Diese Methode verfolgt Strukturen in Hefezellen in drei Dimensionen über viele Minuten, so dass wir die Dynamik von intrazellulären Organellen und Kompartimenten untersuchen können. 4D-Bildgebung stellt sicher, dass wir zuverlässige Schlussfolgerungen über die intrazelluläre Dynamik ziehen können, insbesondere für Strukturen oder Marker, die vorübergehend sein können. Demonstriert wird das Verfahren von Natalie Johnson, einer Postdoc aus meinem Labor.
Beginnen Sie mit dem Anbau einer Übernachtkultur des Hefestamms von Interesse in fünf Milliliter nicht fluoreszierenden synthetischen definiert, oder NSD, medium, in einem 15 Milliliter verwirrten Kolben mit guter Belüftung, bei 23 Grad Celsius. Drei bis vier Stunden vor der Analyse verdünnen Sie die logarithmische Phasenhefekultur in frischem NSD-Medium, so dass die endgültige optische Dichte bei 600 Nanometern oder OD600 zum Zeitpunkt der Bildgebung 0,5 bis 0,8 betragen wird. Mindestens eine Stunde, bevor die Kultur fertig ist, zentrifugieren Sie ein Aliquot von zwei Milligramm pro Milliliter Concanavalin Eine Lösung für fünf Minuten bei voller Geschwindigkeit, um partikelförmige Partikel zu pellet, und fügen Sie 250 Mikroliter des Überstandes in eine saubere 35 Millimeter Glasbodenmikroskopieschale.
Nach 15 Minuten die Schale zwei- bis dreimal mit zwei Millilitern destilliertem Wasser pro Wäsche waschen und 250 Mikroliter der Hefekultur nach dem Trocknen in die Concanavalin A-beschichtete Schale geben. Warten Sie 10 Minuten, bis die Zellen haften, bevor Sie die Schale zwei bis drei Mal später mit zwei Millilitern frischem NSD-Medium sanft waschen. Dann bedecken Sie die Zellen mit zwei Millilitern frischen NSD.
Um die Hefezellen abzubilden, wählen Sie eine 63-fache Öl-Tauchlinse mit einer numerischen Blende von mindestens 1,4 auf einem konfokalen Lichtmikroskop aus. Hier kann anstelle einer 63X Objektivlinse auch ein 100-Fachobjektiv verwendet werden. Dann legen Sie die Schale auf die Objektivlinse, mit Tauchöl gefleckt.
Wählen Sie im Dropdown-Menü der Registerkarte Erfassungsmodus xyzt aus. Formatieren Sie unter der Registerkarte XY die Rahmengröße auf 256 Breite und 128 Höhe. Verwenden Sie die maximale Scangeschwindigkeit, die in der Regel in der Größenordnung von acht Kilohertz liegt.
Aktivieren Sie das bidirektionale X-Scannen, sofern er verfügbar ist, und passen Sie den Zoomfaktor auf neun an, was zu einer Pixelgröße von etwa 80 Nanometern führt. Wenn ein 100-Fach-Objektiv verwendet wird, passen Sie den Zoomfaktor entsprechend an, um eine Pixelgröße von etwa 80 Nanometern beizubehalten. Legen Sie dann die Zeilenakkumulation auf vier oder sechs fest.
Stellen Sie das Loch auf 1.2 Airy-Einheiten ein, und schalten Sie den Weißlichtlaser ein, falls verfügbar. Legen Sie dann die Anregungswellenlänge und die prozentuale Laserleistung für jeden Fluoreszenzkanal fest. Aktivieren Sie, falls verfügbar, die Verwendung des Photonenzählmodus unter der Registerkarte Konfiguration, indem Sie die maximale Integrationszeit deaktivieren.
Weisen Sie für jeden Fluoreszenzkanal einen Hochempfindlichkeitsdetektor zu, legen Sie den Emissionswellenlängenbereich fest und aktivieren Sie den Photonenzählmodus, sofern verfügbar. Stellen Sie das Zeitgating-Fenster für jeden Fluoreszenzkanal auf 0,6 bis 10 Nanosekunden, um zu vermeiden, dass reflektiertes Licht von der Glasschale erfasst wird. Aktivieren Sie als Nächstes die Lichtfeldabbildung, und wählen Sie einen Detektor mit geringer Empfindlichkeit für die Datenerfassung aus.
