Dieses Protokoll kann denjenigen helfen, die an der Wassermelonengemeinschaft beteiligt sind, den Fusariumwelke-Erreger zu bewerten, und dies wird dazu beitragen, die vorhandenen Erregerpopulationen zu bestimmen und effektiv zu verwalten. Die Renntypisierung der Fusariumwelke ist komplex und zeitaufwendig zu vervollständigen, und drei praktikable Bioassay-Optionen für die Rassentypisierung ermöglichen es den Benutzern, eine Methode zu wählen, die für ihre experimentellen Bedingungen am besten geeignet ist. Alle drei Methoden helfen Pflanzenmedizinern, die potenzielle Schwere von Fusariumwelkeninfektionen im Zusammenhang mit einem bestimmten Isolat zu diagnostizieren.
Diese Informationen ermöglichen fundierte und effektive integrierte Krankheitsmanagemententscheidungen. Um mit der Vorbereitung für die Pflanzung zu beginnen, füllen Sie 8x16 Zell-Startflächen mit Pflanzmedium, während Sie auf den Boden tippen. Säen Sie dann Samen mit ihrem Scheitelpunkt, der nach oben zeigt, bis zu einer Tiefe, die ihrer Länge entspricht.
Nachdem die Samen gesät wurden, bedecken Sie das Medium, das die vergrabenen Samen enthält, mit Fullers Erde bis zu einer Tiefe von 0,3175 bis 0,635 Zentimetern und besprühen Sie dann die Ebenen, um das Medium zu dämpfen, ohne stehendes oder sammelndes Wasser zu erzeugen. Danach halten Sie das Medium feucht, indem Sie alle 180 Minuten für 20 Sekunden für fünf Tage bis zur Samenkeimung beschlagen. Nach der Keimung gießen Sie die Wohnungen einmal täglich.
Legen Sie fünf Tage nach dem Pflanzen infiltrierte Papierscheiben mit einem Durchmesser von 1 bis 1,25 Zentimetern, die das bevorzugte Fusariumoxysporum-Isolat enthalten, auf ein geklärtes V8-Saftmedium und 1/4 Stärke Kartoffeldextrose-Agar oder QPDA-Medienplatte, um sie acht Tage lang in einem Inkubator bei 28 Grad Celsius zu lagern. Übertragen Sie am achten Tag die V8- und QPDA-Platten in eine Biosicherheitskabine, bevor Sie Konidien entfernen, indem Sie einen sterilen Zellstreuer über die mittlere Oberfläche kratzen und die flüssige Konidiensuspension zu einem sterilen 50-Milliliter-Kulturröhrchen zusammenfassen. Als nächstes quantifizieren Sie die Sporenzahl und bereiten Sie die endgültige Inokulumlösung vor, indem Sie das berechnete Volumen von etwa 1 Million Sporen auf das frische sterile Kulturröhrchen übertragen und das Gesamtvolumen mit sterilem deionisiertem Wasser auf 30 Milliliter bringen.
Um sich auf die Impfung vorzubereiten, legen Sie 6x12-Zell-Styropor-Flats, die zuvor mit 10% Bleichmittel desinfiziert und gut gespült wurden, um die geimpften Pflanzen zu erhalten. Einige Stunden vor der Impfung die Pflanzen gründlich gießen. Entfernen Sie zwei Stunden nach dem Gießen die Pflänzchen aus den 8x16-Zell-Styropor-Flats und spülen Sie ihre Wurzeln ab.
Lagern Sie dann die gespülten Pflanzen vorübergehend in sauberen Behältern mit Leitungswasser bis zur Verwendung und halten Sie die Sorten voneinander getrennt. Trennen Sie die Pflänzchen später in Gruppen von sechs Individuen und bewahren Sie die Sämlingsgruppen in nasse Papierhandtücher auf einem Labortablett auf. Legen Sie 25 bis 30 Kubikzentimeter Erde in den Boden jeder Zelle der 6x12-Array-Styroporschale und verwenden Sie eine Spritzflasche, um den Boden zu benetzen, bis er sichtbar feucht ist.
