。将液体倒入1， 000毫升量筒中，并用无菌水将体积调节至1， 000毫升。

将液体倒入玻璃试剂瓶中，加入18克琼脂。摇匀并高压灭菌混合物燕麦片琼脂培养基在121摄氏度下15分钟。在室温下放置30分钟。

将约20毫升无菌的燕麦琼脂培养基倒入每个培养皿中。将培养皿置于室温下，在菌丝体培养之前彻底冷却。菌丝体栽培。

事先准备一厘米直径的冲头和牙签，方法是将它们在121摄氏度的高压灭菌器中高压灭菌15分钟。在Phytophthora nicotianae菌丝体琼脂培养物中打孔，制成圆形菌丝垫。挑选菌丝垫，将菌丝体面朝下放在燕麦片琼脂培养基上，并在黑暗中以25摄氏度孵育菌丝体14天。

烟生植物游动孢子悬浮液的制备.向每培养菌丝体中加入0.1%硝酸钾溶液，每皿15毫升，然后在4摄氏度下培养20分钟以诱导孢子囊。将菜肴保持在25摄氏度下25分钟，以释放游动孢子。

将游动孢子悬浮液收集到烧杯中，并通过显微镜和血细胞计数器测量游动孢子浓度。用无菌水将游动孢子浓度调节到每毫升10至第四个游动孢子的一倍。鉴别抗病烟草品种。

从Hoagland营养液中取出幼苗，并将根部浸入20毫升的Phytophthora nicotianae zoospore悬浮液中，在90毫米的培养皿中，在25摄氏度下在黑暗中浸泡三个小时，从而接种它们。接种后，将烟草幼苗放入新的培养皿中，加入10毫升无菌水，浸入根部。用两张滤纸盖住根部，保持根部湿润。

将盘子保持在25摄氏度的16小时光照/8小时黑暗照片期。两到三天后，观察疾病的严重程度。对于对照处理，将烟草幼苗直接放入培养皿中，加入10毫升无菌水，浸根并用两张滤纸覆盖根部。

评估烟道疫霉菌感染。接种疫苗后 4 至 5 天评估疾病严重程度。根据中国国家标准，对单个植物病害严重程度进行评分，评分范围从0到9。

0级意味着整个植物没有症状。1级是指茎秆病变小于茎围的1/3或叶枯萎的1/3。3级是指茎周长的1/3至1/2之间或1/3至1/2的叶子轻微枯萎的茎病变。

5级是指茎病变大于茎围的1/2，但不能完全围绕周长或叶片枯萎1/2至2/3之间。7级是指整个茎周长周围的茎病变或大于2/3的叶子枯萎。9级意味着植物看起来已经死了。

使用以下公式计算疾病指数。疾病严重程度分为六个等级。具有代表性的结果。

使用本文中介绍的方法，用尼古酸疫霉菌对抗性品种BH和易感品种XHJ的4周龄植物进行了挑战。在接种后三天，在XHJ中，茎病变覆盖了茎围的约1/2，叶子的1/2略有枯萎。在耐药品种BH中，未观察到任何症状。

接种后4 d，XHJ出现叶枯萎和严重茎病变，而接种后 BH.At 5 d未出现这些症状，记录并按照中国烟草病虫害分级和调查方法国家标准记录和计算单个植物病害严重程度。BH的平均疾病指数为6.48，根据标准显示耐药性R，XHJ的平均疾病指数为76.85，根据标准显示易感性为S。为了确认接种效率，通过实时荧光定量PCR对相对病原体生物量进行了定量。

实时荧光定量 PCR 的结果证实了表型观察结果。采用游动孢子悬浮接种法和燕麦粒接种法对BH与XHJ杂交BC4 F2群体的5个后代，分别对两个中间抗性品种K326和Yunyan87进行了评价。对小幼苗进行游动孢子悬浮法，对成株进行燕麦粒接种法。

BC4 F2群体5个后代的病害指数为16.49~77.60，燕麦粒法为10.33~83.08。两种感染方法之间的耐药性分类大多是相互一致的。使用两种中间电阻品种K326和Yunyan87，评估结果显示两种方法均具有抗性。

这些数据说明了尽管在不同生长期对烟草进行了两种接种方法之间的相关性。这里描述的方案是评估烟草对P.nicotianae幼苗阶段感染的抵抗力的有效和可靠的方法。该方案适用于育种和分子机理研究，因为燕麦粒法适用于成株的大规模抗性筛选。

这两种方法可以互补使用。感谢您的收看。