Dieses Zwei-Gefäß-Okklusionsmausmodell der zerebralen Ischämie-Reperfusion kann die Pathophysiologie des Schlaganfalls untersuchen. Dieses Modell wird ein stabiles Infarktvolumen von einem Großteil der Gehirn infiltrierenden Immunzellen im ischämischen Gehirn und das Verhaltensdefizit nach zerebraler Ischämie-Reperfusion induzieren. In diesem Modell wird ein Infarkt in den kortikalen Gebieten verursacht und die Sterblichkeitsrate ist niedrig.
Da das Ligation sMCAO-Reperfusionsmodell eine Kraniotomie erfordert, um die Größe des distalen MCA verfügbar zu machen, kann die Größe leicht bestätigt werden, und die Untersuchung, ob der Blutfluss im distalen MCAO während des Eingriffs gestört wird, ist einfach. Bieten Sie den Mäusen freien Zugang zu Wasser und Nahrung bis zur Operation. Autoclavdien Sie die chirurgischen Werkzeuge und verwenden Sie 70% Ethanol, um den Operationstisch und die Ausrüstung zu desinieren.
Nach der Anästhesisierung einer acht bis zwölf Wochen alten Maus, stellen Sie sicher, dass es keinen Pedalreflex hat, wenn sie mit einer festen Zehenprise getestet wird. Verwenden Sie Tierarzt Salbe, um Augentrockenheit zu verhindern, während die Maus unter Anästhesie ist. Um den Blutdruck zu überwachen, entfernen Sie zuerst das Haar, und verwenden Sie dann ein nicht-invasives Blutdrucksystem und ein physiologisches Überwachungssystem, um rektale Temperatur und arterielle Blutgase zu überwachen.
Injizieren Sie die Maus subkutan mit einem prophylaktischen Antibiotikum. Als nächstes legen Sie die Maus in die Supine-Position auf dem Heizkissen. Um die Haut freizulegen, verwenden Sie elektrische Clippers, um das Fell auf dem ventralen Halsbereich und im Bereich zwischen dem rechten Auge und dem rechten Ohr zu rasieren.
Löschen Sie das Fell aus dem Körper des Tieres mit Epilating-Creme, und desinfizieren Sie die chirurgische Stelle mit 70%Ethanol. Dann schneiden Sie einen ein Zentimeter langen Mittellinienschnitt am Hals mit einer Irisschere. Mit Iriszangen, sezieren Sie vorsichtig die gemeinsame Halsschlagader frei von den Vagusnerven, ohne körperliche Verletzungen zu verursachen, und verwenden Sie 5-0 Seidennähte, um die Arterie zu isolieren.
Als nächstes verwenden Sie Irisschere, um einen 0,3-Zentimeter-Schnitt in der Kopfhaut in der Mitte zwischen dem rechten Auge und dem rechten Ohr zu machen. Schneiden Sie mit einer Mikroschere den temporalis-Muskel, um den zygomatischen und squamosalen Knochen freizulegen. Platzieren Sie die Maus unter ein Stereo-Sezierendes Mikroskop, und verwenden Sie einen Mikrobohrer, um ein Zwei-Milliliter-Loch direkt über der rechten distalen mittleren Hirnschlagader zu erstellen.
Verwenden Sie eine 10-0-Naht, um den Stamm des rechten distalen MCA zu ligieren, und verwenden Sie einen nicht-traumatischen Aneurismus-Clip, um die rechte CCA zu verschließen. Nach der gewünschten Dauer der Ischämie, entfernen Sie die Naht und Aneurismus Clip, um den Blutfluss zum MCA und CCA wiederherzustellen. Verwenden Sie einen Nahtclip, um den Hautschnitt auf dem Kopf zu versiegeln und die Zervixhautschnitte mit chirurgischem Kleber zu versiegeln.
Buprenorphin subkutan zur Schmerzlinderung injizieren. Halten Sie die Körpertemperatur des Tieres bei 36,5 plus oder minus 0,5 Grad Celsius auf dem Heizkissen, und lassen Sie es nicht unbeaufsichtigt oder zurück an die Gesellschaft anderer Tiere, bis es vollständig aus der Anästhesie geborgen ist. Schließlich legen Sie die Maus in den Autoklavenkäfig, damit sie frei auf Wasser und Nahrung zugreifen kann, nachdem sie sich vollständig erholt hat.