Beginnen Sie mit der gesunden Kontrolle, legen Sie eine Gruppe der unbeschädigten sechs Sämlinge derselben Sorte in die 50-Milliliter-Röhrchen, die das Inokulum enthalten. Um zu impfen, wirbeln Sie die Röhren von Pflänzchen mit Wurzeln, die 30 Sekunden lang untergetaucht sind. Als nächstes legen Sie ein einzelnes Pflänzchen pro Zelle in die 6x12 Styroporplatten mit den Pflanzen der gleichen Sorte in einer Spalte der Schale.
Die Pflänzchen mit Pflanzmedium abdecken und vorsichtig ansetzen. Verwenden Sie eine Spritze, um die Pflänzchen mit 20 Millilitern Wasser zu benetzen und dabei Spritzer zu vermeiden. Wenn alle Pflänzchen wieder gepflanzt wurden, stellen Sie die Pflänzchen über Nacht in eine geschlossene dunkle Umgebung mit einer Durchschnittstemperatur von 27 Grad Celsius.
Um die Kerne zu befallen, bereiten Sie das Inokulum vor, indem Sie einen Fusarium oxysporum niveum-Stamm auf einer Platte QPDA isolieren und kultivieren, bis zu dem Punkt, an dem sein Wachstum die Hälfte der Platte bedeckt. Bereiten Sie die Kerne vor, indem Sie steriles Leitungswasser in die Ein-Liter-Glas-Erlenmeyerkolben mit 200 Gramm Kernen geben, um die Körner bis zu mindestens fünf Zentimetern vollständig abzudecken. Nachdem Sie die Kerne zwei Stunden lang bei 24 Grad Celsius in den Kolben eingeweicht haben, lassen Sie das Wasser aus dem Kolben ab und verstopfen Sie die Öffnung des Kolbens mit einem Stück Baumwollrolle, das in ein Käsetuch gewickelt ist, bevor Sie die Öffnung mit Aluminiumfolienfolie abdecken.
Sterilisieren Sie die Kolben im Autoklaven während eines Schwerkraftzyklus für eine Stunde mit fünf Minuten Trocknungszeit und lassen Sie die Kolben dann auf Raumtemperatur abkühlen. Geben Sie die Körner in einen Pilzzuchtbeutel mit einem Filter. Entfernen Sie die Luft aus dem Beutel und falten Sie dann das überschüssige Plastik um ihn herum.
Legen Sie den Beutel in einen autoklavensicheren Kunststoffbehälter und bedecken Sie den Behälter mit Aluminiumfolienfolie, dann autoklavieren Sie ihn erneut mit den gleichen Einstellungen wie zuvor. Lassen Sie den Pilz nach dem Autoklavieren drei Wochen lang auf den Kernen im Beutel inkubieren. Verwenden Sie eine sterile Korkbohrung der Größe Nummer vier, um Agarscheiben mit einem Durchmesser von sechs Millimetern aus der Zone des aktiven Wachstums auf der Kulturplatte zu schneiden.
Klappen Sie den Beutel auf, um fünf Agarscheiben mit einer strengen sterilen Technik zu platzieren. Verwenden Sie einen sterilen 50-Milliliter-Messzylinder, um zu messen und 35 Milliliter steriles Leitungswasser in den Beutel zu geben. Füllen Sie einen Plastiktopf mit einer Topfmischung und fügen Sie dann die gemessene Menge an Topfmischung in eine große Plastiktüte mit 14 Körnern befallener Kerne hinzu.
Erstellen Sie ein Luftkissen im Beutel und verschließen Sie es, bevor Sie die Kerne und den Boden mischen, indem Sie den Beutel mehrmals umkehren. Sobald dies erledigt ist, füllen Sie einen oberflächensterilisierten Topf mit der befallenen Bodenmischung. Wiederholen Sie den Vorgang für jede verbleibende Wassermelonensorte für insgesamt vier volle Töpfe mit befallenem Boden pro zu testendem Isolat.