Schalten Sie den Live-Bildgebungsmodus ein, und schalten Sie die Verstärkung im hellen Feldkanal aus, bis die Zellen deutlich sichtbar sind. Wenn Sie sich im Photonenzählmodus befinden, ändern Sie den Bereich der Grauwerte von manuell in automatisch, um das Fluoreszenzsignal anzuzeigen. Legen Sie den Z-Stack so fest, dass das gesamte Volumen der Hefezellen ababgebildet wird, und geben Sie die Richtung der Bildgebung so an, dass sich nach unten in Richtung des Abdeckungsschlupfes bewegt.
Stellen Sie das Z-Schritt-Intervall auf 0,25 bis 0,35 Mikrometer ein, um etwa 20 bis 25 optische Abschnitte pro Z-Stack zu erhalten, und schalten Sie den Galvo-Flow ein, sofern er verfügbar ist. Legen Sie für einen typischen Film das Zeitintervall zwischen Z-Stacks auf zwei Sekunden fest, und legen Sie die Filmdauer auf fünf bis zehn Minuten fest. Speichern Sie dann den Film als LIF-Datei.
Starten Sie für die Filmdekonvolution ein entsprechendes Dekonvolution-Softwareprogramm, das den klassischen Algorithmus zur Schätzung der maximalen Wahrscheinlichkeit verwendet, und öffnen Sie die Datenreihe. Wählen Sie den Dekonvolution-Assistenten und den Parameter-Editor aus, um zu bestätigen, dass die Bildparameter erkannt und korrekt angezeigt werden. Ändern Sie den Wert des einbettenden mittleren Brechungsindex in 1,4, um das Hefezytoplasma anzunähern.
Verwenden Sie dann den Editor, um die Position des Deckzettels zu schätzen. Wählen Sie Alle überprüft festlegen aus, und klicken Sie auf Akzeptieren, und wählen Sie Den Assistenten eingeben aus. Klicken Sie auf den nächsten Pfeil, um die Auswahl der Punktstreufunktion und die Vorverarbeitungsphasen zu umgehen, und fahren Sie durch den Dekonvolution-Assistenten für jeden Fluoreszenzkanal.
Wählen Sie die logarithmische vertikale Mapping-Funktion berechnen aus, und überprüfen Sie das Profil für die Rohdatenfluoreszenzintensität. Legen Sie das Handbuch als Modus für die Hintergrundschätzung fest, geben Sie einen Hintergrundwert ein, und klicken Sie auf Akzeptieren. Lassen Sie den maximalen Iterationswert bei 40 und geben Sie ein geschätztes Signal-Rausch-Verhältnis ein.
Deaktivieren Sie dann die Bleichkorrektur, und klicken Sie auf Deconvolve. Wählen Sie Akzeptieren zum nächsten Kanal im Dekonvolution-Ergebnisfenster, wenn das Rauschen ausreichend entfernt wird, ohne die echte Fluoreszenz aus den dim Strukturen zu entfernen. Sobald alle fluoreszierenden Kanäle zufriedenstellend dekonvolviert wurden, klicken Sie auf Alle fertig und ordnen Sie den roten Kanal zuerst an, gefolgt von den grünen, blauen und hellen Feldkanälen, für die nachfolgende Bearbeitung in ImageJ.
Speichern Sie dann die Bildsequenz als Acht-Bit-TIF-Datei und wählen Sie eine Datei pro Kanal und Kontrastdehnung als Konvertierungsmodus aus. Importieren Sie zur Bleichkorrektur die dekonvolveden Bildsequenzen in ImageJ, und klicken Sie auf Image, Hyperstacks und Stack to Hyperstack, um die Bilder in einen Hyperstack zu konvertieren. Wählen Sie xyzct aus dem Dropdown-Menü aus, und geben Sie die Anzahl der Kanäle, Z-Stack-Slices und Zeitrahmen ein.
Um die Fluoreszenzkanäle für das Photobleichen zu korrigieren, wählen Sie Bild, Farbe, Split-Kanäle und für fluoreszierende Kanäle Plugins, EMBLtools, Bleach Correction und Exponential Fit aus. Wählen Sie dann Bild-, Farb- und Mergekanäle aus, um die hellen Feld- und Bleichfluoreszenzkanäle zu einem Hyperstack zusammenzuführen und den dekonvolveden und bleichkorrigierten Hyperstack für die nachfolgende Filmgenerierung und -bearbeitung als acht Bit TIF-Datei zu speichern. Um den dekonvolved und bleich korrigierten Datensatz in eine skalierte Montage zu konvertieren, wählen Sie Plugins, IJ_Plugins und Make Montage Series aus, und wählen Sie den entsprechenden Acht-Bit-Hyperstack aus.