Verwenden Sie Irisschere, um einen Schnitt in der Haut des Kopfes der anästhesierten und enthaupteten Maus zu machen, um den Schädel zu belichten. Dann verwenden Sie die Operationsschere, um das Vorderteil des Frontalknochens zu schneiden, und schneiden Sie mit einer Irisschere den Schädel entlang der sagittalen Naht. Mit einem Knochenrongeur, schieben Sie den frontalen und parietalen Knochen beiseite, und entlarven Sie das Gehirn.
Entfernen Sie das Gehirn, und legen Sie es in eine Maus-Gehirn-Matrix. Verwenden Sie Rasierklingen, um zwei Milliliter koronale Scheiben zu erhalten, und legen Sie sie in 50-Milliliter-Röhren gefüllt mit fünf Milliliter 2%TTC. Wenn Sie die Maus-Gehirnmatrix verwenden, um koronale Scheiben zu erhalten, sollte die Schnittgröße in verschiedenen Gehirnen gleich sein.
Schnittgröße beeinflussen die Größe von Gehirnscheiben, die auch die Berechnung der Infarktgröße beeinflussen. Die Gehirnscheiben mit 2%TTC und 1X PBS 10 Minuten bei 37 Grad Celsius färben und dann zweimal mit 10% Formalin abspülen. Fixieren Sie die Gehirnscheiben in 10%formalin bei Raumtemperatur für 24 Stunden.
Nach dem Trocknen der Gehirnscheiben auf dem Gewebepapier überschüssiges Formalin zu absorbieren, ordnen Sie sie auf einem sauberen Kunststoffschlitten, orientieren sie von rostral zu kaudal, und decken Sie sie mit einem anderen sauberen Kunststoff-Dia. Scannen Sie die Folie mit einem Scanner. Drehen Sie die Folie um, und scannen Sie die Rückseite.
Verwenden Sie die ImageJ-Software, um den Infarktbereich jedes Abschnitts zu berechnen, indem Sie zuerst die Bilddatei öffnen und den Maßstab für das Bild einrichten. Verwenden Sie dann die Freihandauswahl, um den Infarktbereich auszuwählen, und verwenden Sie die Regionen von Interesse ROI-Manager, um den Bereich von Interesse zu messen. Zusammenfassend die Infarktbereiche für jeden Abschnitt und multiplizieren Sie das Ergebnis mit der Schnittdicke, um das gesamte Infarktvolumen zu schätzen, und führen Sie dann eine statistische Analyse wie im Manuskript beschrieben durch.
Die Erhöhung der Ischämiedauer während dieses MCAO-Reperfusionsverfahrens führte zu unterschiedlichen Graden von Ischämie-induziertem Infarktvolumen und neuronalem Verlust in der Großhirnrinde des rechten MCA-Bereichs. Darüber hinaus verringerte die Ischämie die bewegungsmotorische Aktivität des Tieres um 48 Stunden nach der MCAO-Reperfusion. Nach der zerebralen Ischämie-Reperfusion infiltrierte ein Großteil der peripheren Immunzellen die ipsilaterale Hemisphäre des ischämischen Gehirns.
Darüber hinaus waren die Infarktvolumina nicht wesentlich unterschiedlich, wenn dieses Zwei-Gefäß-Okklusionsmodell mit dem MCAO-Modell verglichen wurde. Der Mikrobohrer muss bei der Herstellung eines Lochs im Schädel sorgfältig verwendet werden. Mit unangemessener Wirkung, leicht Blutungen aus dem MCA verursachen.
Die MCA sollte nicht beschädigt werden, und die Blutung muss vor und nach dem Ligationsverfahren vermieden werden. Die MCA-Okklusion und der Reperfusionsstatus können mit dem Laser Doppler überprüft werden. Diese Methode kann den Zustand des Blutflusses von MCA bestätigen.