Als nächstes säen Sie sechs Wassermelonensamen in den Topf, wobei das Spitzenende des Samens nach oben zeigt. Befeuchten Sie mit einer Sprühflasche die oberen 0,3 bis 0,6 Zentimeter Erde mit Wasser und legen Sie dann eine durchsichtige Plastikschale unter und über jeden Topf. Füllen Sie 48 Zelleinsätze mit dampfpasteurisiertem Sand, Torf, Vermiculit im Verhältnis 4: 1: 1 und tippen Sie auf die Einsätze, um den Boden zu komprimieren.
Legen Sie dann die Einsätze in Plastikschalen und säen Sie die Samen wie zuvor beschrieben. Sieben Tage vor dem Pflanzen fünf QPDA-Platten mit infiltriertem Papier impfen, um sie acht Tage lang in einem 14-Stunden-/10-Stunden-Dunkelzyklus in einem Inkubationsbereich zu lagern. Am siebten Tag zwei Quadratzentimeter große Agarstopfen in jeden 250-Milliliter-Erlenmeyerkolben mit 100 Millilitern Kartoffeldextrose geben und die Erlenmeyerkolben auf einen Tischschüttler legen.
Ernten Sie am Impftag die Sporen, indem Sie das Inokulum durch vier Schichten steriles Käsetuch filtern, um die mikrokonidielle Konzentration des Kolbens zu bestimmen. Übertragen Sie 14 Tage nach der Aussaat die Zelleinsätze mit den Sämlingen in die Schwimmbandschale und legen Sie dann die Schwimmbandschale mit den Sämlingen in eine Plastikwanne, die die sieben Liter Inokulumsuspension enthält. Nachdem Sie das Inokulum nach 15 Minuten ungestört gehalten haben, geben Sie die Zelleinsätze mit den geimpften Sämlingen in lochlose Schalen und legen Sie die lochlosen Schalen auf die Gewächshausbank, gefolgt von einer Bewässerung nach Bedarf.
Halten Sie die Beleuchtungs- und Umgebungsbedingungen wie zuvor für den Wurzeldip-Bioassay beschrieben aufrecht. Abhängig von der verwendeten Methode beginnen Sie die Bewertung mit der Beobachtung und Berechnung der Häufigkeit von Welke und Pflanzentod und nehmen Sie digitale Bilder, um den Krankheitsverlauf zu dokumentieren. Bei der modifizierten Tray-Dip-Methode zeigten die mit einem Race-2-Isolat infizierten Black Diamond- und Charleston Gray-Sorten schwere Symptome und starben.
Im Gegensatz dazu zeigte die Sorte Citrullus amarus PI Widerstand. Bei der Wurzeldip-Methode überlebten die mit einem Race-0-Isolat infizierten Sämlinge meistens, während fast alle mit einem Race-3-Isolat infizierten Sämlinge starben. In der befallenen Kernmethode haben die Sorten Sugar Baby und Charleston Gray, die in von Rasse 2 befallenen Böden gezüchtet werden, begonnen zu welken und zu sterben, während die Citrullus amarus PI-Pflanzen noch gesund erscheinen.
Denken Sie daran, Pflanzen angemessen zu säen und zu pflegen, das pathogene Isolat auf Lebensfähigkeit zu überprüfen, die einzigartigen Techniken jeder Impfmethode zu verstehen und bei der Beurteilung von Krankheitssymptomen konsistent zu sein. Mit den Ergebnissen dieser Methoden können Forscher die zugrunde liegenden genetischen Determinanten untersuchen, die die differentielle Varianzexpression zwischen den Isolaten durch Sequenzierung und vergleichende Genomanalyse steuern. Mit diesen Methoden konnten Forscher die Prävalenz verschiedener Virulenzphänotypen über verschiedene Standorte hinweg bewerten und diese Phänotypen mit beobachtbaren genetischen Elementen vergleichen.