Klicken Sie auf Öffnen und OK, um zu akzeptieren, dass alle Slices zum Erstellen der Montage verwendet werden, und klicken Sie erneut auf OK, um den vorgeschlagenen Skalierungsfaktorwert zu akzeptieren. Speichern Sie die Originalmontage als acht Bit TIF-Datei und wählen Sie Plugins, IJ_Plugins, Montage Series to Hyperstack und OK, um einen 4D-Hyperstack aus der ursprünglichen Montage zu erstellen, der alle Zeitrahmen enthält. Um den ursprünglichen durchschnittlich projizierten Film zu generieren, wählen Sie zunächst Plugins, IJ_Plugins, Project Hyperstack und OK aus, um die ZProjection-Standardparameter zu akzeptieren.
Speichern Sie den durchschnittlichprojizierten Film als achtbitige TIF-Datei, und überprüfen Sie den Film, um einzelne Strukturen zu identifizieren, die für die Dauer ihrer Beschriftungsperiode nachverfolgt werden können. Das Identifizieren einer Struktur, die für die Dauer des Films zuverlässig nachverfolgt werden kann, und das Isolieren dieser Struktur für die Analyse sind die wichtigsten Schritte des Verfahrens. Dann folgen Sie den Anweisungen im Plugin-Benutzerhandbuch, um Strukturen von Interesse zu isolieren, indem Sie die Montage bearbeiten.
Erstellen Sie einen 4D-Hyperstack aus der bearbeiteten Montage für den Zeitraum einschließlich der Strukturen von Interesse, und speichern Sie den bearbeiteten Hyperstack. Um die Fluoreszenzintensität im Zeitverlauf für die isolierte Struktur im bearbeiteten 4D-Hyperstack zu quantifizieren, wählen Sie Plugins, IJ_Plugins und Bearbeiteten Film analysieren aus, geben Sie das Zeitintervall zwischen Z-Stacks ein, und klicken Sie auf OK. Um einen letzten Film der isolierten Struktur zu erstellen, wählen Sie Plugins, IJ_Plugins und Project Hyperstack aus, geben Sie die eingeschlossenen Z-Stack-Slices an, wählen Sie Die mittlere Intensität als Projektionstyp aus, und klicken Sie auf OK. Um einen 4D-Hyperstack mit den Originaldaten über die bearbeiteten Daten zu erstellen, wählen Sie Plugins, IJ_Plugins, Merge Two Hyperstacks und Place first above second aus. Um einen Film aus dem 4D-Hyperstack mit den Originaldaten über die bearbeiteten Daten zu generieren, wählen Sie Plugins, IJ_Plugins und Project Hyperstack aus, geben Sie die eingeschlossenen Z-Stack-Slices an, wählen Sie Als Projektionstyp die durchschnittliche Intensität aus, und klicken Sie auf OK. Hier kann der erste Frame einer Z-Stack-Projektion von Rohdaten mit den gleichen dekonvolveden und bleichkorrigierten Daten verglichen werden.
Diese Rahmen aus dem gleichen dekonvolved und bleich korrigierten Film zeigen zwei Cistern, die analysiert wurden, die zuerst mit dem grünen Vanadate-Resistenz-Glykosylierungsprotein 4 oder Vrg4-Marker und später mit dem roten Secretory 7 oder Sec7 GenTransport Protein Marker etikettieren. Diese Montage, die aus einem dekonvolveden und bleichkorrigierten Hyperstack erstellt wurde, zeigt alle optischen Abschnitte zu einem einzigen Zeitpunkt vor und nach der Bearbeitung, um die Isolierung des Signals von einer der gewählten Cisternae zu ermöglichen. In dieser Abbildung werden mehrere Bilder aus dem letzten Film der projizierten Z-Stacks mit den Originalprojektionen am oberen Rand der Figur und bearbeiteten Projektionen unten gezeigt.
Die Quantifizierung der grünen und roten Fluoreszenzsignale der gewählten Golgi-Zisternen zeigt, dass der grüne Vrg4-Marker etwa 80 Sekunden ankommt und anhält, danach kommt der rote Sec7-Marker an und bleibt etwa 60 Sekunden lang bestehen, mit einer kurzen Überlappung zwischen den beiden Markern. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, Strukturen zu identifizieren, die während ihres gesamten Lebens eindeutig nachverfolgt werden können. Die gleiche Art der Analyse kann nach einer Mutation oder einer anderen Art spezifischer Störung durchgeführt werden.
Diese Technik hat den Weg für das Studium des dynamischen Verhaltens von Golgi-Zisternen und endoplasmatischen Retikulum-Ausgangsstellen unter Verwendung von Hefe als Modellsystem geebnet.
